体外检测人细胞有丝分裂染色体不稳定性的方法与流程

文档序号:12056584阅读:来源:国知局

技术特征:

1.体外检测人细胞有丝分裂染色体不稳定性的方法,其特征在于,步骤包括:

(1)细胞培养:NCM460细胞使用RPMI-1640培养基,添加10%的新生牛血清、2mM的1%的谷氨酰胺以及5000IU/mL的0.1%的青霉素和5mg/mL链霉素,NCM460细胞培养在75cm2的玻璃或聚苯乙烯培养瓶中,放置CO2含量为5%、温度为37℃的湿润培养箱中;

(2)细胞处理:按5×105个/mL的密度将处于指数生长期的NCM460细胞接种到24孔板中,并分别加入0.05μg/mL和0.1μg/mL的丝裂霉素C处理24h,阴性对照组为不加丝裂霉素C的非处理组;

(3)细胞收集:处理结束后,将培养基上清收集到离心管中,并用磷酸缓冲盐溶液缓慢地清洗贴壁细胞2-3次,然后加入质量浓度为0.25%的胰蛋白酶,在37℃环境下对细胞进行短暂的消化,加入培养基上清将细胞吹打成单细胞悬液;

(4)细胞浓缩:将细胞悬液重新转移到离心管中,在1000转/分的条件下离心5分钟,弃上清加入少量的新鲜培养基并将细胞团块吹打成单细胞悬液;

(5)细胞涂片:将浓缩的细胞转移到涂片离心机中,在800转/分的条件下离心5分钟;

(6)细胞固定:取出载玻片,在室温下干燥5-10分钟,待完全干燥后将载玻片置于冰甲醇中、置于-40℃的环境下固定15分钟;

(7)细胞染色:将固定后的载玻片置于10%的吉姆萨染液中染色10分钟,之后将载玻片取出,在蒸馏水中缓慢地清洗3遍以上,并置于避光条件下室温干燥;

(8)细胞封片:带载玻片充分干燥后,使用中性树脂和大小为18mm×18mm的盖玻片对载玻片进行封片,封片完的载玻片在待计数之前应严格避光保存;

(9)染色体不稳定统计:使用光学显微镜对有丝分裂细胞进行观察,并对其中染色体不稳定指标进行频率统计。

2.根据权利要求1所述体外检测人细胞有丝分裂染色体不稳定性的方法,其特征在于,步骤(9)中,所述不稳定指标包括染色体错误排布、染色体多极排布、染色体滞后、极化染色体、染色质桥和染色体多极分离。

3.根据权利要求1所述体外检测人细胞有丝分裂染色体不稳定性的方法,其特征在于,所述染色体错误排布和染色体多极排布统计时,中期细胞统计数≥200个;所述染色体滞后、极化染色体、染色质桥和染色体多极分离,后/期细胞统计数≥100个。

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