专利名称：一种高雄山虫草子实体低产孢菌株及子实体人工培养方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物及其子实体的人工培养方法，尤其是一种高雄山虫草低产孢菌株及其子实体的人工培养方法，属于真菌培养技术领域。
背景技术：
高雄山虫草 Cordyceps takaomontana Yakush. &Kumaz. 1941 (=Isaria tenuipespeck (1879) =Isaria japonica Yasuda (1915) =Paecilomyces tenuipes (Peck) Samson(1974) =Paecilomyces japonica)是一种优良的虫草资源，它在抗癌、抗抑郁、抗虫、抗菌、抗病毒及调节免疫力等方面有明显作用。它的抗癌成分乙酰环氧单端 孢烯二醇(4 β -acetoxyscirpene-3 α，15-diol = AETD)的抗癌活性比目前用于临床癌症病患者治疗用的顺钼强约4-6倍，且毒性低，安全范围大。因此，高雄山虫草无论作为药物开发还是作为保健品应用都具有广阔前景。在韩国，高雄山虫草已经应用于食品及保健品中。由于高雄山虫草的野生资源稀少，利用人工培养生产其子实体，是对高雄山虫草进行人工开发的必由之路。但目前在高雄山虫草人工培养中存在的主要问题之一是在子实体生长过程中会产生大量的分生孢子，当这些分生孢子大量存在时，对提高虫草子实体产量和生产人员的健康安全都造成了较大影响，因此，寻找低产孢的高雄山虫草菌株和人工培养方法是当前高雄山虫草子实体人工培养中重点需要解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种高雄山虫草子实体低产孢菌株及子实体的人工培养方法。在该人工培养方法下该菌株可发育形成产孢极低的子实体，在高雄山虫草的人工培养中具有良好的应用前景。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下
本发明提供的高雄山虫草，属于粪壳菌纲、肉座菌目、麦角菌科、虫草属，菌株为高雄山虫草子实体低产抱菌株A1105 (Cordyceps takaomontana A1105),菌株保藏号为CCTCCM 2012307，于2012年8月9日在中国典型培养物保藏中心(地址中国.武汉.武汉大学)保藏。上述的高雄山虫草子实体低产孢菌株Al 105分离自摧病昆虫标本,在Czapek琼脂培养基上，25°C下培养21天时，菌落平均直径为32mm，正面白色到肉色，粉质，背面白色到褐色，菌落平展、薄，边缘整齐，未见形成环带或放射沟，未见角变现象，未见形成孢梗束。本发明的高雄山虫草低产孢子实体人工培养方法，包含以下步骤(I)人工培养基制备取去皮的小麦粒100g，用清洁水浸泡12h，滤去多余水分后放入培养盒内，采用高压间歇灭菌法灭菌2-3次备用，每次灭菌温度控制在115°C，时间控制在40min ；
(2)将Al 105菌株摇瓶培养制成种子液，向培养基上接种种子液45ml，置于25V下暗培养10天左右，见有转色迹象时，转入16 1和22°C下，交替变温培养各12h ;其中在22°C时，见光培养12h，光照强度为200x1，在16°C时，暗培养12h ;25天后即可收获子实体。上述的高雄山虫草低产孢子实体人工培养方法中，步骤(I)所述培养盒体积为13cmX 8cmX 11cm,步骤(2)所述培养基体积为 13cmX 8cmX 3. 5cm。前述的高雄山虫草低产孢子实体人工培养方法中，步骤(2)所述A1105菌株摇瓶培养的温度为25°C，转速250r/min，培养4天，菌丝段达IO7Iiil'前述的高雄山虫草低产孢子实体人工培养方法中，在步骤(2)所述子实体第一次收获后补水，按照与第一次培养相同的方法，进行二次培养，共计可收获近双倍产量。有益效果与现有技术相比，本发明提供的是一种高雄山虫草子实体低产孢菌株 及子实体的人工培养方法，在该人工培养方法下该菌株可发育形成产孢极低的子实体，有效解决了现有技术在高雄山虫草人工培养中，子实体生长过程中会产生大量分生孢子的技术难题，保障了生产人员的健康安全，同时也提高了高雄山虫草子实体的产量，在高雄山虫草的人工培养中有良好的应用前景。
图1是本发明的高雄山虫草菌株A1105在Czapek琼脂培养基上培养性状(正面)；图2是本发明的高雄山虫草菌株A1105在Czapek琼脂培养基上培养性状(背面)；图3是采用本发明的菌株及方法培养获得的高雄山虫草子实体。下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步的说明。
具体实施例方式实施例1。1、人工培养时种子液的制备1.1材料与方法1.1.1 材料I)菌株如图1、图2所示，高雄山虫草Al 105，分离自野外采集的虫生标本，在Czapek琼脂培养基上，25°C下培养21天时，菌落平均直径为32mm，正面白色到肉色，粉质，背面白色到褐色，菌落平展、薄，边缘整齐，未见形成环带或放射沟，未见角变现象，未见形成孢梗束。2)培养基①菌种活化培养基PDA培养基。②高雄山虫草液体培养基马铃薯200g煮沸30min滤汁，加入葡萄糖20g，加水至1000ml, 121。。，灭菌 25min，备用。1.1. 2方法将活化好的菌株A1105，用打孔器沿菌落边缘打孔后接入装有高雄山虫草液体培养基的250ml三角瓶中，装液量为50ml，置于25°C，250r/min下培养4天。1. 2结果培养4天后备用。将培养液混匀后作为种子接种到灭好菌的人工培养基中。2、高雄山虫草生产子实体的人工培养基制备
2.1实验材料2.1.1 材料小麦。2.1.1其他材料及仪器较密闭的透光容器(培养盒或罐头瓶)，人工气候箱或人工气候室等。2. 2 方法2. 2.1 预处理将一定量去皮的小麦(比如IOOg小麦)，放入体积为13X8Xllcm的培养盒中，根据小麦品种的不同经水浸泡12h左右备用。2. 2. 2 灭菌·将浸泡好的小麦滤去多余的水分，然后采用高压间歇灭菌法灭菌2-3次备用，每次灭菌温度控制在115 °C，时间控制在40min ；3、高雄山虫草子实体生产的人工培养及结果3.1接种将培养好的种子液用无菌处理的喷枪均匀喷施在培养基的表面(13X8X3. 5cm体积的培养基上可喷洒45ml的种子液)，然后放入培养箱。3. 2培养在25°C下进行暗培养10天左右，见菌丝密集布满整个培养基，并有转色迹象时，改变培养条件为22°C，12h见光培养，光照强度为200x1左右为宜，然后再改变培养条件为16°C，12h暗培养，两者交替进行。3. 3结果在培养4周左右时即可收获。可用剪刀等将子实体从培养基上切下来保鲜或烘干保存。在本例中，每个培养面积为13X8cm大的培养基上可生产出鲜重为35g左右，干重为8g左右的子实体，子实体的平均长度在5-6cm，直径为l-2mm (见图3);经计数检测，每克鲜重子实体所含有的分生孢子数目仅为3.6X107，相对很小。因此，该菌株和该条件下有利于低产孢子实体的产生。收获后可根据实际情况适当补水后进行二次培养，培养方法同第一次，每盒进行二次培养后共计可以收获虫草子实体鲜重70g左右，干重16g左右。本发明中培养时可根据使用的小麦品种不同，适当增减浸泡时间；灭菌时采用间歇灭菌这样灭菌更彻底，而且可以在相对较低温度(115°C )下灭菌，以延长培养盒的使用寿命，节约成本；培养时光照度不宜过高，过高会促使子实体产分生孢子，且子实体形态易变形。另外，培养中菌株选择也较为重要，有的菌株在子实体刚形成不久就开始在子实体表面形成较多的白色分生孢子，这种菌株不宜使用。本发明的实施方式不限于上述实施例，在不脱离本发明宗旨的前提下做出的各种变化均属于本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种高雄山虫草子实体低产孢菌株A1105，保藏号为CCTCC M2012307。
2.根据权利要求1所述的高雄山虫草子实体低产孢菌株，其特征在于分离自罹病昆虫标本，在Czapek琼脂培养基上，25°C下培养21天时，菌落平均直径为32mm，正面白色到肉色，粉质，背面白色到褐色，菌落平展、薄，边缘整齐，未见形成环带或放射沟，未见角变现象，未见形成孢梗束。
3.—种如权利要求1或2所述的高雄山虫草低产孢子实体人工培养方法，其特征在于 包含以下步骤(1)人工培养基制备取去皮的小麦粒100g，用清洁水浸泡12h，滤去多余水分后放入培养盒内，采用高压间歇灭菌法灭菌2-3次备用，每次灭菌温度控制在115 °C，时间控制在 40min ；(2)将Al105菌株摇瓶培养制成种子液，向培养基上接种种子液45ml，置于25°C下暗培养10天左右，见有转色迹象时，转入16°C和22°C下，交替变温培养各12h ;其中在22°C 时，见光培养12h，光照强度为200x1，在16°C时，暗培养12h ；25天后即可收获子实体。
4.根据权利要求3所述的高雄山虫草低产孢子实体人工培养方法，其特征在于步骤(1)所述培养盒体积为13cmX8cmXIlcm,步骤(2)所述培养基体积为13cmX8cmX3. 5cm。
5.根据权利要求3所述的高雄山虫草低产孢子实体人工培养方法，其特征在于步骤(2)所述Al105菌株摇瓶培养的温度为25°C，转速250r/min，培养4天，菌丝段达IO7Iiil'
6.根据权利要求3所述的高雄山虫草低产孢子实体人工培养方法，其特征在于在步骤(2)所述子实体第一次收获后补水，按照与第一次培养相同的方法，进行二次培养。
全文摘要
本发明公开了一种高雄山虫草子实体低产孢菌株及子实体人工培养方法。该菌株为高雄山虫草子实体低产孢菌株A1105，其子实体的人工培养方法包括种子液制备、人工培养基制备、接种、培养、收获等步骤。在本发明的人工培养方法下该菌株可发育形成产孢极低的子实体，有效解决了现有技术在高雄山虫草人工培养中子实体生长过程会产生大量分生孢子的技术难题，保障了生产人员的健康安全，同时也提高了高雄山虫草子实体的产量，在高雄山虫草的人工培养中有良好的应用前景。
文档编号A01G1/04GK103004463SQ20121036816
公开日2013年4月3日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者梁建东, 田维毅, 王平, 韩洁, 何光志, 王文佳, 蔡琨 申请人:贵阳中医学院