专利名称：樟芝子实体三萜类组合物、制备与分析方法
技术领域：
本申请涉及一种樟芝子实体组合物，本申请尤其涉及一种樟芝子实体三萜类组合物，以及该三萜类组合物的制备方法与分析方法。
背景技术：
樟芝(Androdia cinnamomea)又称樟燕、牛樟燕、牛樟芝等,为台湾特有的真菌菌种，生长于海拔400至2000公尺特有的牛樟树(Cinnamomum kanehirai)树干腐朽的心材内壁，或枯死倒伏的牛樟木材阴暗潮湿的表面。因此，要寻找到野生的樟芝子实体(fruitingbody)或确认此多孔菌目(Aphyllophorales)真菌菌株的外观并不容易，也由于其生物活性成分具潜在的医药价值，因此樟芝的价格居高不下。由于樟芝子实体不易被发现和以人工方式培养，因此目前市面上多为樟芝菌丝体(mycelia)产品，其宣称具有抗癌、减少治疗引起的症状及其他副作用。此外，樟芝菌丝体产品也被发现具有抗氧化、抗过敏、免疫刺激效果(Liu等人，2007)。这些产品宣称具有与樟芝子实体相似的主要成分，包括具有细胞毒性的三職类(triterpenes)、类固醇(steroid)及具有免疫刺激性的多糖体等(Chen等人，1995 ；Yang等人，1996)。传统上，樟芝被应用于健康食品，以避免发炎、过敏、皮肤癣、肝癌的发生，因此，樟芝菌丝体及子实体萃取物被认为是具有潜力的化学治疗药物，以对抗肝癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌细胞等(Chen 等人,2007 ;Hsu 等人,2007 ;Peng 等人,2007 ;Shetty 等人,2005 ；ffu等人，2006)，但各类有效成分的活性机制与抑制癌症能力并未被完整理清及探讨。此外，中华民国专利号1299665揭露了樟芝萃取物及其制备方法，其以乙醇萃取樟芝菌丝体获得多糖体，用以抑制基质金属蛋白酶的活性，但并非以樟芝子实体进行萃取，其产物也未能抑制癌细胞的生长；中华民国专利号1279439揭露了以樟芝菌丝体进行培养，通过调整培养时的酸碱值获得培养物，并未揭露萃取方法；而中华民国专利号591110揭露了由樟芝菌丝体萃取出Y -氨基丁酸，其先冷冻干燥樟芝菌丝体，再以水或有机溶剂萃取。上述这些发明都没有以樟芝子实体进行有机溶剂或水萃取，而且未鉴定出其所内含的指标性二次代谢化合物。再者，前述发明也并未公开樟芝子实体所含有的三萜类组合物或其他组成份。本申请的申请人鉴于现有技术中的不足，经过悉心试验与研究，并本着锲而不舍的精神，最终构思出本申请“樟芝子实体三萜类组合物、制备与分析方法”，能够克服现有技术的不足，以下为本申请的简要说明。
发明内容
为了克服现有技术无法有效分离樟芝子实体(或菌丝体)或樟芝萃取物中的组合物，并确定该组合物的立体结构的问题，本发明以高效液相色谱及核磁共振图谱等技术分离、纯化、解析出樟芝子实体中麦角留烧(ergostane)及羊毛留烧(Ianostane)三職类组合物，及它们的立体结构式和含量。通过现有技术，可以检测药品、保健食品或其他商品中是否含有麦角留烷及羊毛留烷三萜类组合物，及它们的含量。 本发明提供一种药物组合物，其包括如下文所揭示的有效剂量的式I 式VI及式VIII 式IX中的一种的麦角留烷三萜类组合物。而麦角留烷三萜类组合物是从樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物(以下简称乙酸乙酯萃取物)中分离。为了得到乙酸乙酯萃取物，以乙醇溶液、正己烷溶液及乙酸乙酯溶液依次对樟芝子实体进行萃取。麦角留烷三萜类组合物经实验证实具有杀死血癌细胞的活性。本发明另提供一种制备麦角留烷三萜类组合物的方法，其对乙酸乙酯萃取物进行层析，获得麦角留烷三萜类组合物，其中该麦角留烷三萜类组合物包括下文揭示的式I至式X的组合物(或称为立体异构体纯的化合物)。进一步而言，该层析步骤还包括使用高效液相色谱柱，在流动相溶剂为乙腈与含酸水的条件下分离麦角留烷三萜类组合物，获得麦角留烷三萜类组合物的立体异构体纯的化合物。此外，该层析步骤还可获得羊毛留烷三萜类组合物。麦角留烷三萜类组合物包括樟芝酸A、樟芝酸B、樟芝酸C、antcin A、antcin C和/或antcin K,而羊毛甾烧三職类组合物包括下文所揭示的去氢硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenic acid,式XI)、硫色多孔菌酸(sulphurenic acid,式XII) >15 α -乙酰基-去氢硫色多孔菌酸(15a-acetyl-dehydrosulphurenic acid,式 XIII)、变孑L孑L菌酸(versisponic acid D,式 XIV)、去氢齿孔酸(dehydroeburicoic acid,式 XV)和 / 或齿孔酸(eburicoic acid,式XVI)。本发明另提供一种方法，用以检测樟芝子实体中至少一种麦角留烷三萜类立体异构体纯的化合物的含量，该方法包括下列步骤萃取樟芝子实体，获得乙酸乙酯萃取物，以1H核磁共振图谱仪检测乙酸乙酯萃取物，确定乙酸乙酯萃取物中是否具有至少一种麦角甾烷三萜类组合物。当出现该至少一种麦角留烷三萜类组合物时，以高效液相色谱仪检测乙酸乙酯萃取物中该至少一种麦角留烷三萜类立体异构体纯的化合物的含量。进一步而言，前述检测步骤还包括以1H核磁共振图谱仪检测该至少一种麦角甾烷三萜类组合物的28位的亚甲基信号。再者，该检测方法还用以同时检测樟芝子实体中至少一羊毛留烷三萜类组合物的含量，包括步骤以1H核磁共振图谱仪检测乙酸乙酯萃取物，确定该至少一种羊毛留烷三萜类组合物是否出现；以及当出现该至少一羊毛留烷三萜类组合物时，以高效液相色谱仪检测该至少一种羊毛留烷三萜类组合物的含量。1H核磁共振图谱仪的检测是检测该至少一种羊毛留烷三萜类组合物的28位的亚甲基信号。而高效液相色谱仪包括使用全波长检测器、单波长检测器和/或串联质谱仪所组合的检测器。本发明另提供一种分离化合物的立体异构体的方法，该化合物的羧基的α位置具有不对称中心，该方法包括计算化合物的PKa值(表示为a值)；调整分离溶媒的pH值为b值，该b值之范围为a-1. 5彡b彡a+1. 5，且I. O彡b < 7 ;以及以该分离溶媒层析该化合物，以分离出该化合物中的立体异构体。本发明另提出一种检测待测萃取物中麦角留烷三萜类组合物的方法，包括下列步骤以樟芝酸A的不同浓度样本为标准品制作核磁共振图谱及检量线；以核磁共振图谱仪分析待测萃取物中麦角留烷三萜类组合物的28位的亚甲基信号；以及比对检量线及28位的亚甲基信号，由28位的亚甲基信号的积分面积比计算待测萃取物中麦角留烷三萜类组合物的含量。参照前述检测方法，本发明另提出一种检测待测萃取物中羊毛留烷三萜类组合物的方法，包括下列步骤以去氢齿孔酸的不同浓度样本为标准品制作核磁共振图谱及检量线；以核磁共振图谱 仪分析待测萃取物中羊毛留烷三萜类组合物的28位的亚甲基信号；以及比对检量线及28位的亚甲基信号，由28位的亚甲基信号的积分面积比计算待测萃取物中羊毛留烷三萜类组合物的含量。本发明另提出一种分析樟芝子实体中麦角留烷三萜类立体异构体纯的化合物的方法，包括步骤以高效液相色谱柱层析乙酸乙酯萃取物，以分离出立体异构体混合物；以及依据麦角留烷三萜类立体异构体纯的化合物的1H核磁共振图谱、高效液相色谱柱层析的保留时间及旋光数据来判断麦角留烷三萜类立体异构体纯的化合物的25位在结构上为R构型或S构型。
图I为本发明的樟芝子实体乙酸乙酯萃取物的制备方法流程图。图2为樟芝酸A立体异构体混合物的高效液相色谱的再循环色谱图谱。图3为从樟芝酸A立体异构体混合物分离取得的纯的化合物E9以及化合物ElO的色谱图谱。图4为自antcin C立体异构体混合物分离取得纯的化合物E3以及化合物E4的色谱图谱。图5为自樟芝酸C立体异构体混合物分离取得纯的化合物E5以及化合物E6的色谱图谱。图6 (a)至图6 (c)分别为(a)樟芝酸A、(b)化合物E9及(C)化合物ElO溶于C5D5N在600MHz的1H核磁共振图谱。图7 (a)至图7 (c)分别为(a)樟芝酸A、(b)化合物E9及(C)化合物ElO溶于C5D5N在150MHz的13C核磁共振图谱。图8(a)与图8(b)分别为(a)酯类合成化合物E9-1RAT及(b)酯类合成化合物E9-1SAT的化学结构示意图。图9为依据麦角甾烷三萜类(IR)-及(1S)-1_(9-蒽基)-2，2，2_三氟乙醇酯类合成物的1H核磁共振化学位移的差值判定的结构25位的绝对立体构型的示意图。图10为樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物于不同有机酸(O. 1%的三氟乙酸、O. 1%的甲酸以及O. 1%的乙酸)为流动相条件下，于254nm波长的高效液相色谱图谱。图11为樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物于O. I %乙酸为流动相条件下，高效液相色谱图谱中各波峰所代表的化合物对照，检测波长为254nm。图12(a)与图12(b)分别为樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物于(a)以乙酸铵调整pH值为3. 75以及4. O、(b)以乙酸铵调整pH值为4. 25,4.5以及5. O和流动相为O. I %乙酸条件下(pH值为3. 3)的高效液相色谱图谱比较，检测波长为254nm。图13为优化的分析条件下高效液相色谱图中各波峰所代表的化合物对照。图14(a)至图14(f)分别为(a)化合物E1、E2与antcin K、(b)化合物E3、E4与antcin C、(c)化合物E5、E6与樟芝酸C、(d)化合物E7、E8与樟芝酸B、(e)化合物E9、E10与樟芝酸A及(f)化合物E11、E12与antcin A于254nm波长的高效液相色谱图谱。图15(a)与图15(b)分别为(a)樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物与内部标准品吡嗪溶于DMS0-d6在400MHz的1H核磁共振图谱、(b)樟芝酸A与去氢齿孔酸的28位的亚甲基特征信号放大图。
具体实施例方式本申请提出的“樟芝子实体三萜类组合物、制备与分析方法”将可由以下 的实施例说明而得到充分了解，使得本领域技术人员可以据此完成，然而本申请的实施并非由下列实施例限制其实施方案，本领域技术人员仍可依据示例性实施例的精神推演出其他实施例，这些实施例都属于本发明的范围。实施例为方便说明本发明所萃取的麦角留烷(ergostane)三萜类组合物El E12，在此先将组合物El E12对应的结构式(式I至式X)及其高效液相色谱图对应的波峰详列如下。
权利要求
1.一种药物组合物，包括有效剂量的式I的麦角留烷三萜类组合物
2.一种药物组合物，包括有效剂量的式II的麦角留烷三萜类组合物
3.—种药物组合物，包括有效剂量的式III的麦角留烷三萜类组合物
4.一种药物组合物，包括有效剂量的式IV的麦角留烷三萜类组合物
5.一种药物组合物，包括有效剂量的式V的麦角留烷三萜类组合物
6.一种药物组合物，包括有效剂量的式VI的麦角留烷三萜类组合物
7.—种药物组合物，包括有效剂量的式VIII的麦角留烷三萜类组合物
8.—种药物组合物，包括有效剂量的式IX的麦角留烷三萜类组合物
9.如权利要求1-8中任一项所述的药物组合物，其中该麦角留烷三萜类组合物是从樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物中分离。
10.如权利要求1-8中任一项所述的药物组合物，其中该麦角留烷三萜类组合物具有杀死血癌细胞的活性。
11.如权利要求1-8中任一项所述的药物组合物，其中该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物通过依次以乙醇溶液、正己烷溶液和乙酸乙酯溶液萃取樟芝子实体而获得。
12.—种制备麦角留烷三萜类组合物的方法，包括 提供樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物；且 层析该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物，以获得该麦角留烷三萜类组合物，其中该麦角甾烷三萜类组合物选自由3a，40，70_三羟基-4a-甲基麦角甾烷_8，24 (28) - 二烯-11-酮-25S-26-酸、3 a，43，7@-三羟基_4 0-甲基麦角甾烷-8,24(28)- 二烯-11-酮-25R-26-酸、70-羟基-4a-甲基麦角甾烷 _8，24 (28) - 二烯 _3，11-二酮-25S-26-酸、7 P -羟基-4 a -甲基麦角留烷 _8，24 (28) - 二烯-3，11- 二酮-25R-26-酸、3a，12 a-二羟基-4 a -甲基麦角甾烷-8，24 (28) - 二烯 _7，11-二酮-25R-26-酸、3 a，12 a - 二羟基-4 a -甲基麦角甾烷-8，24 (28) -二烯 _7，11- 二酮-25S-26-酸、3 a -羟基-4 a -甲基麦角甾烷-8，24 (28) -二烯_7，11- 二酮_26_酸、4 a -甲基麦角甾烷-8，24(28) - 二烯-3,7,11-三酮-25S-26-酸、4 a -甲基麦角甾烷 _8，24 (28) - 二烯-3，7，11-三酮-25R-26-酸、4 a -甲基麦角留烷_8，24 (28) -二烯-3，11- 二酮-26-酸及其组合组成的组之一。
13.如权利要求12所述的方法，其中该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物通过依次以乙醇溶液、正己烷溶液和乙酸乙酯溶液萃取樟芝子实体而获得。
14.如权利要求12所述的方法，其中该层析步骤还可获得羊毛留烷三萜类组合物。
15.如权利要求14所述的方法，其中该羊毛留烷三萜类组合物选自由去氢硫色多孔菌酸、硫色多孔菌酸、15 a -乙酰基-去氢硫色多孔菌酸、变孔孔菌酸、去氢齿孔酸、齿孔酸及其组合组成的组之一。
16.如权利要求12所述的方法，其中该层析步骤还包括 使用高效液相色谱柱，在流动相溶剂为乙腈与含酸水的条件下分离该麦角留烷三萜类组合物，获得麦角留烷三萜类组合物的立体异构体纯的化合物。
17.一种用以检测樟芝子实体中至少一种麦角留烷三萜类立体异构体纯的化合物的含量的方法，该方法包括下列步骤萃取该樟芝子实体，获得该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物； 以1H核磁共振图谱仪检测该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物，确定该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物中是否具有该至少一种麦角留烷三萜类组合物；以及 当该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物中具有该至少一种麦角留烷三萜类组合物时，以高效液相色谱仪检测该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物中该至少一种麦角留烷三萜类立体异构体纯的化合物的含量。
18.如权利要求17所述的方法，其中该萃取步骤依次以乙醇溶液、正己烷溶液和乙酸乙酯溶液萃取该樟芝子实体，而获得该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物。
19.如权利要求17所述的方法，还包括以该1H核磁共振图谱仪检测该至少一种麦角甾烷三萜类组合物的28位的亚甲基信号。
20.如权利要求17所述的方法，其中该方法还用以同时检测该樟芝子实体中至少一种羊毛留烷三萜类组合物的含量，包括以下步骤 以该1H核磁共振图谱仪检测该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物，确定该樟芝子实体乙酸乙酯的萃取物中是否具有该至少一种羊毛留烷三萜类组合物；以及 当该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物中具有该至少一种羊毛留烷三萜类组合物时，以该高效液相色谱仪检测该樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物中该至少一种羊毛留烷三萜类组合物的含量。
21.如权利要求20所述的方法，还包括以该1H核磁共振图谱仪检测该至少一种羊毛甾烷三萜类组合物的28位的亚甲基信号。
22.如权利要求20所述的方法，其中该高效液相色谱仪包括检测器，该检测器选自由全波长检测器、单波长检测器及串联质谱仪及其组合组成的组之一。
23.一种分离化合物的立体异构体的方法，该化合物的羧基的a位具有不对称中心，该方法包括 计算该化合物的PKa值,该pKa值表示为a ； 调整分离溶媒的PH值为b值，b值的范围为a-1. 5彡b彡a+1. 5，且1.0彡b<7;且 以该分离溶媒层析该化合物，以分离出该化合物中的立体异构体。
24.一种检测待测萃取物中麦角留烷三萜类组合物的方法，包括下列步骤 以樟芝酸A的不同浓度样本为标准品制作核磁共振图谱及检量线； 以核磁共振图谱仪分析该待测萃取物中的该麦角留烷三萜类组合物的28位的亚甲基信号；以及 比对该检量线及该28位的亚甲基信号，由该28位的亚甲基信号的积分面积比计算该待测萃取物中该麦角留烷三萜类组合物的含量。
25.一种检测待测萃取物中羊毛留烷三萜类组合物的方法，包括下列步骤 以去氢齿孔酸的不同浓度样本为标准品制作核磁共振图谱及检量线； 以核磁共振图谱仪分析该待测萃取物中该羊毛留烷三萜类组合物的28位的亚甲基信号；以及 比对该检量线及该28位的亚甲基信号，由该28位的亚甲基信号的积分面积比计算该待测萃取物中该羊毛留烷三萜类组合物的含量。
26.一种分析樟芝子实体中麦角留烷三萜类的立体异构体纯的化合物的方法，包括步骤 以高效液相色谱柱层析樟芝子实体的乙酸乙酯萃取物，分离出该立体异构体混合物；以及 依据该麦角留烷三萜类的立体异构体纯的化合物的1H核磁共振图谱、该高效液相色谱柱层析的保留时间及旋 光数据，判断该麦角留烷三萜类立体异构体纯的化合物的25位在结构上为R构型或S构型。
全文摘要
本发明以高效液相色谱及核磁共振图谱技术分离、纯化、解析出樟芝子实体中的麦角甾烷及羊毛甾烷三萜类组合物及它们的立体结构式和含量，并测试它们的细胞毒性。通过前述技术，可以检测药品、保健食品或其他商品中是否含有麦角甾烷及羊毛甾烷三萜类组合物及它们的含量。
文档编号G01N24/08GK102614195SQ201110092150
公开日2012年8月1日 申请日期2011年4月12日 优先权日2011年1月26日
发明者吕美津, 吴东颖, 吴永昌, 张芳荣, 杜英齐, 许育铭 申请人:高雄医学大学