本发明涉及植物细胞培养
技术领域：
，进一步涉及植物细胞规模化培养过程中次级代谢产物的诱导表达，具体涉及一种规模化培养天山雪莲细胞高产黄酮的调控方法。
背景技术：
：植物细胞培养技术是以离体植物细胞或原生质体为对象，以细胞量扩增和目标代谢产物累积为目的的培养工艺。对于以获得特定代谢产物为目的的细胞培养而言，其主要工艺环节不仅在于细胞量的扩增，同时，目标代谢产物的诱导合成对培养效益更为重要。在植物细胞的培养过程中，培养条件和营养条件是影响产量的最重要因素，其中培养条件是指温度、溶氧、光照、pH等环境条件的控制，而营养条件主要指植物细胞的培养基。天山雪莲又名雪莲、天山总苞雪莲，为菊科凤毛菊属植物，是我国高山地区的一种稀有名贵的中药材，含黄酮、生物碱、多糖等多种有效成分，具有活血通经，散寒除湿，强筋壮阳等功效，多用于风湿性关节炎、经血不调、阳痿、跌打损伤的治疗。但雪莲生长环境特异，生长周期长，人类长期的盲目采挖，已使雪莲的自然资源近于枯竭，通过悬浮培养来生产雪莲的有效成分，既可保护野生资源，又可以满足日益增长的中药需求。然而雪莲细胞培养条件苛刻，对营养要求高，现有技术的离体悬浮培养技术尽管取得了一定的进展但目标产物雪莲黄酮的产量始终处于较低水平。在雪莲细胞培养的研究中，如何提高培养物中的主要有效药用成分黄酮的含量和质量，扩大培养规模，最终实现工业化生产，是这一领域的研究重点。国内外研究者在雪莲愈伤组织培养、细胞悬浮培养、发酵培养等方面做了大量工作，然而目前雪莲细胞的培养效果以及总黄酮的产量仍有待提升。天山雪莲难以人工种植，资源受到迫害，供不应求；植物细胞培养方面细胞株不稳定，次级代谢产物产量低，大规模生产难。目前在天山雪莲大规模技术培养方面报道较少，只涉及到10L左右的反应器，且无两阶段培养技术在雪莲细胞生产黄酮方面的应用，调控技术应用少等，致使现在缺少一种稳定高产且快速的大规模培养天山雪莲细胞的调控工艺。技术实现要素：本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种规模化培养天山雪莲细胞高产黄酮的调控方法，以解决现有技术的天山雪莲细胞培养方法所得的黄酮产量较低的技术问题。本发明要解决的另一技术问题是现有技术的天山雪莲细胞培养方法难以规模化放大。为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：一种规模化培养天山雪莲细胞高产黄酮的调控方法，包括以下步骤：1)取天山雪莲细胞接种于液体生长培养基中，以温度20～25℃，每天光照14～18h、黑暗6～10h，光照强度1000～3000lux的条件培养，每7～10天传代一次，直至培养液中细胞鲜重达初始细胞接种量3～5倍；2)取步骤1)培养所得的天山雪莲细胞，以鲜重30-80g/L的接种量接种于液体生长培养基中，以温度20～25℃，100～130rpm的转速摇床培养5～8天；从产物中取天山雪莲细胞，以鲜重150～400g/L的接种量接种于液体生产培养基中，以24h全光照，光照强度2000～3000lux，100～130rpm的转速摇床培养1～4天；3)取步骤2)培养所得的天山雪莲细胞，以鲜重50～100g/L的接种量接种于液体生长培养基中，以0.01～1m3/h的通气速率培养5～8天；从产物中取天山雪莲细胞，以鲜重150～300g/L的接种量接种于液体生产培养基中，以24h全光照，光照强度2000～3000lux，0.01～1m3/h的通气速率培养1～4天；其中所述生长培养基是含有0.4～0.6mg/L植物激素6-BA、0.8～1.2mg/L植物激素NAA、20～40g/l蔗糖的MS培养基；所述生产培养基是含有0.4～0.6mg/L植物激素6-BA、0.8～1.2mg/L植物激素NAA、0.1～100μmol/l苯丙氨酸、0.5～10μmol/l冠菌素、15～25g/l蔗糖的MS培养基。作为优选，步骤1)中用于接种的天山雪莲细胞是通过以下方法获得的：取天然雪莲试管苗进行外植体诱导，获得愈伤组织，对固体细胞利用Ser137γ射线、uv-B诱变，而后0-8℃处理，再利用含蔗糖50-100g/L的MS固体培养基，以温度20～25℃，每天光照14～18h、黑暗6～10h，光照强度1000～3000lux的条件反复培养，筛选获得天然雪莲细胞系。作为优选，步骤1)中所述反复培养的过程中，每两周继代一次。作为优选，步骤1)中用于接种的天山雪莲细胞，其黄酮产量不低于细胞总干重的7％。作为优选，步骤2)所得产物中黄酮产量不低于细胞总干重的13％。作为优选，步骤3)中利用生长培养基所进行的培养是在公开号为CN103224882A或CN204385208U的中国专利文献所披露的生物反应器中进行的，培养过程中反应器的振频为1～20次/min。作为优选，步骤3)中利用生产培养基所进行的培养是在公开号为CN103224882A或CN204385208U的中国专利文献所披露的生物反应器中进行的，培养过程中反应器的振频为5-20次/min。作为优选，步骤3)所得产物中黄酮产量不低于细胞总干重的11％。作为优选，步骤2)中所述生长培养基盛装于100mL三角瓶中；步骤2)中所述生产培养基盛装于100mL三角瓶中。作为优选，步骤2)中所述从产物中取天山雪莲细胞，是50～150目的筛网过滤除掉培养液得到的。作为优选，步骤3)中对天山雪莲细胞的培养是在20～2000L容积的生物反应器中进行的。本发明提供了一种规模化培养天山雪莲细胞高产黄酮的调控方法，该技术方案通过培养方式和诱导物成分的改进显著改善了细胞的黄酮产量，同时可适用于规模化的放大。具体来看，本发明首先以液体悬浮的方式对初始细胞株快速培养，每7～10天传代一次，细胞鲜重的增长量在3～5倍；而后采用两阶段培养法：生长阶段使细胞快速增殖，7～10天获得最大细胞量，生产阶段在一定的高密度接种量150～400g/l(鲜重)条件下，加入前体苯丙氨酸、诱导剂冠菌素，培养3-5天收获细胞，黄酮含量提高至13％以上。本工艺采用新型诱导剂冠菌素，用量小，作用显著，无毒副作用，能够迅速提高雪莲细胞的黄酮含量；本发明适用于20L以上的大规模生物反应器，已利用本公司的生物反应器在20L、100L、200L、1000L规模成功培养，且细胞状态良好，产量稳定，黄酮含量在11％以上。具体实施方式以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。实施例1(天山雪莲细胞系的生长和生产动力学考察)配置经激素筛选及优化后的MS培养基，即生长培养基LG，含有0.5mg/l6-BA、1mg/lNAA、30g/l蔗糖，100ml三角摇瓶，装液量为20ml，取一株培养至一个周期末的天山雪莲细胞系(命名为SE-5)，以40g/l浓度(鲜重)接入上述三角摇瓶中，分别在培养0天、2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天、18天、20天检测细胞的鲜重和黄酮产量，结果如表1所示。表1天山雪莲细胞系SE-5在生长培养基LG中的生长动力学表现培养时间\考察项目细胞鲜重(g)黄酮产量(μg)0天402.12天45.72.44天72.53.66天110.85.98天159.57.810天165.28.212天140.16.814天100.65.216天68.33.518天65.82.420天53.21.8实施例2(天山雪莲细胞两阶段调控工艺在小试摇瓶规模的实现)分别配置生长培养基LG(含有0.5mg/l6-BA、1mg/lNAA、30g/l蔗糖)和生产培养基LP(含0.5mg/l6-BA、1.0mg/lNAA、20g/l、100umol/l苯丙氨酸、5umol/l冠菌素、20g/l蔗糖)，接种60g/l(鲜重)的SE-5细胞于100ml三角摇瓶中，装有20mlLG培养基，培养温度为23℃，摇床转速为120rpm，培养10天；利用100目的筛网过滤除掉培养液，接种150/l(鲜重)细胞于100ml三角摇瓶中，装有20mlLP生产培养基，24h全光照，光照强度为2000lux，转速为130rpm，培养3天收获细胞。结果：经过生长培养阶段的天山雪莲细胞，鲜重翻倍量为5倍，生长量达到300g/l(鲜重)，同时启动两批次的生产培养，培养3天后结束，收获的雪莲细胞的黄酮含量为13％。实施例3(天山雪莲细胞两阶段调控工艺在中试1000L反应器规模的实现)采用一次性生物反应器，装有1000LLG生长培养基(包含0.5mg/l6-BA、1.0mg/lNAA、30g/l蔗糖)，振频为5次/min，通空气为0.3m3/h，接种量为50g/l,培养周期为7天；接种200g/l(鲜重)细胞于装有1000lLP生产培养基(包含0.5mg/l6-BA、1.0mg/lNAA、100umol/l苯丙氨酸、5umol/l冠菌素、20g/l蔗糖)的一次性生物反应中，，24h全光照，光照强度为2000-3000lux，振频7次/min，通空气为0.6m3/h，培养5天收获细胞。结果：经过生长培养阶段的天山雪莲细胞，鲜重翻倍量为4倍，生长量达到200g/l(鲜重)，同时启动-批次1000L反应器的生产培养，培养5天后结束，收获的雪莲细胞的黄酮含量达到11％。实施例4一种规模化培养天山雪莲细胞高产黄酮的调控方法，包括以下步骤：1、天山雪莲细胞系筛选：采用天然雪莲试管苗进行外植体诱导，获得愈伤组织，对固体细胞进行Ser-137、uv-B诱变，低温4℃处理，含高糖50-100g/l的MS培养基反复进行筛选，获得一株天山雪莲细胞系，命名为SE-5，培养条件为23℃，光周期为16h/8h,光照强度为1000-3000lux,每两周继代一次。2、液体悬浮天山雪莲细胞系SE-5：挑选生长状态良好，颜色鲜亮，质地紧实的固体细胞放入含有0.5mg/l6-BA、1.0mg/lNAA、20-40g/l蔗糖的MS生长培养基LG中，培养条件为23-25℃，光周期为16h/8h,光照强度为1000-3000lux,每7-10天传代一次，细胞鲜重翻倍量在3-5倍，黄酮含量在7％以上。3、小试调控工艺(液-液两阶段培养法)：生长阶段是接种30-80g/l(鲜重)的SE-5细胞于100ml三角摇瓶中，装有20mlLG生长培养基，培养温度为23℃，摇床转速为100-130rpm，培养7-10天；生产阶段是利用50-150目的筛网过滤除掉培养液，接种150-400/l(鲜重)细胞于100ml三角摇瓶中，装有20mlLP生产培养基，培养基中包含0.5mg/l6-BA、1.0mg/lNAA、0-100umol/l苯丙氨酸、0.5-10umol/l冠菌素、20g/l蔗糖，24h全光照，光照强度为2000-3000lux，转速为100-130rpm，培养3-5天收获细胞，此时雪莲细胞的黄酮含量大于13％。4、大规模生物反应器调控工艺：采用本公司自主研发的一次性生物反应器反应器(见专利ZL201210021722.6和201420705851.1)，装有20-1000LLG生长培养基，振频为1-20次/min，通空气0-1m3/h，接种量为50-100g/l,培养周期为7-10天，黄酮含量6％以上；接种150-300/l(鲜重)细胞于装有20-1000LP生产培养基的一次性生物反应中，培养基中包含0.5mg/l6-BA、1.0mg/lNAA、100umol/l苯丙氨酸、0.5-10umol/l冠菌素、20g/l蔗糖，24h全光照，光照强度为2000-3000lux，振频为5-20次/min，通空气0-1m3/h，培养3-5天收获细胞，此时雪莲细胞的黄酮含量大于11％。实施例5一种规模化培养天山雪莲细胞高产黄酮的调控方法，包括以下步骤：1)取天山雪莲细胞接种于液体生长培养基中，以温度20℃，每天光照14h、黑暗6h，光照强度1000lux的条件培养，每7天传代一次，直至培养液中细胞鲜重达初始细胞接种量3倍；2)取步骤1)培养所得的天山雪莲细胞，以鲜重30g/L的接种量接种于15mL液体生长培养基中，以温度20℃，100rpm的转速摇床培养5天；从产物中取天山雪莲细胞，以鲜重150g/L的接种量接种于15mL液体生产培养基中，以24h全光照，光照强度2000lux，100rpm的转速摇床培养1天；3)取步骤2)培养所得的天山雪莲细胞，以鲜重50g/L的接种量接种于20L液体生长培养基中，以0.01m3/h的通气速率培养5天；从产物中取天山雪莲细胞，以鲜重150g/L的接种量接种于20L液体生产培养基中，以24h全光照，光照强度2000lux，0.01m3/h的通气速率培养1天；其中所述生长培养基是含有0.4mg/L植物激素6-BA、0.8mg/L植物激素NAA、20g/l蔗糖的MS培养基；所述生产培养基是含有0.4mg/L植物激素6-BA、0.8mg/L植物激素NAA、0.1μmol/l苯丙氨酸、0.5μmol/l冠菌素、15g/l蔗糖的MS培养基。在以上技术方案的基础上，满足以下条件：步骤1)中用于接种的天山雪莲细胞是通过以下方法获得的：取天然雪莲试管苗进行外植体诱导，获得愈伤组织，对固体细胞利用Ser137γ射线、uv-B诱变，而后0℃处理，再利用含蔗糖50g/L的MS固体培养基，以温度20℃，每天光照14h、黑暗6h，光照强度1000lux的条件反复培养，筛选获得天然雪莲细胞系。步骤1)中所述反复培养的过程中，每两周继代一次。步骤1)所得产物中黄酮产量为细胞总干重的7％。步骤2)中所述生长培养基盛装于100mL三角瓶中；步骤2)中所述生产培养基盛装于100mL三角瓶中。步骤2)中所述从产物中取天山雪莲细胞，是50目的筛网过滤除掉培养液得到的。步骤1)所得产物中黄酮产量为细胞总干重的13％。步骤3)中利用生长培养基所进行的培养是在公开号为CN103224882A的中国专利文献所披露的生物反应器中进行的，培养过程中反应器的振频为1次/min。步骤3)中利用生产培养基所进行的培养是在公开号为CN103224882A的中国专利文献所披露的生物反应器中进行的，培养过程中反应器的振频为5次/min。步骤3)所得产物中黄酮产量为细胞总干重的11％。实施例6一种规模化培养天山雪莲细胞高产黄酮的调控方法，包括以下步骤：1)取天山雪莲细胞接种于液体生长培养基中，以温度25℃，每天光照18h、黑暗10h，光照强度3000lux的条件培养，每10天传代一次，直至培养液中细胞鲜重达初始细胞接种量5倍；2)取步骤1)培养所得的天山雪莲细胞，以鲜重80g/L的接种量接种于25mL液体生长培养基中，以温度25℃，130rpm的转速摇床培养8天；从产物中取天山雪莲细胞，以鲜重400g/L的接种量接种于25mL液体生产培养基中，以24h全光照，光照强度3000lux，130rpm的转速摇床培养4天；3)取步骤2)培养所得的天山雪莲细胞，以鲜重100g/L的接种量接种于1000L液体生长培养基中，以1m3/h的通气速率培养8天；从产物中取天山雪莲细胞，以鲜重300g/L的接种量接种于1000L液体生产培养基中，以24h全光照，光照强度3000lux，1m3/h的通气速率培养4天；其中所述生长培养基是含有0.6mg/L植物激素6-BA、1.2mg/L植物激素NAA、40g/l蔗糖的MS培养基；所述生产培养基是含有0.6mg/L植物激素6-BA、1.2mg/L植物激素NAA、100μmol/l苯丙氨酸、10μmol/l冠菌素、25g/l蔗糖的MS培养基。在以上技术方案的基础上，满足以下条件：步骤1)中用于接种的天山雪莲细胞是通过以下方法获得的：取天然雪莲试管苗进行外植体诱导，获得愈伤组织，对固体细胞利用Ser137γ射线、uv-B诱变，而后8℃处理，再利用含蔗糖100g/L的MS固体培养基，以温度25℃，每天光照18h、黑暗10h，光照强度3000lux的条件反复培养，筛选获得天然雪莲细胞系。步骤2)中所述从产物中取天山雪莲细胞，是150目的筛网过滤除掉培养液得到的。步骤3)中利用生长培养基所进行的培养是在公开号为CN204385208U的中国专利文献所披露的生物反应器中进行的，培养过程中反应器的振频为20次/min。步骤3)中利用生产培养基所进行的培养是在公开号为CN204385208U的中国专利文献所披露的生物反应器中进行的，培养过程中反应器的振频为20次/min。实施例7一种规模化培养天山雪莲细胞高产黄酮的调控方法，包括以下步骤：1)取天山雪莲细胞接种于生长培养基中，以温度23℃，每天光照16h、黑暗8h，光照强度2000lux的条件培养，每8天传代一次，直至培养液中细胞鲜重达初始细胞接种量4倍；2)取步骤1)培养所得的天山雪莲细胞，以鲜重55g/L的接种量接种于20mL生长培养基中，以温度23℃，115rpm的转速摇床培养6天；从产物中取天山雪莲细胞，以鲜重275g/L的接种量接种于20mL生产培养基中，以24h全光照，光照强度2500lux，115rpm的转速摇床培养3天；3)取步骤2)培养所得的天山雪莲细胞，以鲜重75g/L的接种量接种于20L生长培养基中，以0.5m3/h的通气速率培养7天；从产物中取天山雪莲细胞，以鲜重225g/L的接种量接种于20L生产培养基中，以24h全光照，光照强度2500lux，0.5m3/h的通气速率培养2天；其中所述生长培养基是含有0.5mg/L植物激素6-BA、1mg/L植物激素NAA、30g/l蔗糖的MS培养基；所述生产培养基是含有0.5mg/L植物激素6-BA、1mg/L植物激素NAA、500μmol/l苯丙氨酸、5μmol/l冠菌素、20g/l蔗糖的MS培养基。以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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