一种菌落总数测试片及其制作方法与流程

本发明属于食品检测
技术领域：
，具体设计一种菌落总数测试片、制备方法及其在检测食品中菌落总数方面的应用。技术背景食品中菌落总数时食品卫生检测中的一项重要指标，是判定食品被细菌污染程度的标记。微生物检测的经典方法——平皿倾注法有良好的准确度，但操作繁琐，对计数人员有一定的专业要求。微生物检测测试片应运而生，应用无纺布、滤膜或冷水可溶胶作为培养基的载体,直接滴加样品液就能有针对性地对目标菌种进行筛选、培养、计数。最大优点是省却了繁重的准备工作,直接接种测试片,适宜温度培养后计数,使用后经灭菌便可弃置,简单方便,缩短检测时间且携带方便,适合户外操作。20世纪80年代起，国内外有许多相关产品问世，如德国R-BIOFHARM公司的RIDACOUNT和日本CHISSO公司的SANTTA-KUN微生物快速检测片，是以无纺布为载体的新型检测片；3M公司以冷水可溶凝胶和多孔膜为载体的测试片。其中，3M公司技术最为先进和成熟。但一般食品企业无法承受进口检测产品的高额开销。国内几家微生物公司近年来也陆续推出了相关测试片，例如以纸片为载体的绿洲牌微生物测试片；以无纺布为载体的北京良润生物牌测试片。虽然这些测试片便于携带且操作方便。但仍存在一些不足,特别是在细菌生长符合度方面有待提高。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种符合度高且价格低廉的菌落总数测试片，该测试片依次由厚度为0.6mm的透明塑料上层膜、有粘性的厚度4.5mm圆环形垫圈层1、直径6cm滤膜、直径5.2cm无纺布、有粘性的厚度3mm的环形垫圈2、有粘性的边长10.5cm的正方形底板组成；无纺布和滤膜上吸附有菌落总数显色培养基，无纺布上还吸附有冷水可溶胶。本发明可以检测500μl的液体样品。本发明实现目的的技术方案如下：一种菌落总数测试片，包括透明塑料上层膜、圆环形垫圈、滤膜、厚无纺布、薄无纺布、环形垫圈、底板，具体结构如下：在底板和上层膜之间同轴固装两个环形垫圈，在两个环形垫圈之间夹装滤膜，在下层环形垫圈的圆环内上下同轴嵌装两层无纺布，上层为厚无纺布、下层为薄无纺布，两层无纺布和滤膜上均吸附有菌落总数显色培养基。而且，所述无纺布上还吸附有冷水可溶胶菌落总数显色培养基。而且，所述菌落总数显色检测培养基的组分为：葡萄糖1.25g/L、吐温-800.025g/L、胰蛋白胨6.25/L、酵母粉1.25g/L、终浓度0.004％的TTC显色剂；而且，所述冷水可溶胶菌落总数显色培养基组分为：葡萄糖1.25/L、吐温-800.025g/L、胰蛋白胨胨6.25/L、酵母粉1.25g/L、终浓度0.004％％的TTC显色剂和终浓度1.6％的冷水可溶胶凝剂。而且，所述可溶胶凝剂为黄原胶、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、卡拉胶，或者是人工合成的胶凝剂如羟丙基纤维素、丙烯酸酯结构胶。而且，所述透明塑料上层膜为防水透气PET塑料薄膜，厚度为0.6mm，滤膜为尼龙膜、混合纤维素膜、聚醚砜膜或聚四氟乙烯膜滤膜，直径为4cm-7cm的圆形。一种制备菌落总数测试片的方法，步骤如下⑴培养基的制备⑵载体结构的制备将上述复配含冷水可溶胶凝剂的培养基浸渍两种无纺布3min，使无纺布浸满培养基。微孔滤膜浸渍上述不含胶凝剂的培养基；由下至上依次叠放浸渍了含冷水可溶胶培养基的薄层无纺布、厚层无纺布和不含胶凝剂的培养基，叠放完成后置于55℃烘箱干燥，烘干后的上述3层复合片层粘合在一起且在后续制作和接种时不会移动、脱离，通过上述方法制得的即为载体结构；⑶测试片的制备将3mm厚的垫圈作为下层，上述操作所制得的载体结构作为中层，4.5mm厚度的垫圈作为上层，组合制得三层“夹心”结构，即为测试片主体结构；将测试片主体结构粘合于有粘性的底板基材上，覆盖上厚度为0.6mm的PET覆盖片材；⑷包装和灭菌。本发明与其他技术相比具有以下优势：本发明研制的是基于滤膜和无纺布为载体的菌落总数测试片，与同类产品相比，突出的优点在于该测试片菌落总数培养基由基础培养基、显色剂和表面活性剂组成；载体由滤膜和无纺布组成；上层垫圈与滤膜构成的空间正好能容纳500μl的液体样品。加入待检食品样品稀释液于滤膜中央后，盖住上层覆膜，这时样品均匀扩散于垫圈形成的样品槽内，溶液向下渗透，被无纺布和吸附于无纺布的冷水可溶胶吸收，样品中的细菌被截留于滤膜上，同时无纺布吸收的培养基向上渗透，以提供细菌的生长，表面活性剂有助于待测样品中菌落的均匀分布与可视计数，显色剂的加入有利于菌落的辨认和统计。通过本专利所述方法制作的测试片，在接种液体样品后在37℃条件下培养48h可对红色菌落进行计数。通过对测试片法和国标法的对比实验结果可知，测试片对实验菌种检测符合度能够达到105％，测试片对实际样品菌落总数检测符合度能够达到89％以上。使用该测试片进行菌落计数操作简便、菌落形态良好、结果准确。附图说明图1为菌落总数测试片结构示意图，其中各部分为：透明塑料上层膜1、环形垫圈2、滤膜3、厚无纺布4、薄无纺布5、环形垫圈6、底板7。图2为菌落总数检测结果图。具体的实施方式为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。一、测试片结构的主要优化过程⑴不同载体结构可行性通过参考相关文献，结合收集的原始材料进行载体结构初筛，包括对滤纸、无纺布、无纺布滤纸二者结合、滤纸结合滤膜、无纺布结合滤膜、无纺布结合滤纸和滤膜等多种结构可行性评估。初筛后，选择了四类可能作为载体的结构进行复筛。第一类是纯无纺布结构，第二类是纯滤纸结构，第三类是上层滤膜加下层无纺布结构，第四类是以上层滤膜加下层滤纸结构，第五类是上层滤纸下层滤膜结构。实验结果表明，第三类结构和第四类结构效果明显优于其余几类结构，这两类结构共同点均以滤膜为载体上层结构，而下层为吸水层结构。结合滤纸、无纺布规格，对载体吸水材料进行最终筛选，最终确定25g/m2和45g/m2，直径5.2cm的圆形无纺布作为载体吸水层。⑵滤膜种类选择用国产某牌0.22μm混合纤维素、0.45μm混合纤维素、0.22μm尼龙、0.45μm尼龙滤膜作为覆膜层制作测试片，发现菌落在0.45μm尼龙滤膜表面生长正常，菌落颜色鲜艳，液体样品能在较短时间内被载体吸收。⑶胶体浓度优化基础培养基中胶体浓度越高，吸水性能越强。当吸水性能较弱时，会出现菌落形状不佳的状态，出现晕染情况；当吸水性能过强时，会出现滤膜层失水过多干燥，菌落无法生长的情况。所以选用不同瓜尔豆胶浓度的培养基做对比实验，发现1.6％胶体浓度制作的测试片符合度明显优于其余浓度胶体制得的测试片。⑷垫圈层数优化为了避免液体样品的溢出和加入液体样品后滤膜凸起的情况，设计了上下层垫圈结构。用1.5mm、3mm、4.5mm三种厚度的垫圈进行组合，结合点圈层对测试片整体结构的影响和测试片对比国标的符合度进行垫圈组合选择，最终确定上层垫圈4.5mm、下层垫圈3mm厚的组合为最优组合。二、菌落总数测试片的结构一种菌落总数测试片，包括透明塑料上层膜1、有粘性的圆环形垫圈层2、滤膜3、厚无纺布4、薄无纺布5、有粘性的环形垫圈2、有粘性的底板7，具体结构如下：在底板和上层膜之间同轴固装两个环形垫圈2、6，在两个环形垫圈之间夹装滤膜，在下层环形垫圈的圆环内上下同轴嵌装两层无纺布，上层为厚无纺布4、下层为薄无纺布5。两层无纺布和滤膜上均吸附有菌落总数显色培养基，无纺布上还吸附有冷水可溶胶；本发明中菌落总数显色检测培养基的组分为：葡萄糖1.25g/L、吐温-800.025g/L、胰蛋白胨6.25/L、酵母粉1.25g/L、终浓度0.004％的TTC显色剂；含有胶凝剂的菌落总数显色培养基组分为：葡萄糖1.25/L、吐温-800.025g/L、胰蛋白胨胨6.25/L、酵母粉1.25g/L、终浓度0.004％％的TTC显色剂和终浓度1.6％的冷水可溶胶凝剂。其中，胶凝剂可以是天然的胶凝剂如黄原胶、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、卡拉胶，或者是人工合成的胶凝剂如羟丙基纤维素、丙烯酸酯结构胶等。优选的，是瓜尔豆胶。透明塑料上层膜为透明度高，无毒无刺激性气味，防水透气PET塑料薄膜，厚度为0.6mm。滤膜为可透水材质类滤膜，可以是尼龙膜、混合纤维素膜、聚醚砜膜或聚四氟乙烯膜，可以是直径4cm-7cm的圆形。优选的，是0.45μm孔径的尼龙膜，为直径6cm的圆形。环形垫圈为硬度较好的无毒无刺激性气味的PET塑料板，厚度为4mm和2mm-4mm，两个垫圈大小一致，内径3.8cm-6.8cm，外径3.8cm-6.8cm。并且要求垫圈下层有胶粘性，其胶粘性由硅胶胶水或丙烯酸酯结构胶提供。优选的，垫圈材质为PET材质，垫圈1厚度4.5mm，垫圈2厚度3mm，两个垫圈大小一致，内径5.6cm，外径6.2cm，胶粘性由硅胶胶水提供。无纺布层包括了两种不同厚度的无纺布。无纺布为吸水性强，无毒无刺激性气味，对微生物生长无不利因素的无纺布，规格为15g/m2-30g/m2和35g/m2-50g/m2大小为直径3.5cm-6.5cm的圆形。优选的，无纺布规格为25g/m2和45g/m2大小为直径5.2cm的圆形。有粘性的底板为防水、防渗透的透明PP或PET塑料片材，厚度为0.7-1.5mm，为边长9cm-11cm的正方形，其胶粘性由硅胶胶水或丙烯酸酯结构胶提供。优选的，是PET塑料片材，厚度为0.9mm，为边长10.5cm的正方形。三、本发明提供上述菌落总数测试片的制备方法，其步骤如下：⑴培养基的制备将1.25g葡萄糖葡萄糖、0.025g吐温80、6.25g胰蛋白胨、1.25g酵母粉、终浓度0.004％的TTC显色剂溶解于1L水中，即为不含冷水可溶胶的培养基根据上述配比配置培养基，搅拌均匀，加入终浓度为1.6％的瓜尔豆胶，加入胶凝剂的同时，人工搅拌或用磁力搅拌器搅拌培养基，使得胶凝剂能在培养液中混合均匀，即为含有冷水可溶胶凝剂的培养基。⑵载体结构的制备将上述复配含冷水可溶胶凝剂的培养基浸渍两种无纺布3min，使无纺布浸满培养基。微孔滤膜浸渍上述不含胶凝剂的培养基；由下至上依次叠放浸渍了含冷水可溶胶培养基的薄层无纺布、厚层无纺布和不含胶凝剂的培养基，叠放完成后置于55℃烘箱干燥，烘干后的上述3层复合片层粘合在一起且在后续制作和接种时不会移动、脱离，通过上述方法制得的即为载体结构。⑶测试片的制备将3mm厚的垫圈作为下层，上述操作所制得的载体结构作为中层，4.5mm厚度的垫圈作为上层，组合制得三层“夹心”结构，即为测试片主体结构。将测试片主体结构粘合于有粘性的底板基材上，覆盖上厚度为0.6mm的PET覆盖片材(透明塑料上层膜)，根据上述方法即完成测试片的制备。⑷包装和灭菌按照上述方法制作的简易装置可用以下方式进行灭菌：环氧乙烷气体，γ射线、电子束辐照灭菌。优选的灭菌方式是，将简易培养装置包装于隔绝气体和光线的包装中，如铝箔包装材料中，之后用电子束辐照灭菌，其中辐照剂量为15KGy。三、推荐一种具体尺寸的菌落总数测试片的制备方法，具体如下：将葡萄糖1.25g、吐温-800.025g、胰蛋白胨6.25g、酵母粉1.25g、0.004％的TTC显色剂溶解于1L水中，即为不含冷水可溶胶的培养基。根据上述配比配置培养基，搅拌均匀，加入胶凝剂，加入胶凝剂的同时，人工搅拌或用磁力搅拌器搅拌培养基，使得胶凝剂能在培养液中混合均匀。将上述复配含冷水可溶胶凝剂的培养基浸渍两种无纺布3min，使无纺布浸满培养基；孔径0.45μm的尼龙滤膜浸渍上述不含胶凝剂的培养基；由下至上一次叠放浸渍了含冷水可溶胶培养基的薄层无纺布、厚层无纺布和不含胶凝剂的培养基，叠放完成后置于55℃烘箱干燥，干燥4h。将3mm厚的垫圈作为下层，上述操作所制得的载体结构作为中层，4.5mm厚度的垫圈作为上层，组合制得三层“夹心”结构，即为测试片主体结构。将测试片主体结构粘合于有粘性的底板基材上，覆盖上厚度为0.6mm的PET覆盖片材，根据上述方法即完成测试片的制备。按照上述方法制作的简易装置同干燥剂放入铝箔包装袋中。辐照灭菌，辐照剂量为15KGy。四、利用测试片测定食品中菌落总数方法若是固体样品则称取25g样品置于盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。若为液体样品以无菌吸管吸取25mL置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。根据上述操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。估计样品污染状况，选择2-3个稀释梯度的样品进行接种，取待检食品样品稀释液稀释液500μl,掀开测试片的覆盖片层,加至培养基区域中,盖上覆盖片材，这样样品会均匀扩散于样品容纳区内，静置片刻后放入培养箱37℃培养48h。每个稀释度做3个测试片,同时,分别吸取500μl生理盐水加入两个测试片作空白对照。48h后选取菌落数在30CFU-300CFU的测试片进行计数，计算样品中菌落总数含量。五、菌落总数测试片测定效果评价实验室菌种符合度评价大肠杆菌ATCC35150、大肠杆菌CICC10305、金黄色葡萄球菌ATCC25923、沙门氏菌CICC10467接种至LB培养基培养到对数期后，用生理盐水稀释至所有菌浓度再100-300CFU/500μl，等量混合菌悬液，取500μl接种于测试片上，5个平行，同时在平皿中加入相同量菌悬液，作为对照组倾注培养。在37℃下培养48h后统计，结果取平均值,见表1。表1：测试片检测混合菌悬液符合度结果平均值(CFU)对照(CFU)符合度混合菌悬液177.0167.2105.81％实际样品符合度评价选取过期面包、雪糕和速冻馒头为样品，按照GB4789.2-2010所述方法进行采样实验，接种500μl于测试片上，同时接种相同量样品于平皿中进行倾注实验。在37℃环境下培养48h后进行统计学分析。测试片测定不同食品样品中菌落总数与国标方法测定的结果分析如表2。表2：测试片检测实际样品实验结果平均值(CFU/ml)对照(CFU/ml)符合度雪糕303196.77％速冻馒头23525094.00％过期面包7333820089.43％当前第1页1 2 3