本发明涉及蛋白酶抑制剂技术领域，尤其是涉及一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂及其应用。
背景技术：
曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)属于头足纲、乌贼目、乌贼科、无针乌贼属，一年生，具有很高的营养价值和药用价值，曾经是东海广泛分布的物种。但是，20世纪70年代末以来，产量连续降至最低水平，80年代中后期，浙江沿海渔场曼氏无针乌贼已经无法形成渔汛，并逐步绝迹。修复曼氏无针乌贼资源，逐步恢复我国四大海产工作本世纪初已开展。随着曼氏无针乌贼人工育苗技术的突破，曼氏无针乌贼的人工养殖业已快速发展。头足类动物的视腺(optic gland)是控制生殖系统成熟的视神经内分泌器官。类似于脊椎动物中存在的，由下丘脑神经元产生一种GnRH的神经肽并调节垂体—性腺轴，在章鱼中也有一个视腺—性腺轴的神经控制轴，视腺广泛存于头足类动物中，为一对位于视神经束的后缘的卵圆形器官。视腺在头足类生命周期中的作用类似于控制性发育的垂体的作用。视腺还调节卵巢中的蛋白质合成，刺激性腺的有丝分裂，影响交配行为、摄食和寿命。
人工养殖中，产卵量是检测养殖成果最为重要的指标之一。在曼氏无针乌贼性腺发育成熟后会进行交配、产卵，处在产卵期的曼氏无针乌贼同其他头足类一样，基本不再摄食，且日益消瘦，产卵后的雌性乌贼消瘦而虚弱，快速死亡，死亡的雌体卵巢中尚存留不少大小不等的未成熟卵子，目前有关曼氏无针乌贼快速死亡的原因尚无报道。经过本发明实验研究发现组织蛋白酶CTSD基因与物种免疫、发育和死亡有密切的关系，转录组数据分析发现在产卵中到产卵后死亡前的时期，曼氏无针乌贼视腺组织中的CTSD基因的表达量显著增加，另外利用RT-PCR 分析证明曼氏无针乌贼在产卵中和产卵后死亡前时期中CTSD基因表达量都是明显上调，所以在曼氏无针乌贼产卵后死亡视腺中的CTSD基因的过表达会导致曼氏无针乌贼在产卵中过早死亡，死亡的雌体卵巢中尚存留不少大小不等的未成熟卵子，使曼氏无针乌贼的产卵量较少。
技术实现要素：
本发明是为了克服现有技术曼氏无针乌贼过早死亡导致的产卵量较少的问题，提供一种能够延缓曼氏无针乌贼的死亡时间，增加其产卵量的CTSD组织蛋白酶抑制剂。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂，所述CTSD组织蛋白酶抑制剂从曼氏无针乌贼内脏组织中提取得到。
在实验研究过程中发现CTSD组织蛋白酶能够促进曼氏无针乌贼的死亡，导致其产卵量下降。
本发明从曼氏无针乌贼内脏组织中提取得到CTSD组织蛋白酶的抑制剂，在曼氏无针乌贼产卵后死亡前抑制视腺中的CTSD基因过表达，延缓曼氏无针乌贼的死亡时间，增加其产卵量。另外，本发明CTSD组织蛋白酶抑制剂是从曼氏无针乌贼内脏组织中提取的，绿色环保，节约生产成本。
作为优选，所述曼氏无针乌贼内脏组织中CTSD组织蛋白酶抑制剂的提取方法包括以下步骤：
（1）样品准备：取曼氏无针乌贼的内脏组织，经过液氮速冻，在-80~-70℃超低温冰箱保存待用；
（2）预处理：称取200~220g乌贼内脏组织用剪刀剪成小块，加入乌贼内脏组织4~6倍体积的20~22mmol/L Tris-HCl缓冲液，用组织捣碎机捣碎，加入离心机中，设置旋转离心力为12000~13000g，旋转离心时间为20~25min，再缓慢滴加1.9~2.1mol/L HCl调节pH至7.8~8.2，再次离心15-20min，设置旋转离心力为12000~13000g，取上清液；
（3）硫酸铵分级沉淀：在搅拌的条件下，向预处理过后乌贼内脏组织的上清液中缓慢加入固体硫酸铵，控制硫酸铵在上清液中的饱和度在30~35%，搅拌30~35min使固体硫酸铵充分溶解，然后静置1~2h，再将其放入离心机中离心30~40min，离心过程中控制旋转离心力在12000~13000g，取上清液，向上清液中加入固体硫酸铵至其饱和度在50~60%，静置2~3h，然后放入离心机中离心40~50min，弃上清液取沉淀，再向沉淀物中加入3~4mL摩尔浓度为20~22mmol/L Tris-HCl使其溶解，控制溶解液pH在7.8~8.2，然后将溶解后的样品放入干净的透析袋中透析，透析时间为18~24h，透析完成后将透析液放入离心机中离心20~25min，控制旋转离心力为12000~13000g，弃沉淀取上清液；
（4）层析：将透析后离心得到的上清液进行DEAE-Sepharose阴离子交换层析，测定柱层析不同组分的蛋白质对CTSD组织蛋白酶的抑制活性，收集抑制活性较高的蛋白质组分；
（5）浓缩：使用截留分子量为9.8-10.2kDa的超滤膜对CTSD组织蛋白酶抑制活性较高的蛋白质组分进行过滤浓缩，收集蛋白质组分浓缩液，得到CTSD组织蛋白酶抑制剂。
作为优选，所述步骤（4）中上清液进行DEAE-Sepharose阴离子交换层析的方法为：将透析后离心得到的上清液上样于DEAE-Sepharose阴离子交换柱中，然后使用20~22mmol/L Tris-HCl缓冲液进行流洗，除去未被交换柱吸附的杂质蛋白组分，对吸附的蛋白组分用浓度为0~0.5mol/L NaCl进行线性洗脱，洗脱流速控制在1~1.2mL/min，每管收集5~10mL，得到柱层析液。
作为优选，所述步骤（4）中，柱层析不同组分的蛋白质对CTSD组织蛋白酶的抑制活性的测定方法为荧光法。
一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂应用于增加曼氏无针乌贼产卵量。
因此，本发明具有如下有益效果：（1）延缓曼氏无针乌贼的死亡时间，增加其产卵量；（2）绿色环保，节约生产成本。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的，实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂，所述CTSD组织蛋白酶抑制剂从曼氏无针乌贼内脏组织中提取得到，所述曼氏无针乌贼内脏组织中CTSD组织蛋白酶抑制剂的提取方法包括以下步骤：
（1）样品准备：取曼氏无针乌贼的内脏组织，经过液氮速冻，在-80℃超低温冰箱保存待用；
（2）预处理：称取200g乌贼内脏组织用剪刀剪成小块，加入乌贼内脏组织4倍体积的20mmol/L Tris-HCl缓冲液，用组织捣碎机捣碎，加入离心机中，设置旋转离心力为12000g，旋转离心时间为20min，再缓慢滴加1.9mol/L HCl调节pH至7.8，再次离心15min，设置旋转离心力为12000g，取上清液；
（3）硫酸铵分级沉淀：在搅拌的条件下，向预处理过后乌贼内脏组织的上清液中缓慢加入固体硫酸铵，控制硫酸铵在上清液中的饱和度在30%，搅拌30min使固体硫酸铵充分溶解，然后静置1h，再将其放入离心机中离心30min，离心过程中控制旋转离心力在12000g，取上清液，向上清液中加入固体硫酸铵至其饱和度在50%，静置2h，然后放入离心机中离心40min，弃上清液取沉淀，再向沉淀物中加入3mL摩尔浓度为20mmol/L Tris-HCl使其溶解，控制溶解液pH在7.8，然后将溶解后的样品放入干净的透析袋中透析，透析时间为18h，透析完成后将透析液放入离心机中离心20min，控制旋转离心力为12000g，弃沉淀取上清液；
（4）层析：将透析后离心得到的上清液上样于DEAE-Sepharose阴离子交换柱中，然后使用20mmol/L Tris-HCl缓冲液进行流洗，除去未被交换柱吸附的杂质蛋白组分，每管收集5mL，得到柱层析液，使用荧光法测定柱层析不同组分的蛋白质对CTSD组织蛋白酶的抑制活性，收集抑制活性较高的蛋白质组分；
（5）浓缩：使用截留分子量为9.8kDa的超滤膜对CTSD组织蛋白酶抑制活性较高的蛋白质组分进行过滤浓缩，收集蛋白质组分浓缩液，得到CTSD组织蛋白酶抑制剂。
实施例2
一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂，所述CTSD组织蛋白酶抑制剂从曼氏无针乌贼内脏组织中提取得到，所述曼氏无针乌贼内脏组织中CTSD组织蛋白酶抑制剂的提取方法包括以下步骤：
（1）样品准备：取曼氏无针乌贼的内脏组织，经过液氮速冻，在-78℃超低温冰箱保存待用；
（2）预处理：称取205g乌贼内脏组织用剪刀剪成小块，加入乌贼内脏组织4.5倍体积的20mmol/L Tris-HCl缓冲液，用组织捣碎机捣碎，加入离心机中，设置旋转离心力为12200g，旋转离心时间为22min，再缓慢滴加1.9mol/L HCl调节pH至7.9，再次离心16min，设置旋转离心力为12200g，取上清液；
（3）硫酸铵分级沉淀：在搅拌的条件下，向预处理过后乌贼内脏组织的上清液中缓慢加入固体硫酸铵，控制硫酸铵在上清液中的饱和度在32%，搅拌31min使固体硫酸铵充分溶解，然后静置1.2h，再将其放入离心机中离心32min，离心过程中控制旋转离心力在12200g，取上清液，向上清液中加入固体硫酸铵至其饱和度在52%，静置2.2h，然后放入离心机中离心42min，弃上清液取沉淀，再向沉淀物中加入3.2mL摩尔浓度为20mmol/L Tris-HCl使其溶解，控制溶解液pH在7.9，然后将溶解后的样品放入干净的透析袋中透析，透析时间为19h，透析完成后将透析液放入离心机中离心22min，控制旋转离心力为12200g，弃沉淀取上清液；
（4）层析：将透析后离心得到的上清液上样于DEAE-Sepharose阴离子交换柱中，然后使用20mmol/L Tris-HCl缓冲液进行流洗，除去未被交换柱吸附的杂质蛋白组分，对吸附的蛋白组分用浓度为0.1mol/L NaCl进行线性洗脱，洗脱流速控制在1mL/min，每管收集6mL，得到柱层析液，使用荧光法测定柱层析不同组分的蛋白质对CTSD组织蛋白酶的抑制活性，收集抑制活性较高的蛋白质组分；
（5）浓缩：使用截留分子量为9.9kDa的超滤膜对CTSD组织蛋白酶抑制活性较高的蛋白质组分进行过滤浓缩，收集蛋白质组分浓缩液，得到CTSD组织蛋白酶抑制剂。
实施例3
一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂，所述CTSD组织蛋白酶抑制剂从曼氏无针乌贼内脏组织中提取得到，所述曼氏无针乌贼内脏组织中CTSD组织蛋白酶抑制剂的提取方法包括以下步骤：
（1）样品准备：取曼氏无针乌贼的内脏组织，经过液氮速冻，在-75℃超低温冰箱保存待用；
（2）预处理：称取210g乌贼内脏组织用剪刀剪成小块，加入乌贼内脏组织5倍体积的21mmol/L Tris-HCl缓冲液，用组织捣碎机捣碎，加入离心机中，设置旋转离心力为12500g，旋转离心时间为23min，再缓慢滴加2mol/L HCl调节pH至8，再次离心17min，设置旋转离心力为12500g，取上清液；
（3）硫酸铵分级沉淀：在搅拌的条件下，向预处理过后乌贼内脏组织的上清液中缓慢加入固体硫酸铵，控制硫酸铵在上清液中的饱和度在33%，搅拌32min使固体硫酸铵充分溶解，然后静置1.6h，再将其放入离心机中离心35min，离心过程中控制旋转离心力在12500g，取上清液，向上清液中加入固体硫酸铵至其饱和度在55%，静置2.6h，然后放入离心机中离心45min，弃上清液取沉淀，再向沉淀物中加入3.5mL摩尔浓度为21mmol/L Tris-HCl使其溶解，控制溶解液pH在8，然后将溶解后的样品放入干净的透析袋中透析，透析时间为20h，透析完成后将透析液放入离心机中离心23min，控制旋转离心力为12500g，弃沉淀取上清液；
（4）层析：将透析后离心得到的上清液上样于DEAE-Sepharose阴离子交换柱中，然后使用21mmol/L Tris-HCl缓冲液进行流洗，除去未被交换柱吸附的杂质蛋白组分，对吸附的蛋白组分用浓度为0.2mol/L NaCl进行线性洗脱，洗脱流速控制在1.1mL/min，每管收集7mL，得到柱层析液，使用荧光法测定柱层析不同组分的蛋白质对CTSD组织蛋白酶的抑制活性，收集抑制活性较高的蛋白质组分；
（5）浓缩：使用截留分子量为10kDa的超滤膜对CTSD组织蛋白酶抑制活性较高的蛋白质组分进行过滤浓缩，收集蛋白质组分浓缩液，得到CTSD组织蛋白酶抑制剂。
实施例4
一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂，所述CTSD组织蛋白酶抑制剂从曼氏无针乌贼内脏组织中提取得到，所述曼氏无针乌贼内脏组织中CTSD组织蛋白酶抑制剂的提取方法包括以下步骤：
（1）样品准备：取曼氏无针乌贼的内脏组织，经过液氮速冻，在-72℃超低温冰箱保存待用；
（2）预处理：称取215g乌贼内脏组织用剪刀剪成小块，加入乌贼内脏组织5.5倍体积的22mmol/L Tris-HCl缓冲液，用组织捣碎机捣碎，加入离心机中，设置旋转离心力为12800g，旋转离心时间为24min，再缓慢滴加2.1mol/L HCl调节pH至8.1，再次离心17min ，设置旋转离心力为12500g，取上清液；
（3）硫酸铵分级沉淀：在搅拌的条件下，向预处理过后乌贼内脏组织的上清液中缓慢加入固体硫酸铵，控制硫酸铵在上清液中的饱和度在34%，搅拌33min使固体硫酸铵充分溶解，然后静置1.8h，再将其放入离心机中离心38min，离心过程中控制旋转离心力在12800g，取上清液，向上清液中加入固体硫酸铵至其饱和度在58%，静置2.8h，然后放入离心机中离心47min，弃上清液取沉淀，再向沉淀物中加入3.7mL摩尔浓度为22mmol/L Tris-HCl使其溶解，控制溶解液pH在8.1，然后将溶解后的样品放入干净的透析袋中透析，透析时间为22h，透析完成后将透析液放入离心机中离心24min，控制旋转离心力为12800g，弃沉淀取上清液；
（4）层析：将透析后离心得到的上清液上样于DEAE-Sepharose阴离子交换柱中，然后使用22mmol/L Tris-HCl缓冲液进行流洗，除去未被交换柱吸附的杂质蛋白组分，对吸附的蛋白组分用浓度为0.3mol/L NaCl进行线性洗脱，洗脱流速控制在1.2mL/min，每管收集8mL，得到柱层析液，使用荧光法测定柱层析不同组分的蛋白质对CTSD组织蛋白酶的抑制活性，收集抑制活性较高的蛋白质组分；
（5）浓缩：使用截留分子量为10.1kDa的超滤膜对CTSD组织蛋白酶抑制活性较高的蛋白质组分进行过滤浓缩，收集蛋白质组分浓缩液，得到CTSD组织蛋白酶抑制剂。
实施例5
一种曼氏无针乌贼CTSD组织蛋白酶抑制剂，所述CTSD组织蛋白酶抑制剂从曼氏无针乌贼内脏组织中提取得到，所述曼氏无针乌贼内脏组织中CTSD组织蛋白酶抑制剂的提取方法包括以下步骤：
（1）样品准备：取曼氏无针乌贼的内脏组织，经过液氮速冻，在-70℃超低温冰箱保存待用；
（2）预处理：称取220g乌贼内脏组织用剪刀剪成小块，加入乌贼内脏组织6倍体积的22mmol/L Tris-HCl缓冲液，用组织捣碎机捣碎，加入离心机中，设置旋转离心力为13000g，旋转离心时间为25min，再缓慢滴加2.1mol/L HCl调节pH至8.2，再次离心20min，设置旋转离心力为13000g，取上清液；
（3）硫酸铵分级沉淀：在搅拌的条件下，向预处理过后乌贼内脏组织的上清液中缓慢加入固体硫酸铵，控制硫酸铵在上清液中的饱和度在35%，搅拌35min使固体硫酸铵充分溶解，然后静置2h，再将其放入离心机中离心40min，离心过程中控制旋转离心力在13000g，取上清液，向上清液中加入固体硫酸铵至其饱和度在60%，静置3h，然后放入离心机中离心50min，弃上清液取沉淀，再向沉淀物中加入4mL摩尔浓度为22mmol/L Tris-HCl使其溶解，控制溶解液pH在8.2，然后将溶解后的样品放入干净的透析袋中透析，透析时间为24h，透析完成后将透析液放入离心机中离心25min，控制旋转离心力为13000g，弃沉淀取上清液；
（4）层析：将透析后离心得到的上清液上样于DEAE-Sepharose阴离子交换柱中，然后使用22mmol/L Tris-HCl缓冲液进行流洗，除去未被交换柱吸附的杂质蛋白组分，对吸附的蛋白组分用浓度为0.5mol/L NaCl进行线性洗脱，洗脱流速控制在1.2mL/min，每管收集10mL，得到柱层析液，使用荧光法测定柱层析不同组分的蛋白质对CTSD组织蛋白酶的抑制活性，收集抑制活性较高的蛋白质组分；
（5）浓缩：使用截留分子量为10.2kDa的超滤膜对CTSD组织蛋白酶抑制活性较高的蛋白质组分进行过滤浓缩，收集蛋白质组分浓缩液，得到CTSD组织蛋白酶抑制剂。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。