一种乙醇-酶体系预处理结合水提法提取灵芝子实体中β-葡聚糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药用真菌β -葡聚糖提取技术领域，具体地说涉及一种乙醇-酶体系预处理结合水提法提取灵芝子实体中β-葡聚糖的方法。
【背景技术】
[0002]灵芝为真菌担子菌亚门Basid1mycotina层菌纲Hymenomycetes多孔菌目Polyporales 多孔菌科 Polyporaceae 灵芝属 Ganoderma 赤芝种 Ganoderma Iucidum,最近其学名订名为Ganoderma lingzhi。灵芝子实体自古作为一味名贵中药，在古代曾被称为“仙草”，始载于汉《神农本草经》。灵芝多糖是灵芝的主要功效成分之一，其中灵芝β-构型的多糖是灵芝多糖中最具活性的成分，具有提高免疫、抗肿瘤、抗氧化、降血糖和血脂等多种药理作用。
[0003]已有灵芝总多糖或粗多糖的提取技术报道，但灵芝中葡聚糖的提取技术报道较少，同时也没有在灵芝β-葡聚糖提取过程中采取乙醇-酶体系预处理技术的报道。
[0004]文献:李靖.响应面优化灵芝多糖提取研究(食品工业，2013)报道了灵芝子实体中多糖的超声波法提取技术，但是灵芝总多糖的提取技术，没有针对灵芝葡聚糖的的相关提取技术，更没有乙醇-酶体系预处理技术报道。
[0005]文献:孙小梅，戴军，陈尚卫，朱松.灵芝子实体多糖提取方法优化及不同来源赤芝子实体的多糖分子质量比较(食品与发酵工业，2014)报道了灵芝子实体中多糖的超声波辅助、微波辅助、加速溶剂萃取以及水浴回流4种提取技术，但均是针对灵芝总多糖的提取技术，没有针对灵芝β -葡聚糖的的相关提取技术，也没有乙醇-酶体系预处理技术报道。
[0006]文献:刘钧发，冯梦莹，游丽君，罗维，赵强忠，赵谋明.超声和水提法提取灵芝多糖的结构和抗氧化性的比较研究(食品工业科技，2013)报道了灵芝子实体中多糖的超声和水提法2种提取技术，但均是针对灵芝总多糖的提取技术，没有针对灵芝β -葡聚糖的的相关提取技术，且文中报道了灵芝子实体预处理采用灵芝粉末按料液比l:6(w/v)的比例加入95%乙醇，在微沸的状态下回流3h，未涉及乙醇-酶体系预处理技术。
[0007]中国专利:上海市农业科学院，申请号201410293682，提出了一种灵芝多糖及其制备方法。该灵芝多糖的制备方法包括:灵芝子实体进行水提，得到提取残渣；提取残渣进行超微粉碎，得到超细粉；超细粉经过水提醇沉，收集到的沉淀即为灵芝多糖。但研究对象仍是灵芝总多糖，未涉及灵芝葡聚糖。
[0008]中国专利:武汉苏妃玛索科技有限公司，申请号201310650365.4，提出了一种灵芝多糖的提取方法。它利用灵芝子实体干粉除掉脂肪后，加入到水和甘油组成的提取剂中进行萃取，具有提高萃取效率以及避免了传统方法中采用氯仿、甲醛等有机溶剂或酸碱对环境的污染，但仍是针对总多糖提取的技术，没有具体针对灵芝葡聚糖，且未涉及乙醇-酶体系预处理技术。
[0009]我们通过大量的实验发现，在灵芝β -葡聚糖提取过程中采取乙醇-酶体系预处理对技术可有效提高灵芝葡聚糖的提取效率。由于葡聚糖在乙醇溶液中不溶解，因此其分子能够保持完整性。乙醇能去除原材料中的油脂、色素、低聚糖和小分子物质等杂质。另外，为了去除蛋白质这类生物大分子对多糖提取的干扰和提高产品纯度，在一定质量分数的乙醇溶液中，加入适量的蛋白酶可有效除去蛋白类杂质。因此，乙醇-酶体系预处理对于灵芝葡聚糖的提取具有良好效果。通过反复实验，获得了一种能显著提高灵芝β -葡聚糖的提取效率、且生产工艺简易的β -葡聚糖提取预处理工艺。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种乙醇-酶体系预处理结合水提法提取灵芝子实体中β-葡聚糖的方法。该方法条件温和、工艺简单、所得产品灵芝β-葡聚糖的得率高。
[0011]—种乙醇-酶体系预处理结合水提法提取灵芝子实体中β -葡聚糖的方法，该方法包括如下步骤:
[0012]I)将灵芝子实体粉碎，进行乙醇-酶体系预处理；
[0013]2)离心获得预处理后的灵芝子实体滤渣；
[0014]3)对预处理后的灵芝子实体滤渣进行热水提取葡聚糖，经离心获得含粗β-葡聚糖的上清液；
[0015]4)在上清液中加入α -1, 4-葡萄糖水解酶对α构型多糖进行处理；
[0016]5)产品回收:对α -1, 4-葡萄糖水解酶处理液进行醇析，经离心收集沉淀部分即为灵芝葡聚糖。
[0017]步骤I)中将灵芝子实体粉碎至40-60目。
[0018]步骤I)在乙醇-酶体系预处理反应体系中按照10_15:lL/kg将灵芝子实体加入到质量分数为50-70%的乙醇溶液中，然后加入胰蛋白酶进行酶解:加酶量占灵芝子实体质量的1.0-2.0%，酶活力30000-50000u/go乙醇-酶体系预处理的pH7.0-9.0，温度45-50°C，酶解时间30_50min。在反应体系中加入乙醇溶液后在100-200rpm/min下机械搅拌20-40min ;然后加入胰蛋白酶进行酶解。
[0019]步骤2)中在2500-4500r/min下离心10_20min得到预处理后的灵芝子实体滤渣。
[0020]步骤3)取预处理后的灵芝子实体滤渣，按照15-20: lL/kg加入水，在80-90°C温度下浸提1.5-3.5h ;离心收集含β -葡聚糖的上清液。浸提后在6000-8000r/min下离心5_15min0
[0021]步骤4)在含葡聚糖的上清液中加入α-1,4-葡萄糖水解酶处理，酶活力40000-60000u/g，加酶量占灵芝子实体滤渣质量的1.0-2.0%，酶解pH 3.5-4.0，酶解温度45-50°C，酶解时间 40-60min。
[0022]步骤5)在α -1, 4_葡萄糖水解酶处理后的溶液中，加入3_4倍体积的工业乙醇，在4-6°C温度下放置10-14h进行醇析，然后在6000-8000r/min下离心8_12min，去除上清，收集的沉淀即为灵芝葡聚糖产品。
[0023]本发明中灵芝β -葡聚糖含量的测定方法为:刚果红法。准确吸取样品液1.0mL,以蒸馏水补充至2.0mL，再加入4.0mL刚果红缓冲溶液、摇匀，在20°C下准确作用lOmin，然后在544nm波长下测定吸光值，以β -葡聚糖纯品为标准品计算样品的β -葡聚含量。
[0024]与现有灵芝多糖的提取技术相比，本发明具有以下优势:
[0025]I)本发明所提取的产品对象是更精细的产品灵芝β -葡聚糖(多糖中的最具活性的组分)，而非普通多糖产品，相关技术新颖。
[0026]2)本发明采用了一种简便、高效、葡聚糖得率高的预处理方法一一乙醇-酶体系预处理方法，通过该方法处理后，再经水提法提取可获得质量稳定的灵芝β -葡聚糖，得率可达到0.421mg/g，是传统方法(不经乙醇-酶体系预处理)提取β-葡聚糖得率(0.201mg/g)的 2.1 倍。
[0027]3)本发明灵芝葡聚糖提取得率高，提取工艺简单，适合工业化生产。
【具体实施方式】
[0028]以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0029]实施例1:
[0030]灵芝子实体:购自山东聊城景才农产品专业合作社提供。
[0031]胰蛋白酶(40000u/g)和α -1, 4_葡萄糖水解酶处理(酶活力50000u/g)，购自上海瑞丰生物科技有限公司。
[0032]以灵芝子实体为原料，粉碎成40-60目粉末。称取上述灵芝子实体粉末1.1kg于30L机械搅拌罐中，加入15L质量分数为58% (v/v)的乙醇溶液，180rpm/min搅拌30min，然后加入20g胰蛋白酶，在pH为7.8，46