一种温敏有机-无机复合水凝胶材料及制备方法与流程

本发明属于生物复合材料领域，具体涉及一种温敏有机-无机复合水凝胶材料及制备方法，适用于骨缺损的引导再生修复。

背景技术：

由创伤、炎症、肿瘤和先天因素等原因导致的骨组织缺损的发生率较高，如由口腔常见疾病牙周病引起的牙槽骨吸收和牙齿缺失，交通事故造成的颌骨外伤和骨缺损，以及伴发于先天性唇腭裂的牙槽嵴裂等发育性疾病，每年超过300万人。但大范围的骨缺损通常不能自愈，临床实践中常用的骨增量材料主要是自体骨组织移植材料和商品化的人工骨替代材料。现在临床上使用的人工骨替代材料常见有同种异体骨（脱钙冻干骨）、异种异体骨（脱蛋白小牛骨的Bio-Oss粉体修复材料），羟基磷灰石（HA）以及以磷酸钙盐（β-TCP）为主要成分的骨修复材料如Straumann BoneCeramic等，这些材料几乎都来自于进口，价格昂贵，而且生物来源的修复材料也存在潜在的危险性。另外，临床显示这些材料的成骨效能也比较有限，临床适用范围较窄，且大部分产品为粉体，临床操作不方便、塑形困难，对于垂直向和稍大范围的骨缺失就束手无策。在这种情况下，临床医生（尤其是口腔领域）仍倾向于使用患者自体骨来改善术区骨量不足和骨况不佳的情况。因此，新型人工骨替代材料临床需求迫切，研制使用便捷、适用范围大、修复速度快的新型骨增量修复材料，具有显著的临床意义和社会意义。

在传统微米尺度的实壁支架或纤维支架上，因孔体积远大于细胞尺寸，细胞更倾向于二维铺展，但在仿生天然细胞外基质的纳米纤维网络中，细胞可以近乎三维的方式生长。已经证实，成骨相关细胞在纳米纤维支架上的分化和骨矿沉积性能明显优于传统实壁支架。因此，磷酸钙基纳米纤维无疑是新型填充型引导骨再生修复材料的重要发展方向之一。此外，通过阳离子(如Mg²⁺、Zn²⁺和Sr²⁺等离子)的掺杂,制备得到的钙磷基陶瓷纳米纤维与天然骨组织骨矿的组成更为相近，成骨活性可得到显著提高。

为改善钙磷基陶瓷纳米纤维这些无机粉体修复材料的临床操作性，赋予可塑形性，并有效填充不规则形状的缺损部位，将具有成骨生物活性的磷酸钙基纳米纤维与可注射水凝胶相结合，发展一种温度敏感的、临床操作方便的有机-无机骨填充修复材料，

能更好地满足骨缺损临床治疗的需要，符合骨增量修复的临床特点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种温敏有机-无机复合水凝胶材料及制备方法，其特点在于利用可注射水凝胶易于塑形、临床操作方便的特点，将其与具有成骨生物活性的磷酸钙基纳米纤维复合，调节两者的比例，获得一种可塑形能力强、易于填充缺损部位的、具有成骨活性的骨再生修复材料。

本发明的一种温敏有机-无机复合水凝胶材料的制备，包括聚（N-异丙基丙烯酰胺）接枝明胶的合成、离子掺杂磷酸钙陶瓷纳米纤维的制备和两者的复合，具体制备方法如下：

（1）将明胶溶于去离子水，加入α-溴代异丁酸，加入1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺在40^oC反应24小时，经乙醇沉淀纯化得到溴化明胶；将溴化明胶溶于二甲亚砜，加入N-异丙基丙烯酰胺，加入1,1,4,7,7甲基二亚乙基三胺，通氮气除氧后加入溴化亚铜，在30^oC反应1小时；将反应混合液倾入去离子水中终止反应，采用过三氧化二铝色谱柱纯化除去溴化亚铜后，去离子水透析除去未反应N-异丙基丙烯酰胺和1,1,4,7,7甲基二亚乙基三胺，冷冻干燥后得到聚（N-异丙基丙烯酰胺）接枝明胶（Gel-g-PNIPAAm）。

（2）将磷酸三乙酯、乙醇和水按一定摩尔比混合后，加入0.5%氨水为催化剂，于80^oC下水解24小时，得到充分水解的有机磷酸混合液A；将四水硝酸钙和其他硝酸盐按一定比例溶解于无水乙醇，配成一定浓度的硝酸盐醇溶液B；按照钙磷摩尔比1.0-1.6，将硝酸盐醇溶液B滴加到磷酸三乙酯水解溶液A中，在4^oC搅拌混合2小时，得到初生溶胶溶液C；将初生溶胶置于-20^oC陈化7天后，按一定比例加入聚乙烯吡咯烷酮水溶液，混合均匀后经静电纺丝得到初生纳米纤维；将初生纳米纤维在700-1200^oC烧结6小时，得到离子掺杂的磷酸钙陶瓷纳米纤维。

（3）在室温，将聚（N-异丙基丙烯酰胺）接枝明胶溶于去离子水配成10-50%水溶液，与一定比例的离子掺杂磷酸钙纳米纤维混合，调节磷酸钙陶瓷纳米纤维的比例，利用聚（N-异丙基丙烯酰胺）接枝明胶的温敏特性，制备得到具有成骨活性的温敏有机-无机复合水凝胶骨填充修复材料。

本发明所述的温敏有机-无机复合水凝胶材料，其温敏性是利用聚（N-异丙基丙烯酰胺）的负温度敏感特性，聚（N-异丙基丙烯酰胺）接枝明胶水溶液具有在人体温度

下形成水凝胶的能力来实现的。

本发明所述的聚（N-异丙基丙烯酰胺）接枝明胶的制备方法，是利用原子转移自由基聚合法，通过溴化明胶引发N-异丙基丙烯酰胺聚合来实现接枝的。改变大分子引发剂与单体N-异丙基丙烯酰胺的投料比，可得到聚（N-异丙基丙烯酰胺）接枝密度及接枝长度不同的明胶。

本发明所述的磷酸钙陶瓷纳米纤维，根据钙磷投料比和烧结温度，是一种羟基磷灰石、β-磷酸三钙的单相或二者共存的复相纤维。

本发明所述的离子掺杂磷酸钙陶瓷纳米纤维中的掺杂离子可以是Mg²⁺、Zn²⁺、Sr²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Cd²⁺等二价金属离子中的一种或几种。制备方法步骤（2）中所述的其他硝酸盐为硝酸镁、硝酸锌、硝酸锶、硝酸锰、硝酸钡和硝酸镉中的一种或几种，钙离子与掺杂离子的摩尔比为100:0～90:10。

本发明所述的温敏有机-无机复合水凝胶材料，根据聚合物水溶液与磷酸钙陶瓷纳米纤维复合的比例不同，外观表现为可注射填充的液态、易于操作的糊状或膏状。

本发明制备得到的温敏有机-无机复合水凝胶材料，有效地将温敏水凝胶的易于塑形性和具有成骨活性的磷酸钙陶瓷纳米纤维复合，不仅改善无机粉体填充材料的临床操作性，有效填充不规则形状的骨缺损部位，而且通过多种离子的掺杂，提高修复材料的成骨生物活性。本发明的制备过程可控，修复材料的可调控性强，可以应用于不同类型骨组织缺损的再生修复。

以下结合具体实施方式对本发明的内容进行详细说明，但本发明并不限于以下这些实例，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。

附图说明

图1 Gel-g-PNIPAAm水溶液的低临界溶液温度（LCST）

图2 离子掺杂磷酸钙陶瓷纳米纤维的SEM图

图3 可注射填充的温敏有机-无机复合水凝胶溶液在25^oC的实物图

图4 可注射填充的温敏有机-无机复合水凝胶在37^oC凝胶后的实物图

图5 可塑形温敏有机-无机复合水凝胶骨填充修复材料的实物图

具体实施方式

实施例1

（1）将5g明胶溶于40ml去离子水，加入α-溴代异丁酸1.67g，加入1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺2.3g和N-羟基琥珀酰亚胺0.55g在40^oC反应24小时，经乙醇沉淀纯化得到溴化明胶；将溴化明胶2g溶于20ml二甲亚砜，加入N-异丙基丙烯酰胺10g，加入1,1,4,7,7甲基二亚乙基三胺200μl，通氮气除氧后加入溴化亚铜0.1g，在30^oC反应1小时；将反应混合液倾入去离子水中终止反应，采用过三氧化二铝色谱柱纯化除去溴化亚铜后，去离子水透析除去未反应N-异丙基丙烯酰胺和1,1,4,7,7甲基二亚乙基三胺，冷冻干燥后得到聚（N-异丙基丙烯酰胺）接枝明胶（Gel-g-PNIPAAm-1）。其水溶液的临界溶液温度（LCST）为35^oC。

（2）将磷酸三乙酯、乙醇和水按1:3:3摩尔比混合后，加入0.5%的氨水为催化剂调节体系pH = 9，于80^oC下水解24小时，得到充分水解的有机磷酸混合液A；将四水硝酸钙溶解于无水乙醇，配成3mol/L的硝酸钙醇溶液B；按照钙磷摩尔比1.4，将硝酸盐醇溶液B滴加到磷酸三乙酯水解溶液A中，在4^oC搅拌混合2小时，得到初生溶胶溶液C；将初生溶胶置于-20^oC陈化7天后，按溶胶:水= 5:1的质量比配制纺丝液，加入聚乙烯吡咯烷酮（Mn=1,300,000）作为助纺剂，其浓度为4wt.%，混合均匀后经静电纺丝（环境温度40^oC，湿度低于30%，纺丝液流速0.5ml/h，电压18kV，接收距离15cm）得到初生纳米纤维；将初生纳米纤维在1000^oC烧结6小时，得到的HA-TCP复相磷酸钙陶瓷纳米纤维。

（3）室温下，将2g的Gel-g-PNIPAAm-1溶于20ml去离子水配成10%水溶液，与1g的HA-TCP复相磷酸钙陶瓷纳米纤维混合，得到可注射填充的液态修复材料，其在体温37^oC下迅速转变为凝胶态。

实施例2

（1）Gel-g-PNIPAAm-1制备同实施例1步骤（1）。

（2）将磷酸三乙酯、乙醇和水按1:3:3摩尔比混合后，加入0.5%的氨水为催化剂调节体系pH = 9，于80^oC下水解24小时，得到充分水解的有机磷酸混合液A；将四水硝酸钙溶与六水硝酸镁按照摩尔比为95：5的比例溶解于无水乙醇，配成3mol/L的硝酸盐醇溶液B；按照钙磷摩尔比1.6，将硝酸盐醇溶液B滴加到磷酸三乙酯水解溶液A中，在4^oC搅拌混合2小时，得到初生溶胶溶液C；将初生溶胶置于-20^oC陈化7天后，按溶胶:水= 5:1的质量比配制纺丝液，加入聚乙烯吡咯烷酮（Mn=1,300,000）作为助纺剂，其浓度为4wt.%，混合均匀后经静电纺丝（环境温度40^oC，湿度低于30%，纺丝液

流速0.5ml/h，电压18kV，接收距离15cm）得到初生纳米纤维；将初生纳米纤维在700^oC烧结6小时，得到Mg²⁺掺杂的HA陶瓷纳米纤维。

（3）室温下，将4g的Gel-g-PNIPAAm-1溶于20ml去离子水配成20%水溶液，与1g Mg²⁺掺杂的HA陶瓷纳米纤维混合，得到可注射填充的液态修复材料，其在体温37^oC下迅速转变为凝胶态。

实施案例3

（1）将5g明胶溶于40ml去离子水，加入α-溴代异丁酸3.34g，加入1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺4.6g和N-羟基琥珀酰亚胺1.1g在40^oC反应24小时，经乙醇沉淀纯化得到溴化明胶；将溴化明胶2g溶于20ml二甲亚砜，加入N-异丙基丙烯酰胺20g，加入1,1,4,7,7甲基二亚乙基三胺400μl，通氮气除氧后加入溴化亚铜0.2g，在30^oC反应1小时；将反应混合液倾入去离子水中终止反应，采用过三氧化二铝色谱柱纯化除去溴化亚铜后，去离子水透析除去未反应N-异丙基丙烯酰胺和1,1,4,7,7甲基二亚乙基三胺，冷冻干燥后得到聚（N-异丙基丙烯酰胺）接枝明胶（Gel-g-PNIPAAm-2）。其水溶液的临界溶液温度（LCST）为34^oC。

（2）将磷酸三乙酯、乙醇和水按1:3:3摩尔比混合后，加入0.5%的氨水为催化剂调节体系pH = 9，于80^oC下水解24小时，得到充分水解的有机磷酸混合液A；将四水硝酸钙、六水硝酸锌、四水硝酸锶按照摩尔比为90：5：5的比例溶解于无水乙醇，配成3mol/L的硝酸盐醇溶液B；按照钙磷摩尔比1.4，将硝酸盐醇溶液B滴加到磷酸三乙酯水解溶液A中，在4^oC搅拌混合2小时，得到初生溶胶溶液C；将初生溶胶置于-20^oC陈化7天后，按溶胶:水= 5:1的质量比配制纺丝液，加入聚乙烯吡咯烷酮（Mn=1,300,000）作为助纺剂，其浓度为4wt.%，混合均匀后经静电纺丝（环境温度40^oC，湿度低于30%，纺丝液流速0.5ml/h，电压18kV，接收距离15cm）得到初生纳米纤维；将初生纳米纤维在1000^oC烧结6小时，得到的Zn²⁺和Sr²⁺共掺杂的HA-TCP复相磷酸钙陶瓷纳米纤维。

（3）室温下，将6g的Gel-g-PNIPAAm-2溶于20ml去离子水配成30%水溶液，与1g Zn²⁺和Sr²⁺共掺杂的HA-TCP复相磷酸钙陶瓷纳米纤维混合，得到可塑形填充的糊状修复材料，其在体温37^oC下的相转变使填充材料形态得以很好保持。

实施案例4

（1）Gel-g-PNIPAAm-2制备同实施例3步骤（1）。

（2）将磷酸三乙酯、乙醇和水按1:3:3摩尔比混合后，加入0.5%的氨水为催化剂调节体系pH = 9，于80^oC下水解24小时，得到充分水解的有机磷酸混合液A；将四水硝酸

钙、硝酸锌、硝酸锶按照摩尔比为90：5：5的比例溶解于无水乙醇，配成3mol/L的硝酸盐醇溶液B；按照钙磷摩尔比1.3，将硝酸盐醇溶液B滴加到磷酸三乙酯水解溶液A中，在4^oC搅拌混合2小时，得到初生溶胶溶液C；将初生溶胶置于-20^oC陈化7天后，按溶胶:水= 5:1的质量比配制纺丝液，加入聚乙烯吡咯烷酮（Mn=1,300,000）作为助纺剂，其浓度为4wt.%，混合均匀后经静电纺丝（环境温度40^oC，湿度低于30%，纺丝液流速0.5ml/h，电压18kV，接收距离15cm）得到初生纳米纤维；将初生纳米纤维在1100^oC烧结6小时，得到Zn²⁺和Sr²⁺共掺杂的的beta-TCP陶瓷纳米纤维。

（3）室温下，将6g的Gel-g-PNIPAAm溶于20ml去离子水配成30%水溶液，与1.5g的Zn²⁺和Sr²⁺共掺杂的的beta-TCP陶瓷纳米纤维混合，得到可塑形填充的膏状修复材料，其在体温37^oC下的相转变使填充材料形态得以很好保持。