一种双重靶向抑制肿瘤细胞和肿瘤血管且性质稳定的多肽的制作方法

本发明涉及蛋白质多肽领域，具体地讲，涉及一种靶向识别αvβ3和α5β1的小肽ERCP，该小肽在氨基端引入ω-氨基辛酸，性质非常稳定，兼具同时抑制肿瘤细胞和肿瘤新生血管的功能。

背景技术：

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病。据流行病学统计数据显示，我国癌症死亡率一直是位居十大死亡原因之首，据统计，全国每6分钟 就有一人被确诊为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每七到八个人中就有一人死于癌症，未来10年，中国癌症的发病率与死亡率仍将继续攀升。从“癌症县”到“癌症村”中国肿瘤发病的历史与地理坐标的背后是社会发展与生活方式数十年变迁带来的癌症高发态势。前卫生部部长陈竺于2010年8月18日发表声明，称癌症已经成为当今世界健康的最大威胁之一。在过去的30年里，中国的癌症发病率已经增长了80%。在2010年深圳举办的世界抗癌大会的开幕式上，陈竺部长表示，每年有260万中国人被诊断患有癌症，其中180万人是由于不良饮食造成的。2009年癌症已经成为全国因疾病死亡的第一大原因。最普遍发生的癌症有肺癌，肝癌，胃癌，食道癌，结肠癌和直肠癌。乳腺癌的发病率也呈增长趋势。其实，不光中国目前遭受癌症的困扰，一些发达国家同样受到癌症病的困扰，国际抗癌联盟发布的数据表明，世界范围内因癌症死亡的人数，比艾滋病、疟疾和结核病加起来还要多。如果不采取有效措施，预计到2030年，每年将出现2600万新增癌症病例，癌症死亡人数将达到1700万，中低收入国家将成为癌症肆虐的“重灾区”。过去30年，中国癌症死亡率增加了80%，每年因此去世的有180万人。

恶性肿瘤的危害主要在于其无限的增殖能力和强大的迁移能力。尽管医学科学的发展使临床治疗肿瘤的能力有了很大的提高，但肿瘤转移仍然是肿瘤临床治疗所面临的最严峻挑战。

肿瘤组织内的血管生成不仅为肿瘤生长提供了营养, 也为肿瘤细胞转移提供了通道。 在血管生成阶段, 血管生成依赖以前存在的血管芽扩展而形成, 内皮细胞必须相互粘附并与细胞外基质粘附以构建并扩充新生微血管,但是肿瘤生成的基底膜和血管内皮均有缺陷，肿瘤细胞极易穿越其基底膜屏障进入血液循环，进而向远端转移和扩散。转移的癌灶进一步诱导新生血管以满足其过度的增长需要，并在一定的情况下再度发生转移。从肿瘤转移过程可以看出，建立自身血管网络和诱导新生血管生成，是肿瘤增殖和转移的必备条件。一段时期，血管新生抑制疗法有望成为继化学疗法、放射治疗及外科手术以外，最具前瞻性的新一类疗法。

血管新生抑制疗法在动物实验中尽管显示了极大的优越性，但是多年的研究发现，有些因素限制了血管新生抑制剂的推广和应用，如以来源于蛇毒的Angiostatin 为例，它是目前被认为最强的血管生成抑制因子，具有高效抑制肿瘤新生血管形成、反复使用不出现耐药性等优点。但是，临床诊疗所需剂量很大，费用高昂，而且近年来发现其来源于蛇毒，免疫原性不容忽视。其次，血管生成抑制剂通常只能使肿瘤细胞处于蛰伏状态，并不直接杀死肿瘤细胞。而且抗肿瘤血管治疗虽然可以有效的减小肿瘤的体积，但是在肿瘤的边缘区域总会留下一些肿瘤细胞，这些肿瘤细胞可以从正常组织的血管获得营养。因此，单纯血管疗法的局限性显而易见。

整合素（Integrin）家族成员之一的αvβ3，在血管新生过程中扮演着重要角色。αvβ3在正常机体血管检测不到，等内皮细胞受到刺激活化时，则会大量表达，引发血管新生的信息传递与内皮细胞激活；除了在血管表面表达外，αvβ3在许多肿瘤细胞如结肠癌细胞、骨肉瘤细胞、黑色素瘤细胞等表面也有表达，在这些肿瘤细胞表面，还有α5β1受体大量表达。这些整合素可以被去整合素（Disintegrin）特异的超二级结构RGD（Arg-Gly-Asp）模体识别并结合，使得αvβ3、α5β1的功能被竞争性抑制。去整合素作用于血管表面αvβ3可以抑制肿瘤血管新生，还可以通过抑制肿瘤表面αvβ3受体，抑制肿瘤细胞增殖，引起肿瘤细胞的程序性死亡（apoptosis）凋亡。去整合素被视为一种具有双重功能的效应分子，它不仅能够抑制肿瘤血管新生，而且可以抑制和杀灭肿瘤细胞。这就可以解决以往单独运用血管新生抑制剂不能杀死肿瘤细胞的难题。近年来的研究发现，去整合素治疗肿瘤还存在一些问题，首先，整合素大多来自蛇毒，其免疫原性较大；二是去整合素可以识别多种不同的整合素，因此其作用广泛但不特异。近年来，本实验室将去整合素Echistatin的RGD膜体和C端融合，得到一种新的小肽ERC（N⁵），药效学研究证实了ERC（N⁵）的靶向高效性和低毒性，在药代动力学研究中发现ERC（N⁵）分子量小，半衰期短，在体内很不稳定，短时间内就会发生降解，影响了其抗肿瘤的作用。为了延长其半衰期，我们决定对ERC（N⁵）进行改造，将ERC（N⁵）第5，6个氨基酸进行突变，突变为W和P，并在其氨基端连接一个ω-氨基辛酸，将这种新的多肽命名为ERCP，这种设计方式不仅提高了其活性，而且极大的增强了其在体内的稳定性，从而充分发挥其靶向抑制肿瘤细胞和肿瘤新生血管的目的。

本发明的目的，在于提供一种性质稳定，能够靶向识别和抑制肿瘤细胞及肿瘤新生血管的多肽，从而克服现有抗肿瘤药物特异性弱，作用单一的缺点，也能克服小肽药物半衰期短，不稳定的问题，以期在临床治疗中发挥高效、特异的肿瘤抑制和杀灭作用。

技术实现要素：

本发明提供了一种全新的小分子多肽，它由RGD（Arg-Gly-Asp）和部分Echistatin 的C端序列组成。其突变后蛋白质一级结构为ωARGDWPPRNPHKGPAT(粗体、斜体表示突变后氨基酸序列)，并在Echistatin N末端添加ω-氨基辛酸，经过计算机模拟，该小分子多肽具有一定柔软空间构象，RGD模体和C端序列之间的距离接近于Echistatin结构中的RGD与C端的距离，理论上具备Echistatin和ERC（N⁵）相似的生物学活性，并且增加了ERC（N⁵）的稳定性。

改造后的多肽由RGD和Echistatin的部分C端结合，其氨基端为ω-氨基辛酸，其第五个氨基酸为W，引入W后使RGD结构更宽，更易于与αvβ3、α5β1结合。本发明将该多肽命名为ERCP。ERCP既保留了ERC（N5）特异性识别αvβ3、α5β1的优点，以较小的分子量降低了免疫原性，特别是能解决小肽稳定性差的问题。

本发明的要点之一在于，提供一种新的小分子多肽设计与合成，其氨基酸序列特征为：ωARGDWPPRNPHKGPAT，其名称为ERCP。

本发明还提供了ERCP多肽在恶性肿瘤增殖和转移的临床治疗中的应用。

发明优点：

本发明的优点与积极效果在于，利用化学合成或者基因工程与蛋白质工程技术，设计并制备了一种小分子多肽，所述多肽不仅具有其它血管生成抑制剂的抑制肿瘤功效，还具有杀灭肿瘤细胞的特异作用，而且性质稳定，有望成为一种新型靶向治疗恶性肿瘤的多肽药物。

附图说明：

图1－HepG2细胞生长曲线图

图2－HepG2细胞凋亡形态学观察

其中：A：HepG2细胞正常培养12小时；B：ERCP作用HepG2细胞12小时

图3－HepG2细胞经ERCP处理后细胞侵袭变化

其中：A：阴性对照组； B: ERCP处理组。

图4－HUVEC细胞凋亡形态学观察

其中：A：阴性对照组；B: ERCP处理组

图5－AO/EB染色检测细胞凋亡的形态学变化

其中： A：阴性对照组； B: ERCP处理组

图6－HUVEC细胞经ERCP处理后细胞侵袭变化

其中： A：阴性对照组； B: ERCP处理组

实施方案：

以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

<实施例1>： ERCP的化学合成

1、树脂溶胀

将Rink Amide-MBHA树脂和DCM(15ml/g)加入反应管，氮气振荡（20min）。继而滤掉DCM，加入4倍的Fmoc-Arg(Pbf)-OH氨基酸、HBTU，和10倍的DIEA，最后加入DMF溶解。室温下氮气震荡20min。滤掉DMF，用20%哌啶DMF溶液(15ml/g)震荡10min，滤掉哌啶，重复一次哌啶DMF震荡10min。滤掉哌啶，取树脂用乙醇过滤，并加入茚三酮、KCN、苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热10min颜色变蓝为止。最后可将反应管中的载体树脂分别用DMF、甲醇、DCM洗两次。将载体树脂上残余的哌啶洗掉。

2、缩合反应 重复1步骤，从右到左依次连接序列中的氨基酸。将树脂用DCM洗涤多次，真空抽干，向装有树脂的多肽固相反应器中缓慢加入切割液10ml/g( TFA 94%；H2O 2.5%；EDT 2.5%；TIS 1%)。恒温摇床震荡3h，用氮气去除大部分溶剂，向残液中加入无水乙醚呈现白色沉淀。离心去除杂质。将切割液用氮气尽量吹干，再用乙醚漂洗多次，常温挥发掉溶剂，得到ERCP粗品。经Ｃ18高效液相色谱法纯化得到ERCP纯品。

<实施例2>：ERCP抑制人肝癌HepG2细胞实验

1、不同培养时间对HepG2细胞增殖的影响

随着培养时间的延长，阴性组和ERCP处理组的OD值都减小。与实验组相比，阴性组细胞OD值变化幅度较小，见图1。

2、形态学变化

肝癌HepG2细胞在常规培养条件下，细胞延展，呈梭形，排列紧密。ERCP 作用细胞12小时后，细胞变圆，被膜突起，间隙增大，有细胞碎片出现。见图2。表明ERCP抑制了细胞的生长和发育，对HepG2细胞发挥了作用。

3、HepG2细胞发生侵袭作用

阴性对照组即细胞未经ERC(N⁵) 处理正常培养48小时后，细胞生长旺盛；HepG2细胞经ERCP处理48小时后，细胞崩解，破裂，细胞明显减少，见图3。

<实施例3>ERCP抑制人脐静脉内皮细胞实验：

1、HUVEC细胞形态的影响

HUVEC细胞在常规培养条件下，细胞延展，呈梭形，排列紧密；ERCP 作用24h后，细胞变圆，被膜突起，间隙增大，有细胞碎片出现，这些均为程序性细胞死亡的典型特征，见图4。

2、AO/EB染色检测细胞凋亡

通过荧光显微镜观察AO/EB染色后细胞的凋亡形态。HUVEC经过16μmol/L ERCP处理24h后可见不同的细胞形态。图4A中显示的核染色质全部为绿色，结构正常均为活细胞，图4B中显示核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状，为早期凋亡细胞；其中核染色质着橘红色并呈正常结构的为非凋亡的死亡细胞；核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状为晚期凋亡细胞。结果表明，ERCP处理后HUVEC细胞凋亡率为20.6%，ERCP可以诱导HUVEC细胞显著的凋亡形态学改变，见图5。

3、Transwell 侵袭实验

通过观察HUVEC细胞侵袭后Transwell 下室的细胞，图A表示阴性对照组，即细胞未经ERCP 处理，正常培养24小时后，侵袭后的状态；图B表示细胞经ERCP处理24小时后，细胞发生侵袭后的状态。虽然两组细胞均能穿过聚碳酸酯膜，但其数量明显不同，阴性对照组穿过的细胞数为（144±5.5）个，ERCP处理组穿过的细胞数为（18.8±3.0）个，侵袭抑制率为87%。ERCP 处理组与阴性组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

H2N(CH2)7—CO—Ala—Arg—Gly—Asp—Trp—Pro—Pro—Arg—Asn—Pro—His—Lys—Gly—Pro—Ala—Thr