本发明属于植物细胞培养基技术领域，具体涉及一种促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基及其制备方法。
背景技术：
紫草入药，最早见于《神农本草经》，《本草纲目》引陶弘景曰“今出襄阳”，可见中国古代一直以紫草为药用。1990年以后，《中华人民共和国药典》中收录了紫草科3种植物，新疆紫草便是其中一种，且品质最佳。新疆紫草为紫草科多年生草本植物，有平伏状粗毛，根粗大，圆锥形，多扭曲，干时紫色。花期6～8月，果期8～9月。喜凉爽湿润气候，耐寒，怕高温，多生于山地、草丛和干燥的石质山坡、山谷及灌木林下，中国药用紫草中70％的原料来自新疆紫草。新疆紫草的有效药用成分是紫草素及其衍生物，这些成分不但具有抗菌、抗炎、抗癌等多种药理作用，而且还作为天然色素广泛用于医药、化妆品和印染工业中。
中国专利CN1117525B采用新疆紫草幼苗的不同器官作外植体诱导愈伤组织并获细胞系，建立了细胞固体二步培养生产工艺流程，包括AG-7生长培养基与AP-5生产培养基。中国专利申请CN101289651A提供了一种新疆紫草细胞系和细胞培养生产新疆紫草紫草素的方法，该方法采用液-固培养相结合，通过液体培养制种，固体培养得到培养物，从中选择综合性状好的留种用于液体培养，如此反复。
目前，市场上的新疆紫草基本上来源于野生，在利益的驱动下，药农一哄而上，年复一年滥采滥挖，导致野生紫草产量连年下滑，而市场需求却有增无减，缺口继续加大。因此，通过细胞的大规模培养直接生产紫草素来满足药用需求是比较有潜力的途径。但是，细胞培养过程中由于药用成分含量低而导致成本过高的问题严重制约着产业化进程。因此，研发出一种促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基是必要的。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基及其制备方法。本发明提供的促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基，能提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，成分明确且价格较低，大大缩短了新疆紫草细胞的生产周期，紫草素产量高，有利于日常应用、广泛推广及产业化培养。
本发明的技术方案是：
一种促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：硫酸锌0.08-0.15μM，盐酸吡哆醇8-13mg/L，胸腺嘧啶5-8mg/L，泛酸钙1-5mg/L，谷胱甘肽10-16μg/L，活性炭0.06-0.14g/L，吲哚乙酸7-12mg/L，甘露醇20-40mg/L，大豆苷50-75μg/L，柠檬酸三铵10-50mg/L和木糖醇20-40g/L。
一种促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基，优选的方案是，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：硫酸锌0.12μM，盐酸吡哆醇11mg/L，胸腺嘧啶7mg/L，泛酸钙3mg/L，谷胱甘肽12μg/L，活性炭0.08g/L，吲哚乙酸8mg/L，甘露醇27mg/L，大豆苷62μg/L，柠檬酸三铵40mg/L和木糖醇25g/L。
优选地，所述基础培养基为B5培养基或White培养基。
另外，本发明还提供了所述促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基的制备方法，步骤如下：
S1向基础培养基中加入盐酸吡哆醇、胸腺嘧啶、泛酸钙、吲哚乙酸、柠檬酸三铵和木糖醇，搅拌30分钟，加入硫酸锌、谷胱甘肽、活性炭、甘露醇和大豆苷，继续搅拌20分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.5-5.8，灭菌温度为115-122℃，灭菌时间为25-30分钟，即得。
优选地，所述步骤S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.6。
优选地，所述步骤S2灭菌温度为117℃。
优选地，所述步骤S2灭菌时间为28分钟。
本发明所用主要原料的作用：
盐酸吡哆醇：盐酸吡哆醇，别名维生素B6。白色或类白色的结晶或结晶性粉末；无臭，味酸苦。分子式：C8H11NO3·HCl；C8H12ClNO3，分子量205.64。盐酸吡哆醇可作为维生素强化剂。本品是机体内很多酶如转氨基酶、脱羧酶、消旋酶、脱氢酶、合成酶和羟化酶等的辅酶，且可帮助糖类和蛋白质的分解、利用。缺乏时有类似烟酸的缺乏症。此外，盐酸吡哆醇还参与色氨酸将烟酸转化为5-羟色胺的反应。并可刺激白细胞的生长，是形成血红蛋白所需要的物质。
胸腺嘧啶：胸腺嘧啶自胸腺中分离得到的一种嘧啶碱。分子式：C5H6N2O2，分子量：126.11，熔点：316℃。胸腺嘧啶是遗传物质的重要组成部分，是合成抗艾滋病药物AZT、DDT及相关药物的关键中间体，也是合成抗肿瘤，抗病毒药物β-胸苷的起始原料。
谷胱甘肽：谷胱甘肽(分子式C10H17O6N3S)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的的三肽，具有抗氧化作用和解毒作用。谷胱甘肽在生命体内的作用机理和四大生理功能：1、清除人体细胞内的自由基，是细胞内最主要的抗氧化剂。2、与人体内的有毒物质结合并排出体外，是人体内重要的解毒剂。3、激活和保护免疫细胞，增强人体免疫功能，是重要的免疫增强剂。4、影响皮肤细胞酪氨酸酶活性、抑制黑色素生成，防止皮肤色斑的产生。
活性炭：活性炭可以降低组织培养物的有害代谢物浓度，对细胞生长有利。活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉末结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糖醛及激素等。
吲哚乙酸：CAS号：87-51-4，分子式：C10H9NO2，分子量：175.18。吲哚乙酸是一种有机物。纯品是无色叶状晶体或结晶性粉末。遇光后变成玫瑰色。熔点165-166℃。易溶于无水乙醇、醋酸乙酯、二氯乙烷，可溶于乙醚和丙酮。不溶于苯、甲苯、汽油及氯仿。用途：用作植物生长刺激素及分析试剂。
甘露醇：甘露醇的分子式：C6H14O6，分子量：182.17，CAS号：69-65-8。甘露醇是一种己六醇，因溶解时吸热，有甜味，对口腔有舒服感，故更广泛用于醒酒药、口中清凉剂等咀嚼片的制造，其颗粒型专作直接压片的赋形剂。甘露醇是一种高渗性的组织脱水剂，临床上广泛应用于治疗脑水肿，预防急性肾衰，治疗青光眼，加速毒物及药物从肾脏的排泄。
大豆苷：CAS号：552-66-9，分子式：C21H20O9，分子量：416.38。药理作用：降低血压影响，改善脑循环，扩张冠脉，改善心肌功能，解热作用，松弛平滑肌的作用。
本发明提供的促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，添加的添加剂包括硫酸锌、盐酸吡哆醇、胸腺嘧啶、泛酸钙和大豆苷等。在本发明的各种培养基的成分中，基础培养基能够提供新疆紫草的生存和最低的生理活动。在本发明培养基中使用的盐酸吡哆醇和泛酸钙，能够提供新疆紫草细胞所需营养素，促进新疆紫草细胞的发育。在本发明培养基中使用的胸腺嘧啶，对新疆紫草细胞的分裂起促进作用。在本发明培养基中使用的谷胱甘肽，能够诱导细胞的增殖，避免过氧化物对新疆紫草细胞的损害。在本发明培养基中使用的活性炭，能够吸附新疆紫草细胞生长中代谢的有毒物质，但是，活性炭在吸附培养基中的有害物质的同时，也能吸附生长调节物质和其它培养基中的成分，发明人在使用活性炭时，考虑到活性炭的两面性，经大量实验，得到合适的活性炭与培养基中生长调节物质的配比，使其都能更好的发挥作用。在本发明培养基中使用的吲哚乙酸，能够调节新疆紫草细胞的生长。在本发明培养基中使用的甘露醇，能够调节培养基的渗透压，维持细胞膜内外渗透压平衡，提高渗透压，防止水分渗入细胞内部，造成细胞破裂，另外，本发明培养基中甘露醇还与木糖醇一起，起到提供碳源的作用。发明人意外发现，在本发明培养基中使用大豆苷，能够与其它物质相互作用，促进细胞增殖。本发明促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基搭配合理，各成分间协同作用，能提供新疆紫草细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，促进细胞的增殖，大大缩短了新疆紫草细胞的生产周期，能够促进新疆紫草细胞合成紫草素，紫草素产量高。
与现有技术相比，本发明提供的促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基具有以下优势：
(1)本发明提供的促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基，成分明确且价格较低，有利于日常应用、广泛推广及产业化培养。
(2)本发明提供的促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基，不占耕地、不破坏新疆紫草野生资源，保护了生态环境，解决了新疆紫草资源短缺的问题。
(3)本发明提供的促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基，大大缩短了新疆紫草细胞的生产周期，能够促进新疆紫草细胞合成紫草素，紫草素产量高。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明B5培养基可购自青岛海博生物技术有限公司；White培养基可购自青岛海博生物技术有限公司；大豆苷可购自南京广润生物制品有限公司。
实施例1、一种促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基
所述促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：硫酸锌0.08μM，盐酸吡哆醇8mg/L，胸腺嘧啶5mg/L，泛酸钙1mg/L，谷胱甘肽10μg/L，活性炭0.06g/L，吲哚乙酸7mg/L，甘露醇20mg/L，大豆苷50μg/L，柠檬酸三铵10mg/L和木糖醇20g/L。
所述基础培养基为B5培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入盐酸吡哆醇、胸腺嘧啶、泛酸钙、吲哚乙酸、柠檬酸三铵和木糖醇，搅拌30分钟，加入硫酸锌、谷胱甘肽、活性炭、甘露醇和大豆苷，继续搅拌20分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.5，灭菌温度为115℃，灭菌时间为25分钟，即得。
实施例2、一种促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基
所述促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：硫酸锌0.15μM，盐酸吡哆醇13mg/L，胸腺嘧啶8mg/L，泛酸钙5mg/L，谷胱甘肽16μg/L，活性炭0.14g/L，吲哚乙酸12mg/L，甘露醇40mg/L，大豆苷75μg/L，柠檬酸三铵50mg/L和木糖醇40g/L。
所述基础培养基为White培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入盐酸吡哆醇、胸腺嘧啶、泛酸钙、吲哚乙酸、柠檬酸三铵和木糖醇，搅拌30分钟，加入硫酸锌、谷胱甘肽、活性炭、甘露醇和大豆苷，继续搅拌20分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.8，灭菌温度为122℃，灭菌时间为30分钟，即得。
实施例3、一种促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基
所述促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：硫酸锌0.12μM，盐酸吡哆醇11mg/L，胸腺嘧啶7mg/L，泛酸钙3mg/L，谷胱甘肽12μg/L，活性炭0.08g/L，吲哚乙酸8mg/L，甘露醇27mg/L，大豆苷62μg/L，柠檬酸三铵40mg/L和木糖醇25g/L。
所述基础培养基为B5培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入盐酸吡哆醇、胸腺嘧啶、泛酸钙、吲哚乙酸、柠檬酸三铵和木糖醇，搅拌30分钟，加入硫酸锌、谷胱甘肽、活性炭、甘露醇和大豆苷，继续搅拌20分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.6，灭菌温度为117℃，灭菌时间为28分钟，即得。
对比例1、一种促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基
所述促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：硫酸锌0.12μM，盐酸吡哆醇11mg/L，胸腺嘧啶7mg/L，泛酸钙3mg/L，谷胱甘肽12μg/L，活性炭0.044g/L，吲哚乙酸0.044g/L，甘露醇27mg/L，大豆苷62μg/L，柠檬酸三铵40mg/L和木糖醇25g/L。
所述基础培养基为B5培养基。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将活性炭和吲哚乙酸的终浓度均调整为0.044g/L。
对比例2、一种促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基
所述促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：硫酸锌0.12μM，盐酸吡哆醇11mg/L，胸腺嘧啶7mg/L，泛酸钙3mg/L，谷胱甘肽74μg/L，活性炭0.08g/L，吲哚乙酸8mg/L，大豆苷62μg/L，柠檬酸三铵40mg/L和木糖醇25.027g/L。
所述基础培养基为B5培养基。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，没有添加甘露醇，增加木糖醇的浓度。
对比例3、一种促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基
所述促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：硫酸锌0.12μM，盐酸吡哆醇11mg/L，胸腺嘧啶7mg/L，泛酸钙3mg/L，谷胱甘肽74μg/L，活性炭0.08g/L，吲哚乙酸8mg/L，甘露醇27mg/L，葛根素62μg/L，柠檬酸三铵40mg/L和木糖醇25g/L。
所述基础培养基为B5培养基。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将大豆苷替换为葛根素。
试验例一、本发明促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基对新疆紫草细胞的培养效果
1、试验对象：本发明实施例1-3所得促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基，以及对比例1-3所得促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基。
2、试验方法
2.1、细胞的培养
将新疆紫草细胞按5g鲜重/瓶的量分别接种于实施例1-3所得培养基，以及对比例1-3所得培养基，置于摇床中进行悬浮培养，在25℃温度下培养，摇床转速120r/min，暗培养，细胞培养14天后，测定细胞生物量和紫草素含量。
2.2、细胞生物量的测定
取新疆紫草细胞悬浮培养液，用滤纸过滤，将细胞置于烘箱中，55℃烘48h至恒重，称得其干重，为细胞生物量。
2.3、紫草素含量的测定
取培养的新疆紫草细胞悬浮培养液，3600r/min离心15min，回收的沉淀物为鲜细胞。将鲜细胞转移至三角瓶中，加入石油醚，用超声细胞破碎仪进行破碎，然后在室温下振荡(120r/min)提取24h，提取液用于测定细胞中紫草素的含量。采用分光光度法测定新疆紫草细胞中的紫草素含量。
3、实验结果
不同培养基所得细胞生物量如表1所示，不同培养基所得新疆紫草细胞中紫草素产量如表2所示。
表1：不同培养基所得细胞生物量比较
由表1可以看出，在相同的培养时间内，生长在本发明实施例1-3制备的培养基中所得细胞生物量，明显高于生长在对比例1-3制备的培养基中所得细胞生物量。这说明，本发明实施例1-3制备的促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基，更有利于新疆紫草细胞的生长增殖。
表2：不同培养基所得新疆紫草细胞中紫草素产量的比较
由表2可以看出，在相同的培养时间内，生长在本发明实施例1-3制备的培养基中新疆紫草细胞的紫草素产量，明显高于生长在对比例1-3制备的培养基中新疆紫草细胞的紫草素产量。这说明，本发明实施例1-3制备的促进新疆紫草细胞合成紫草素的培养基更有利于紫草素的合成，提高紫草素的产量。