iPS细胞分化成内胚层祖细胞的无血清诱导培养基及诱导方法与流程

本发明涉及组织工程领域，尤其是涉及一种iPS细胞分化成内胚层祖细胞的无血清诱导培养基及诱导方法。
背景技术：
：组织工程是近几年的研究热点，但是种子细胞很难在体外进行大规模的培养扩增，种子细胞来源问题阻碍了组织工程的发展。自体的种子细胞来源有限，异体的种子细胞存在排斥反应，胚胎干细胞又存在伦理问题，因此从尿液中收集尿液细胞，将尿液细胞诱导成为iPS细胞(诱导性多能干细胞)，iPS细胞再诱导成为各个成体细胞，可以解决组织工程的种子来源问题。从尿液中获得细胞，方便快捷，不用通过创伤获取，来源广泛。目前iPS细胞诱导分化为成体细胞诱导方案主要有单纯细胞因子诱导、共培养诱导、拟胚体培养基诱导等。然而单纯细胞因子诱导效率低，共培养诱导存在免疫原性，拟胚体存在不定向三个胚层诱导的特点，定向分化率低。成体的各个细胞来源于胚层的不同胚层，因此，要高效获得某种成体细胞，亟需高效定向获得某一种胚层。技术实现要素：基于此，有必要提供一种iPS细胞分化成内胚层祖细胞的无血清诱导培养基及诱导方法。一种iPS细胞分化成内胚层祖细胞的无血清诱导培养基，包括第一阶段培养基、第二阶段培养基和第三阶段培养基；其中，所述第一阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为80-160ng/ml的ActivinA以及终浓度为5-18ng/ml的HGF；所述第二阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为8-25ng/ml的BMP-4；所述第三阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为5-18ng/ml的HGF以及终浓度为15-28ng/ml的FGF-2；所述基础培养基为每500mlDMEM/F12培养基中添加有终浓度为0.05-0.2mmol/l的β巯基乙醇、终浓度为75-180μg/ml的Wnt3a、终浓度为0.15-0.7μg/ml的氢化可的松、终浓度为25-100μg/ml的胰岛素、终浓度为5-20ng/ml的亚硒酸钠以及终浓度为85-180μg/ml的转铁蛋白。在其中一个实施例中，所述第一阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为80-120ng/ml的ActivinA以及终浓度为8-12ng/ml的HGF；所述第二阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为15-25ng/ml的BMP-4；所述第三阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为8-12ng/ml的HGF以及终浓度为15-25ng/ml的FGF-2；所述基础培养基为每500mlDMEM/F12培养基中添加有终浓度为0.08-0.12mmol/l的β巯基乙醇、终浓度为80-120μg/ml的Wnt3a、终浓度为0.2-0.6μg/ml的氢化可的松、终浓度为50-80μg/ml的胰岛素、终浓度为8-12ng/ml的亚硒酸钠以及终浓度为85-120μg/ml的转铁蛋白。在其中一个实施例中，所述第一阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为100ng/ml的ActivinA以及终浓度为10ng/ml的HGF；所述第二阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为20ng/ml的BMP-4；所述第三阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为10ng/ml的HGF以及终浓度为20ng/ml的FGF-2；所述基础培养基为每500mlDMEM/F12培养基中添加有终浓度为0.1mmol/l的β巯基乙醇、终浓度为100μg/ml的Wnt3a、终浓度为0.4μg/ml的氢化可的松、终浓度为60μg/ml的胰岛素、终浓度为10ng/ml的亚硒酸钠以及终浓度为100μg/ml的转铁蛋白。一种iPS细胞分化成内胚层祖细胞的诱导方法，依次上述第一阶段培养基、第二阶段培养基及第三阶段培养基对iPS细胞分为三个阶段进行诱导分化。在其中一个实施例中，所述三个阶段分别为诱导分化的第1天至第3天、第4天至第7天以及第8天至第11天，在每个阶段培养时，均隔天换培养基。在其中一个实施例中，所述iPS细胞分化成内胚层祖细胞的诱导方法还包括在诱导分化之前，将iPS细胞通过培养板和离心的方法形成单细胞团拟胚体的步骤。在其中一个实施例中，所述将iPS细胞通过培养板和离心的方法形成单细胞团拟胚体的步骤是按照每个培养板孔加入0.5-1×106个iPS细胞，添加EB形成培养基，再以400-700r/min低速离心4-10分钟后，放入5％CO2、37℃环境中培养40-65小时，形成所述单细胞团拟胚体。在其中一个实施例中，所述培养板为AggreWellTM800培养板。在其中一个实施例中，所述iPS细胞分化成内胚层祖细胞的诱导方法还包括如下iPS细胞复苏及单细胞形成的步骤：将P30的iPS细胞进行复苏，用mTeSR1无基质细胞培养，在70-80％汇合度时，用Accutase消化液消化为单细胞，再将所述单细胞按照每个培养板孔0.5-1×106个iPS细胞加入所述培养板孔中以形成所述单细胞团拟胚体。通过使用上述特定成分和浓度的iPS细胞分化成内胚层祖细胞的无血清诱导培养基及诱导方法，该无血清诱导培养基中各成分协同配合可以将iPS细胞定向诱导分化为内胚层祖细胞，从而为iPS诱导分化为成体的各个细胞提供了技术支持。同时该无血清诱导培养基及诱导方法均没有用到血清，从而有效地避免了动物源性病原体带来的风险，提高了临床应用的安全性。并且较之传统的含胎牛血清的拟胚体培养基等，显著提高了iPS细胞向内胚层祖细胞的诱导分化效率，可靠性高，适用范围广。并且通过进一步优化该无血清诱导培养的各成分浓度，可以取得更为显著的诱导iPS细胞向内胚层祖细胞分化的效率和效果。附图说明图1为实验组与对照组的内胚层祖细胞的免疫荧光染色SOX17表达的鉴定结果图；图2为实验组与对照组的内胚层祖细胞中SOX17阳性率的比较结果。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本实施例先将iPS细胞通过AggreWellTM800培养板和离心的方法形成单细胞团拟胚体，实验组用无血清诱导培养基培养单细胞团拟胚体形成定型内胚层，对照组是继续用拟胚体培养基进行培养，然后通过免疫荧光方法鉴定细胞，比较实验组和对照组的内胚层SOX17的表达水平。具体过程如下。一、培养基1.实验组2.对照组培养基名称工作浓度EB培养基500ml可理解，在其他实施例中，实验组培养基的成分不限于上表中，只要满足第一阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为80-160ng/ml的ActivinA以及终浓度为5-18ng/ml的HGF；第二阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为8-25ng/ml的BMP-4；第三阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为5-18ng/ml的HGF以及终浓度为15-28ng/ml的FGF-2；基础培养基为每500mlDMEM/F12培养基中添加有终浓度为0.05-0.2mmol/l的β巯基乙醇、终浓度为75-180μg/ml的Wnt3a、终浓度为0.15-0.7μg/ml的氢化可的松、终浓度为25-100μg/ml的胰岛素、终浓度为5-20ng/ml的亚硒酸钠以及终浓度为85-180μg/ml的转铁蛋白即可，或者进一步满足第一阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为80-120ng/ml的ActivinA以及终浓度为8-12ng/ml的HGF；第二阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为15-25ng/ml的BMP-4；第三阶段培养基为每500ml基础培养基中添加有终浓度为8-12ng/ml的HGF以及终浓度为15-25ng/ml的FGF-2；基础培养基为每500mlDMEM/F12培养基中添加有终浓度为0.08-0.12mmol/l的β巯基乙醇、终浓度为80-120μg/ml的Wnt3a、终浓度为0.2-0.6μg/ml的氢化可的松、终浓度为50-80μg/ml的胰岛素、终浓度为8-12ng/ml的亚硒酸钠以及终浓度为85-120μg/ml的转铁蛋白即可。二、步骤(1)基础培养基的配制：按每500mlDMEM/F12培养基加入胰岛素30mg、氢化可的松0.2mg、转铁蛋白50mg、亚硒酸钠5μg、β巯基乙醇0.05mmol以及Wnt3a50μg配制。(2)第一阶段培养基：将步骤1的基础培养基500ml，加入ActivinA50μg，HGF5μg。(3)第二阶段培养基：将步骤1的基础培养基500ml，加入BMP-410μg。(4)第三阶段培养基：将步骤1的基础培养基500ml，加入HGF5μg，FGF-210μg。(5)对照组培养基：EB培养基(主要成分：拟胚体(EB)形成基础培养基、拟胚体(EB)形成专用胎牛血清、谷氨酰胺、双抗、非必需氨基酸(购买自:北京百奥莱博科技有限公司，产品编号：BL1266)、2-巯基乙醇，厂家：赛业生物科技有限公司，产品编号：MUXES-90051)(6)复苏细胞：选择P30的iPS细胞(来源中国科学院广州生物医药与健康研究院)进行复苏，用mTeSR1无基质细胞培养，80％汇合度时，用Accutase消化液消化为单细胞，计数。(7)单细胞团拟胚体的形成：按每个AggreWellTM800培养板孔中加入1×106个iPS细胞，加入EB形成培养基，按产品使用操作手册，将AggreWellTM800培养板以700r/min低速离心5min后，放入5％CO2、37℃培养箱中培养，培养48h后形成单细胞团拟胚体。(8)诱导分化：将单细胞团拟胚体转移至低吸附24孔板中，24孔板分为两组，实验组和对照组，每组12孔，隔天换液，培养到11天后，对外胚层祖细胞的基因表达水平和表面蛋白表达水平进行检测。实验组诱导方法：开始诱导的第一天记为第一天(Day1)。第一阶段(Day1-3)：用第一阶段培养基培养iPS细胞。第二阶段(Day4-7)：用第二阶段培养基进行培养。第三阶段(Day8-11)：用第三阶段培养基进行培养。观察发现：经过第二、第三阶段的诱导，形态发生改变、细胞数量增加，定行内胚层细胞基本形成。对照组的诱导方法：全程都是用EB培养基进行诱导培养。三、内胚层祖细胞的鉴定免疫荧光染色：(1)吸弃孔板中的培养基，注意不要碰到细胞。(2)加入1×PBS清洗细胞一次，5min，吸弃PBS。(3)再加入4％的多聚甲醛(4％PFA)，放入37℃、5％CO2培养箱中孵育20min。此步骤后可拿出超净台操作。(4)吸弃4％多聚甲醛，注意不要碰到细胞。用1×PBS清洗细胞3次，每次5min。(5)吸弃PBS。加入0.1％Triton打孔，作用10min。(6)吸弃0.1％Triton，用1×PBS清洗细胞3次，每次3min。(7)加入5％BSA，常温封闭1h。(8)终止封闭前，按照1:100的比例，用PBS稀释一抗。(9)吸弃封闭液，用PBS洗细胞一次。(10)加入稀释过的一抗，4℃孵育过夜。(11)吸弃一抗。用1×PBS清洗细胞3次，每次3min。(12)按照1:500的比例稀释荧光二抗(成分：FITC，厂家：艾美捷科技有限公司，产品编号：A22110)，向孔板中加入二抗，室温孵育1h。(13)吸弃二抗。用1×PBS清洗细胞3次，每次3min。(14)Hochest(纯水1：10000稀释)复染细胞核，室温作用约2min。(15)吸弃Hochest染液，用1×PBS清洗细胞3次，每次5min。(16)倒置荧光显微镜照相，备注好细胞名称、倍数、时间等。(17)用统计分析法，比较两组的阳性率。四、结果如图1和图2所示，结果表明，实验组的内胚层SOX17表达率显著提高，说明了iPS细胞向内胚层祖细胞的定向分化，进一步说明利用本发明的无血清诱导培养基及诱导方法，可以高效诱导iPS细胞向内胚层祖细胞的分化。同时整个过程没有用到血清，有效的避免了动物源性病原体带来的风险，提高了临床应用的安全性。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页1 2 3