水蛭蛆虫蛋白质在制备抗胰腺癌药品中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种药物的新用途，尤其是水蛭蛆虫蛋白质在制备抗胰腺癌药品中的 应用。
【背景技术】
[0002] 胰腺癌是原发于胰腺的恶性肿瘤，按病变部位划分为胰头癌、腺体癌、胰尾癌和全 胰癌。
[0003] 中医认为气机不畅、脾湿困郁是本病的首要病因，正气虚弱、脏腑失调是发病的内 在条件。
[0004] 现在医学认为其病因学主要为：吸烟因素、饮酒因素、饮食因素、环境因素、内分泌 因素、慢性胰腺炎及遗传因素。
[0005] -般认为早起胰腺癌应做手术治疗，胰腺癌对放射治疗及化学药物治疗均布敏 感，生物或八项治疗或称为治疗手段的发展方向。
[0006] 中医采用辨证论治，大致划分为湿热毒盛型、气滞血瘀型、湿浊阻遏型及气血亏损 性等类型病症。
[0007] 由于胰腺出于消化系统的一处末端，一般给药方式很难达到病灶，因此治疗过程 的给药系统对疗效产生直接的影响。
[0008] CN104001151A公开了雨蛙肽在制备干预胰腺癌动物模型药物的增敏剂中的用途。 该发明为诱导小鼠胰腺癌模型的药物提供了有效的增敏剂，通过雨蛙肽的协同作用，可再 现胰腺癌发生过程中的正常胰腺导管上皮及不典型增生、胰腺导管上皮原位癌及胰腺浸润 癌。
[0009] CN103429263A公开了用于胰腺癌早期检测和治疗的抗粘蛋白抗体。该发明描述了 使用抗胰腺癌抗体的方法，所述抗胰腺癌抗体可用于血清样品的免疫测定，使用抗体的免 疫测定可用于提高对胰腺癌检测的灵敏度。
[0010] CN102784363A公开了一种治疗胰腺癌的中药组合物及其制备方法，其中的中药材 原料包括：肿节风、半枝莲、白花蛇舌草、紫花地丁、金银花、连翘、甘草、党参、大黄、乌梅、冰 片、金钱草、姜黄、射干、赤药和天花粉等二十九种药材。该组合物可单独使用，也可配合放 化疗使用。
[0011] CN102816241A公开了清蛋白融合蛋白，该发明涵盖了编码清蛋白融合蛋白的核酸 分子以及含有这些核酸的载体，经过这些载体转化的宿主细胞，使用这些核酸、载体和/或 宿主细胞和生成清蛋白融合蛋白的方法。
[0012] CN102822193A公开了修饰的MELK肽及包含它们的疫苗，该申请描述了由修饰的 MELK表位肽或其免疫学活性片段的氨基酸序列组成的分离的肽，它们结合HLA抗原并且具 有较高的细胞毒性T细胞诱导能力，可用于癌症的免疫治疗。
[0013] CN101850106A公开了南瓜蛋白在治疗胰腺癌药物中的应用。本发明描述了南瓜蛋 白对体外培养的多株胰腺癌细胞具有显著的抑制增殖作用，对人胰腺癌小鼠皮下移植瘤及 胰腺原味移植瘤均具有明显的抑制作用。
[0014] 201210315709. 1公开了人工培育水蛭蛆虫的工艺，该发明以水蛭等为原料培殖制 备水蛭蛆虫的工艺过程，通过特殊工艺将水蛭基因重组赋予新的生物活性功能，用于胰腺 癌的治疗。
【发明内容】
[0015] 本发明的目的是提供一种水蛭蛆虫蛋白质在制备抗胰腺癌药品中的应用，利用水 蛭蛆虫为原料，经过分离纯化蛋白质，再用此蛋白质制备各种剂型的药品，本过程工艺简要 明了，药品成分明确，一致性好，疗效明显。
[0016] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： (1)将1000g水蛭蛆虫在常温膨化装置（200520108339. X)中常温条件下膨化粉碎。
[0017] 本步骤中，所述膨化压力为0? l~5MPa，时间为10~60min。
[0018] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中，加入 膨胀溶剂并加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，提取出水蛭蛆虫蛋白质粗品。
[0019] 本步骤中，所述膨胀溶剂由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH 3 ? H20组成或由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵组 成。
[0020] 本步骤中，所述提取温度为10~20°C，时间为10~30min。
[0021] (3)收集含有水蛭蛆虫蛋白质粗品的溶液并且用微孔过滤器过滤去掉杂质。
[0022] 本步骤中，所述微孔过滤器的孔径为0. 5~50Mm。
[0023] (4)用超滤机超滤处理，收集含有相应分子量的水蛭蛆虫蛋白质超滤溶液。
[0024] 本步骤中，所述超滤机的孔径为50~100nm。
[0025] (5)超滤液溶解在适宜的溶剂中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分。
[0026] 本步骤中，所述溶剂为乙腈。
[0027] (6)将洗脱成分溶解在合适的溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱 (200920274485. 8)分离纯化。
[0028] 本步骤中，所述溶剂体系由正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1. 25:3. 75:5)组成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）组成。
[0029] (7)纯化后的水蛭蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉。
[0030] 本步骤中，所述真空冷冻干燥温度为_30~50°C、时间为18~26h。
[0031] (8)赋予不同的药用辅助材料，分别制备成注射剂、口服剂、栓剂等，可用于制备抗 胰腺癌药品。
[0032] 本技术方案中分离的纯化水蛭蛆虫蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向聚丙烯酰 胺凝胶电泳及琼脂聚糖免疫电泳谱上测得非均一蛋白质；用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 及葡聚糖凝胶G-75凝胶过滤法测得相对分子量为11. 2~11. 7KPa ;用等电聚焦发测定其等 电点为PH9. 0~11. 2 ;常规化学法分析结果表明其不含糖基；紫外分光光度法测定纯化的水 蛭蛆虫蛋白质含量为98. 1%。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对 本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵 盖在本发明的保护范围中。
[0034] 实施例1: (1) 将1000g水蛭蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339. X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至〇. l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，水蛭蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的水蛭蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 ? H20,加压至2~10MPa，形成膨 胀溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，水蛭蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压 至常压，生成水蛭蛆虫蛋白质粗品与甲醇_NH 3 ? H20的混合液； (3) 收集含有水蛭蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0. 5~50Mm的微孔过滤器过滤去处固 体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的水蛭蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率0. 2~3. 0KW，频率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外检测器波长260~280nm ; (7) 纯化后的水蛭蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~50°〇、时间18~2611干燥制 备成冻干蛋白粉。
[0035] 实施例2: (1) 将1000g水蛭蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339. X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至〇. l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，水蛭蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的水蛭蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入5Kg液态二氧化碳、300mL甲醇及200gNH3 ? H20,加压至5MPa，形成膨胀溶剂体系，保持 温度15°C，时间20min，水蛭蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成水蛭蛆虫蛋 白质粗品与甲醇_NH 3 ? H20的混合液； (3) 收集含有水蛭蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径30Mm的微孔过滤器过滤去处固体杂 质； (4) 溶液用孔径100nm的超滤机超滤处理，压力0. 5MPa，温度为常温，收集含有相应分 子量的水蛭蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用80%乙腈活化预处理，加0. 05%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用1〇~80%的乙腈梯度脱洗，流速 5mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率1. OKW，频率500KHz，流速200mL/ min，紫外检测器波长260nm ; (7)纯化后的水蛭蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~40°C、时间20h干燥制备 成冻干蛋白粉。
[0036] 实施例3: (1) 将1000g水蛭蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339. X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至〇. l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，水蛭蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的水蛭蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵，加压至2~10MPa，形成膨胀 溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，水蛭蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至 常压，生成水蛭蛆虫蛋白质粗品与乙醇-氯化铵的混合液； (3) 收集含有水蛭蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0. 5~50Mm的微孔过滤器过滤去处固 体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的水蛭蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1. 25:3. 75:5)溶剂体系中， 用超声驻波液相制备色谱（200920274485. 8 )分离纯化，超声波功率0. 2~3. 0KW，频率 500~1000KHz，流速 50~500mL/min，紫外检测器波长 260~280nm ; (7) 纯化后的水蛭蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~50°〇、时间18~2611干燥制 备成冻干蛋白粉