广东虫草子实体在制备治疗慢性支气管炎药物中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及广东虫草子实体在制备治疗慢性支气管炎药 物中的应用。
【背景技术】：
[0002] 慢性肺部阻塞性疾病（COPD)通常定义为最大呼气气量的减少的过程，而这一过 程通常是不可逆的，并且是逐步恶化的。目前，90%的coro案例都被归入慢性支气管炎的 范畴（Sethi，1999)。慢性支气管炎的病理症状及病因是十分复杂的，其中由吸烟引起的慢 性支气管炎受到极大关注（Gump et al，1976 ;Xu et al，1992 ;Monso et al，1999 ;Sethi， 1999)〇
[0003] 目前，对于虫草在慢性支气管炎治疗方面的报道主要集中在野生冬虫夏草及冬 虫夏草菌丝体，如其可有效扩展支气管及预防哮喘（Zhang and Zhang，1958;王琴和赵一， 1987);也可通过增加气管粘膜的分泌功能来缓解小鼠的咳嗽症状（Wei et al，2002)。通 过大鼠模型证实，冬虫夏草菌丝体可以维持支气管上皮结构，并且可以有效地预防在慢性 肺阻塞疾病过程中支气管的发炎（刘进等，2003 ;管彩虹和刘进，2007)。冬虫夏草能扩张离 体动物支气管，对氨雾致咳小鼠能延长其咳嗽潜伏期及减少咳嗽次数（徐锦堂，1997)。冬 虫夏草及其菌丝体可明显增大乙酞胆碱诱发哮喘潜伏期差值，具平喘作用（王勤和赵一， 1987)。魏涛等（2002)通过实验发现灌服冬虫夏草菌丝体后的大鼠肺巨噬细胞内酶活性有 明显的提高。冬虫夏草水提液还具有明显的增强肾上腺素分泌、扩张动物支气管、平喘、祛 痰等作用，可对肺心病呼吸衰竭发挥辅助治疗作用（杨志彬和展春，2002)。尽管冬虫夏草 效果显著，但天然冬虫夏草主要生长于喜马拉雅山脉及附近的高海拔地区，且至今尚未能 进行人工栽培生产，资源十分稀缺。而以其菌丝体为主研制的产品在市场上也存在良莠不 齐的现状。
【发明内容】
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[0004] 本发明的目的是提供广东虫草子实体在制备治疗慢性支气管炎药物中的应用。
[0005] 本发明通过广东虫草子实体粉末对大鼠进行慢性支气管炎治疗实验，实验结果表 明，广东虫草子实体对于烟熏导致的慢性支气管炎有良好的改善作用，这提示广东虫草子 实体在吸烟人群的肺部健康方面将会发挥积极有效的作用，可用于制备具有治疗慢性支气 管炎功能的产品。
[0006] 本发明证明广东虫草子实体对于烟熏导致的慢性支气管炎有良好的改善作用，提 示广东虫草子对吸烟人群的肺部健康方面将会发挥积极有效的作用，可用于制备治疗慢性 支气管炎药物。
【附图说明】：
[0007] 图1是广东虫草子实体对实验动物体重的影响，CG :广东虫草子实体；
[0008] 图2是广东虫草子实体对实验动物摄食量的影响，CG :广东虫草子实体；
[0009] 图3是广东虫草子实体对实验动物饮水量的影响，CG :广东虫草子实体；
[0010] 图4是广东虫草对实验动物BALF白细胞计数及分类的影响，CG :广东虫草子实体； ▲A与正常对照组相比P〈〇. 01，与空白对照组相比P〈. 0. 01 ; #与空白对照组相比P〈〇. 05 ;
[0011] 图5是大鼠肺组织病理切片图（H. EX 100)，依次为正常组（A)，模型组（B)，阳性对 照组（C)，广东虫草低、中、高（D-F)剂量组；
[0012] 图6是大鼠肺组织病理切片图（H. EX200)，依次为正常组（A)，模型组（B)，阳性对 照组（C)，广东虫草低、中、高（D-F)剂量组。
【具体实施方式】：
[0013] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0014] 实施例1 :
[0015] 对收集到的野生广东虫草子实体（Cordyceps guangdongensis T. H. Li, Q. Y.Lin&B. Song)表面消毒，通过常规方法进行组织分离，获得原始菌种。分离用培养基为加 富？0八，配方为（质量分数）：马铃薯20%、葡萄糖2%、1(1^0 40.3%、1^04,71120 0.15%、 维生素&少许、琼脂2%，余量为水。
[0016] 将原始菌种接入无菌的加富PDA斜面培养基中，20 - 25°C下，暗培养10 - 15天 后，光照4-6天，选取转色快且菌丝生长整齐的菌种，作为母种。
[0017] 经多次栽培，挑选出品质优良的母种，在其培养基中增加质量分数1% - 2%的葡 萄糖，进行复壮。
[0018] 将经筛选的母种接至经灭菌的发酵液体培养基（培养基配方（质量分数）：葡萄 糖1%，蛋白胨0.5%，麦芽浸出粉0.3%，酵母浸膏0.3%，余量为水，PH6.0 - 6. 5)中，并 放入一个螺旋钢丝圈，用于分散菌丝球，在25°C，140r/m，振荡培养7 - 10天。选取菌丝球 大小均匀一致、直径为2 - 3毫米的作为一级菌种。
[0019] 将一级菌种按5% - 8%的比例（体积比）接入发酵液体培养基（配方同上）中， 并放入一个螺旋钢丝圈，用于分散菌丝球，按一级菌种的培养方式进行培养，至菌球充满全 部液体培养基即可。选取菌丝球大小均匀一致、直径为2 - 3毫米的作为二级菌种，直接用 于栽培生产。
[0020] 栽培培养基由大米和营养液按1 :1. 2的比例（重量比）进行配制混合而成，用 聚乙烯耐高温薄膜封口，经121°C，高压灭菌40分钟，冷却后即可用于接种。营养液配方 为（质量分数）：葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，麦芽浸出粉0.3%，酵母浸膏0. 3 %，余量为水， pH6. 0 - 6. 5〇
[0021] 在无菌室或超净工作台内，用无菌水按1 :2的比例稀释二级菌种，再将经稀释的 菌种接入无菌的栽培培养基中，每瓶接入17 - 22毫升。避光培养9 一 14天，待菌丝长满培 养基后，进行光照培养，光强400 - lOOOLux，空气相对湿度80 - 90%，18 - 25°C，经7 - 12天即可长出子实体原基，再培养40 - 50天，待子实体顶部变成圆形，并出现颗粒状小点 时，即可采收。采收后的广东虫草子实体经60°C烘干，粉碎后经100目过筛后备用。
[0022] 取64只雄性SPF级SD大鼠适应性饲养7d，检疫合格后将SD大鼠，雌雄各 半，随机分为正常对照组10只和模型组54只。正常对照组：将10只大鼠置于特制的 50cmX50cmX40cm的烟室中（无须烟熏），2次/天，每次50min，持续57d。模型组54只， 平均置于特制的5个50cmX 50cmX 40cm的烟室中，2次/天，20g烟叶/次，每次50min，持 续57d。烟熏第21d，取造模大鼠雌雄各2只，作组织病理学检查。烟熏第31d将50只模型 动物随机分为模型对照组、地塞米松组（〇. 25mg/kg)、广东虫草子实体低剂量组（0. 325g/ kg)、中剂量组（0. 65g/kg)及高剂量组（1. 3g/kg)，10只/组（雌雄各半）。各组灌胃给予 相应浓度的药物，模型对照组给予等量的蒸馏水，正常对照组不给药，连续给药26d。末次给 药lh，颈椎脱臼处死动物。打开胸腔结扎右肺，左肺按2ml/100g bw用0. 01mol/l PBS分 2次进行肺泡灌洗，每次反复灌洗3遍。所得BALF 4°C 1000r/min离心10min，用预冷PBS 液lml重悬，用血细胞计数板做细胞计数。离心去掉上清，余液制成细胞涂片，瑞氏染色进 行细胞分类计数。
[0023] 实验结果：
[0024] 1、对慢性支气管炎大鼠体重的影响
[0025] 模型对照组大鼠在各个测定时间点的体重与正常对照组比较均无显著性差异 (P>0. 05);地塞米松组大鼠在给药第三、四周的体重与模型对照组比较具有显著性差异 (P〈0. 05);其余各给药组大鼠在各个测定时间点的体重与模型对照组比较均无显著性变化 (P>0. 05)。结果见图1。
[0026] 2、对慢性支气管炎大鼠进食量、饮水量的影响
[0027] 模型对照组大鼠在各个测定时间点的进食量、饮水量与正常对照组比较均无显著 性差异（P>〇. 05);各给药组大鼠在各个测定时间点的进食量、饮水量与模型对照组比较均 无显著性变化（P>〇. 05)。结果见图2及图3。
[0028] 3.对慢性支气管炎大鼠BALF白细胞计数及分类的影响
[0029] BALF白细胞总数：模型对照组动物肺泡灌洗液中白细胞总数与正常对照组比较 显著增加（P〈〇. 01)。地塞米松组、广东虫草子实体中、高剂量组肺泡灌洗液中白细胞总数显 著降低（P〈0. 01)。广东虫草子实体低剂量组动物肺泡灌洗液中白细胞总数与模型对照组比 较无显著性差异（P>〇. 05)
[0030] BALF巨噬细胞百分比:模型对照组动物肺泡灌洗液中巨噬细胞百分比（％ ) 与正常对照组比较显著降低（P〈〇. 01)。地塞米松组、广东虫草子实体低、中、高剂量组肺泡 灌洗液中巨噬细胞百分比显著升高（P〈〇. 01)。
[0031] BALF中性粒细胞百分比:模型对照组动物肺泡灌洗液中中性粒细胞百分比 (% )与正常对照组比较显著升高（P〈〇. 01)。地塞米松组、广东虫草子实体低、中、高剂量组 肺泡灌洗液中中性粒细胞百分比（％ )与模型对照组比较显著性降低（P〈〇. 01)。
[0032] BALF淋巴细胞百分比:模型对照组动物肺泡灌洗液中淋巴细胞百分比（％ ) 与正常对照组比较显著升高（P〈〇. 01)。地塞米松组、广东虫草子实体低、中、高剂量组肺泡 灌洗液中中性粒细胞百分比（％ )与模型对照组比较显著性降低（P〈〇. 01)。结果见图4。
[0033] 4.对慢性支气管炎大鼠肺组织形态学的影响
[0034] 模型对照组大鼠支气管粘膜病变、支气管管壁病变、基底部炎性细胞浸润和肺泡 间隔病变与正常对照组比较差异显著。模型对照组大鼠肺组织镜下见细、小支气管粘膜增 厚，皱襞增多，纤毛不整，部分纤毛消失，杯状细胞显著增多，支气管粘膜上皮部分脱落，支 气管周不同程度炎细胞浸润（多为淋巴细胞），部分支气管管壁平滑肌增厚明显，肺泡间隔 不同程度增厚、间隔中淋巴细胞增多，肺泡壁毛细血管充血、小血管充血。支气管周炎细胞 浸润，肺泡间隔增厚。
[0035] 地塞米松能降低慢性支气管炎大鼠改善支气管粘膜病变。广东虫草子实体低、中 和高剂量能改善支气管粘膜病变、支气管管壁病变，高剂量还能改善基底部炎性细胞浸润， 但未见广东虫草受试各剂量对肺泡间隔病变有改善作用。结果见表1，图5及图6。
[0036] 表1广东虫草子实体对慢性支气管炎大鼠气管肺组织形态学改变的影响
[0037]
【主权项】
1. 广东虫草子实体在制备治疗慢性支气管炎药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗慢性支气管炎药物是治疗由 烟熏导致的慢性支气管炎药物。
【专利摘要】本发明公开了广东虫草子实体在制备治疗慢性支气管炎药物中的应用。本发明通过广东虫草子实体粉末对大鼠进行慢性支气管炎治疗实验，实验结果表明，广东虫草子实体对于烟熏导致的慢性支气管炎有良好的改善作用，这提示广东虫草子实体在吸烟人群的肺部健康方面将会发挥积极有效的作用，可用于制备具有治疗慢性支气管炎功能的产品。
【IPC分类】A61P11-00, A61K36-068
【公开号】CN104622917
【申请号】CN201510018654
【发明人】闫文娟, 李泰辉
【申请人】广东省微生物研究所
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月14日