本发明涉及一种虫草子座的人工培育方法，具体涉及一种雪峰虫草子座及其人工培育方法。
背景技术：
雪峰虫草为线虫草菌科真菌雪峰虫草菌ophiocordycepsxuefengensist.c.wen,r.c.zhu,j.c.kang&k.d.hyde，寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体或充满菌丝的干燥幼虫尸体(菌核体)，主要分布于湖南省洞口县、隆回县，生长于海拔300～1000m的植物马鞭草科大青clerodendrumcyrtophyllumturcz.的近地面根或茎中。雪峰虫草具有补肺益肾、止咳化痰的功效，主治肾虚精亏、阳痿遗精、腰膝酸痛、久咳虚喘等症。现代科学研究表明，虫草中的许多种类都含有对人体有益的营养成分及其虫草素、虫草酸、腺苷等各种有效成分，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化和提高免疫力等多种功效，尤其以冬虫夏草、蛹虫草最为著名。
但由于野生虫草连年采挖，其生态环境不断遭受破坏等原因，造成虫草数量和质量大幅度下降，货源稀缺，价格昂贵，远远不能满足市场日益增长的需求。与冬虫夏草相比，雪峰虫草其寄主为同科不同属昆虫的幼虫，具有相同的腺苷、虫草素、甘露醇、氨基酸等化学成分及类似的功效，具有与冬虫夏草类似的功效及较强的免疫调节功能和防癌抗癌作用。雪峰虫草在湖南雪峰山区被长期当成名贵中药冬虫夏草的替代品来使用，效果极佳，目前售价约每克20美元。它也是世界上目前发现的最大的虫草。因此，对雪峰虫草的野生驯化与人工培育技术研究具有十分重要的意义。
技术实现要素：
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种雪峰虫草子座及其人工培育方法。
本发明以2014年6月从湖南洞口县野外调查发现的一种野生虫草子座为材料通过分离纯化，首次获得了一种虫草菌株，将该菌株接入培养基制备斜面母种，斜面母种再接至液体培养基中制备一级菌种，一级菌种接入液体培养基中制备生产种，生产菌种接种在生产用培养基中经过培育获得了一种人工栽培虫草子座，从而实现了本发明的目的。
上述野生虫草的子座特征是：子座无分枝，多弯曲，长14～46cm，直径2～7mm，常圆柱形，黄棕色至锈褐色；头部与柄无明显分界，顶部呈尖状或圆钝。
本发明从上述野生虫草分离获得的雪峰虫草已于2015年08月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.11107；分类命名：雪峰虫草菌ophiocordycepsxuefengensis。
本发明所述的雪峰虫草的纯分离物(菌株)在斜面培养基上，基生菌丝发达，气生菌丝较少。
本发明提出一种雪峰虫草子座，其特征是由雪峰虫草菌或其新鲜子座进行组织分离后人工培育获得的，该子座稍圆柱状，顶部常见尖状或圆钝，不分枝或顶部有短分枝，浅暗黄褐色。所述的新鲜子座是野生的或由人工培育成功后获得的。
本发明提供的一种雪峰虫草子座的人工培育方法，其特征在于：方法步骤如下：
1)母种的制备：雪峰虫草菌或野生子座或培育成功后获得的子座进行组织分离，取子座2～4mm长度的接种量接入斜面培养基，25～28℃，空气相对湿度60～90％，暗培养15～25天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为母种，所述斜面培养基的原料组成为每1000ml培养基中加入200g马铃薯的滤液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，琼脂15-20g和余量的水；
2)二级母种的制备：将步骤1)得到的所述母种按黄豆大小的菌块接入斜面培养基中继续培养或复壮，于25～28℃，空气相对湿度60～90％时，暗培养15～30天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为二级母种；
3)一级菌种的制备：将步骤2)得到二级母种按每100ml培养基接入1～2块黄豆大小的菌块的接种量接种至液体培养基中，于25～28℃，以130～150r/min的转速震荡培养13～20天，挑选菌丝球大小均匀一致、直径为2～3mm的菌种作为一级菌种；
4)生产种的制备：将步骤3)得到一级菌种按液体培养基体积5～10％的接种量接入液体培养基中，于25～28℃，以130～150r/min的转速震荡培养7～10天，挑选菌丝球大小均匀一致、直径为2～3mm的菌种作为生产种，所述的液体培养基与步骤3)的培养基相同；
5)雪峰虫草子座的制备：在无菌环境条件下，将步骤4)得到的生产种用无菌水稀释到5倍，再按每1l生产种接种到3～6kg生产用培养基的比例进行接种，在20～25℃，空气相对湿度60～90％时，暗培养18～23天，至菌丝长满培养基，再在5～10℃12h，20～25℃12h，避光条件下，长出子座，转入20～25℃弱光培养培养60～90天，至子座长至8～12cm，即可采收，得到雪峰虫草子座。
优选地，步骤1)中所述斜面培养基的制备方法是按原料组成分别称量各组分后，把马铃薯去皮切小长条，加水煮沸20～30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用3～4层纱布过滤，滤液在加热状态下与其余组分混合搅拌均匀，趁热装于试管灭菌后，待冷却至40℃制成斜面，所述斜面培养基ph6.5～7.0。
优选地，步骤3)所述的液体培养基的原料组成为每1000ml培养基中含200g马铃薯的滤液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g和余量的水，所述的液体培养基ph6.5～7.0。
优选地，步骤5)所述的生产用培养基的原料组成为每1kg大米配200～300g蚕蛹粉和2～3l液体培养基，所述的生产用培养基ph6.5～7.0。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果在于：
一、操作简单，取材方便，利用人工培养基培育雪峰虫草子座，脱离自然的束缚，不需要大规模的栽植大青，养殖疖蝙蛾幼虫。
二、试验成本低，试验重现性好，人工培育基的材料主要是大米、营养液和蚕蛹粉，价格较低，且可周年生产，便于规模化培育。
三、雪峰虫草的条件生长均一，可提高雪峰虫草的品质，用人工培育的雪峰虫草子座其生长条件一直，外观品质均一，其腺苷、甘露醇和多糖含量等符合冬虫夏草的药典标准。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
原料来源说明：本发明所用大米、马铃薯购自农贸市场，蛋白胨购自广东环凯微生物科技有限公司，蔗糖、kno3、kh2po4、mgso4·7h2o、琼脂均购自国药集团化学试剂有限公司。
实施例1
一种雪峰虫草子座，稍圆柱状，顶部常见尖状或圆钝，不分枝或顶部有短分枝，浅暗黄褐色。
一种雪峰虫草子座的人工培育方法，方法步骤如下：
1)母种的制备：对雪峰虫草菌进行组织分离，取子座2mm长度的接种量接入斜面培养基，于25℃，空气相对湿度60％，暗培养15天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为母种。
斜面培养基的制备：每1000ml培养基中加入200g马铃薯的滤液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，琼脂15g和余量的水。将马铃薯去皮切小长条，加水煮沸20分钟左右至马铃薯软而不烂时，用3层纱布过滤，滤液于烧杯中，加入琼脂，再加入蔗糖，蛋白胨，kno3，kh2po4，mgso4·7h2o和水在加热状态下混合搅拌均匀，趁热按5ml/管的量分装于试管里，塞上橡胶塞，包上牛皮纸或报纸，于121℃、0.1mpa条件下灭菌30分钟，待冷却至40℃制成斜面，斜面培养基ph6.5。
2)二级母种的制备：将步骤1)得到的所述母种按黄豆大小的菌块接入斜面培养基中继续培养或复壮，于25℃，空气相对湿度60％时，暗培养15天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为二级母种；
3)一级菌种的制备：将步骤2)得到二级母种按每100ml培养基接入1块黄豆大小的菌块的接种量接种至液体培养基中，于25℃，以130r/min的转速震荡培养13天，挑选菌丝球大小均匀一致、直径为2mm的菌种作为一级菌种；
液体培养基的原料组成为每1000ml培养基中含200g马铃薯的滤液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g和余量的水，液体培养基ph6.5。
4)生产种的制备：将步骤3)得到一级菌种按液体培养基体积5％的接种量接入液体培养基中，于25℃，以130r/min的转速震荡培养7天，挑选菌丝球大小均匀一致、直径为2mm的菌种作为生产种，所述的液体培养基与步骤3)的培养基相同；
5)雪峰虫草子座的制备：在无菌环境条件下，将步骤4)得到的生产种用无菌水稀释到5倍，再按每1l生产种接种到3kg生产用培养基的比例进行接种，在20℃，空气相对湿度60％时，暗培养20天，至菌丝长满培养基，再在5℃12h，20℃12h，避光条件下，长出子座，转入22℃弱光培养培养60天，至子座长至10cm，即可采收，得到雪峰虫草子座。
生产用培养基的原料组成为1kg大米、200g蚕蛹粉和2l液体培养基，混合，121℃灭菌30分钟，冷却至室温，得到生产用培养基。生产用培养基ph6.5。
实施例2
一种雪峰虫草子座，稍圆柱状，顶部常见尖状或圆钝，不分枝或顶部有短分枝，浅暗黄褐色。
一种雪峰虫草子座的人工培育方法，方法步骤如下：
1)母种的制备：对雪峰虫草菌进行组织分离，取子座3mm长度的接种量接入斜面培养基，于28℃，空气相对湿度90％，暗培养25天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为母种。
斜面培养基的制备：每1000ml培养基中加入200g马铃薯的滤液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，琼脂20g和余量的水。将马铃薯去皮切小长条，加水煮沸20分钟左右至马铃薯软而不烂时，用3层纱布过滤，滤液于烧杯中，加入琼脂，再加入蔗糖，蛋白胨，kno3，kh2po4，mgso4·7h2o和水在加热状态下混合搅拌均匀，趁热按5ml/管的量分装于试管里，塞上橡胶塞，包上牛皮纸或报纸，于121℃、0.1mpa条件下灭菌30分钟，待冷却至40℃制成斜面，斜面培养基ph7.0。
2)二级母种的制备：将步骤1)得到的所述母种按黄豆大小的菌块接入斜面培养基中继续培养或复壮，于28℃，空气相对湿度90％时，暗培养25天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为二级母种；
3)一级菌种的制备：将步骤2)得到二级母种按每100ml培养基接入1块黄豆大小的菌块的接种量接种至液体培养基中，于28℃，以150r/min的转速震荡培养20天，挑选菌丝球大小均匀一致、直径为3mm的菌种作为一级菌种；
液体培养基的原料组成为每1000ml培养基中含200g马铃薯的滤液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g和余量的水，液体培养基ph6.5。
4)生产种的制备：将步骤3)得到一级菌种按液体培养基体积10％的接种量接入液体培养基中，于28℃，以150r/min的转速震荡培养7天，挑选菌丝球大小均匀一致、直径为3mm的菌种作为生产种，所述的液体培养基与步骤3)的培养基相同；
5)雪峰虫草子座的制备：在无菌环境条件下，将步骤4)得到的生产种用无菌水稀释到5倍，再按每1l生产种接种到5kg生产用培养基的比例进行接种，在20℃，空气相对湿度90％时，暗培养18天，至菌丝长满培养基，再在5℃12h，25℃12h，避光条件下，长出子座，转入25℃弱光培养培养60天，至子座长至10cm，即可采收，得到雪峰虫草子座。
生产用培养基的原料组成为1kg大米、250g蚕蛹粉和2.5l液体培养基，混合，121℃灭菌30分钟，冷却至室温，得到生产用培养基。生产用培养基ph7.0。
实施例3
一种雪峰虫草子座，稍圆柱状，顶部常见尖状或圆钝，不分枝或顶部有短分枝，浅暗黄褐色。
一种雪峰虫草子座的人工培育方法，方法步骤如下：
1)母种的制备：对野生子座进行组织分离，取子座2mm长度的接种量接入斜面培养基，于26℃，空气相对湿度68％，暗培养17天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为母种。
斜面培养基的制备：每1000ml培养基中加入200g马铃薯的滤液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，琼脂16g和余量的水。将马铃薯去皮切小长条，加水煮沸22分钟左右至马铃薯软而不烂时，用3层纱布过滤，滤液于烧杯中，加入琼脂，再加入蔗糖，蛋白胨，kno3，kh2po4，mgso4·7h2o和水在加热状态下混合搅拌均匀，趁热按5ml/管的量分装于试管里，塞上橡胶塞，包上牛皮纸或报纸，于121℃、0.1mpa条件下灭菌30分钟，待冷却至40℃制成斜面，斜面培养基ph7.0。
2)二级母种的制备：将步骤1)得到的所述母种按黄豆大小的菌块接入斜面培养基中继续培养或复壮，于26℃，空气相对湿度75％时，暗培养22天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为二级母种；
3)一级菌种的制备：将步骤2)得到二级母种按每100ml培养基接入2块黄豆大小的菌块的接种量接种至液体培养基中，于26℃，以140r/min的转速震荡培养16天，挑选菌丝球大小均匀一致、直径为2mm的菌种作为一级菌种；
液体培养基的原料组成为每1000ml培养基中含200g马铃薯的滤液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g和余量的水，液体培养基ph7.0。
4)生产种的制备：将步骤3)得到一级菌种按液体培养基体积6％的接种量接入液体培养基中，于26℃，以140r/min的转速震荡培养8天，挑选菌丝球大小均匀一致、直径为2mm的菌种作为生产种，所述的液体培养基与步骤3)的培养基相同；
5)雪峰虫草子座的制备：在无菌环境条件下，将步骤4)得到的生产种用无菌水稀释到5倍，再按每1l生产种接种到4.5kg生产用培养基的比例进行接种，在22℃，空气相对湿度82％时，暗培养19天，至菌丝长满培养基，再在10℃12h，20℃12h，避光条件下，长出子座，转入22℃弱光培养培养70天，至子座长至12cm，即可采收，得到雪峰虫草子座。
生产用培养基的原料组成为1kg大米、300g蚕蛹粉和3l液体培养基，混合，121℃灭菌30分钟，冷却至室温，得到生产用培养基。生产用培养基ph7.0。
实施例4
一种雪峰虫草子座，稍圆柱状，顶部常见尖状或圆钝，不分枝或顶部有短分枝，浅暗黄褐色。
一种雪峰虫草子座的人工培育方法，方法步骤如下：
1)母种的制备：对培育成功后获得的子座进行组织分离，取子座3mm长度的接种量接入斜面培养基，于27℃，空气相对湿度75％，暗培养18天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为母种。
斜面培养基的制备：每1000ml培养基中加入200g马铃薯的滤液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，琼脂17g和余量的水。将马铃薯去皮切小长条，加水煮沸25分钟左右至马铃薯软而不烂时，用4层纱布过滤，滤液于烧杯中，加入琼脂，再加入蔗糖，蛋白胨，kno3，kh2po4，mgso4·7h2o和水在加热状态下混合搅拌均匀，趁热按5ml/管的量分装于试管里，塞上橡胶塞，包上牛皮纸或报纸，于121℃、0.1mpa条件下灭菌30分钟，待冷却至40℃制成斜面，斜面培养基ph6.5。
2)二级母种的制备：将步骤1)得到的所述母种按黄豆大小的菌块接入斜面培养基中继续培养或复壮，于27℃，空气相对湿度68％时，暗培养18天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为二级母种；
3)一级菌种的制备：将步骤2)得到二级母种按每100ml培养基接入1块黄豆大小的菌块的接种量接种至液体培养基中，于26℃，以135r/min的转速震荡培养17天，挑选菌丝球大小均匀一致、直径为3mm的菌种作为一级菌种；
液体培养基的原料组成为每1000ml培养基中含200g马铃薯的滤液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g和余量的水，液体培养基ph6.6。
4)生产种的制备：将步骤3)得到一级菌种按液体培养基体积7％的接种量接入液体培养基中，于27℃，以135r/min的转速震荡培养9天，挑选菌丝球大小均匀一致、直径为2mm的菌种作为生产种，所述的液体培养基与步骤3)的培养基相同；
5)雪峰虫草子座的制备：在无菌环境条件下，将步骤4)得到的生产种用无菌水稀释到5倍，再按每1l生产种接种到4kg生产用培养基的比例进行接种，在22℃，空气相对湿度68％时，暗培养21天，至菌丝长满培养基，再在10℃12h，25℃12h，避光条件下，长出子座，转入22℃弱光培养培养90天，至子座长至10cm，即可采收，得到雪峰虫草子座。
生产用培养基的原料组成为1kg大米、300g蚕蛹粉和3l液体培养基，混合，121℃灭菌30分钟，冷却至室温，得到生产用培养基。生产用培养基ph6.5。
实施例5
一种雪峰虫草子座，稍圆柱状，顶部常见尖状或圆钝，不分枝或顶部有短分枝，浅暗黄褐色。
一种雪峰虫草子座的人工培育方法，方法步骤如下：
1)母种的制备：对野生子座进行组织分离，取子座4mm长度的接种量接入斜面培养基，于28℃，空气相对湿度82％，暗培养20天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为母种。
斜面培养基的制备：每1000ml培养基中加入200g马铃薯的滤液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，琼脂18g和余量的水。将马铃薯去皮切小长条，加水煮沸30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用4层纱布过滤，滤液于烧杯中，加入琼脂，再加入蔗糖，蛋白胨，kno3，kh2po4，mgso4·7h2o和水在加热状态下混合搅拌均匀，趁热按5ml/管的量分装于试管里，塞上橡胶塞，包上牛皮纸或报纸，于121℃、0.1mpa条件下灭菌30分钟，待冷却至40℃制成斜面，斜面培养基ph6.7。
2)二级母种的制备：将步骤1)得到的所述母种按黄豆大小的菌块接入斜面培养基中继续培养或复壮，于26℃，空气相对湿度82％时，暗培养27天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为二级母种；
3)一级菌种的制备：将步骤2)得到二级母种按每100ml培养基接入1块黄豆大小的菌块的接种量接种至液体培养基中，于25℃，以145r/min的转速震荡培养19天，挑选菌丝球大小均匀一致、直径为2mm的菌种作为一级菌种；
液体培养基的原料组成为每1000ml培养基中含200g马铃薯的滤液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g和余量的水，液体培养基ph6.7。
4)生产种的制备：将步骤3)得到一级菌种按液体培养基体积8％的接种量接入液体培养基中，于25℃，以145r/min的转速震荡培养10天，挑选菌丝球大小均匀一致、直径为2mm的菌种作为生产种，所述的液体培养基与步骤3)的培养基相同；
5)雪峰虫草子座的制备：在无菌环境条件下，将步骤4)得到的生产种用无菌水稀释到5倍，再按每1l生产种接种到6kg生产用培养基的比例进行接种，在25℃，空气相对湿度75％时，暗培养23天，至菌丝长满培养基，再在7℃12h，22℃12h，避光条件下，长出子座，转入20℃弱光培养培养75天，至子座长至8cm，即可采收，得到雪峰虫草子座。
生产用培养基的原料组成为1kg大米、280g蚕蛹粉和2.8l液体培养基，混合，121℃灭菌30分钟，冷却至室温，得到生产用培养基。生产用培养基ph6.7。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。