肺癌多基因变异文库构建方法与流程

文档序号:12416780阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种肺癌多基因变异文库构建方法,其特征在于,包括以下步骤:

A.根据肺癌相关基因的变异区域,设计能够检测这些变异区域的引物对;

B.通过引物设计软件得到各引物对的参数W1、Tm1、W2和Tm2,从而计算得到各引物对的判断参数R,计算公式如下:

R=0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)];

其中,W1是扩增产物的GC含量,Tm1是扩增产物的退火温度,W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值,Tm2是上游引物退火温度和下游引物退火温度的平均值,

将判断参数R的值小于或等于1的引物对,归为第一组引物组合液,将判断参数R的值大于1的引物对,归为第二组引物组合液;

C.将待测样品DNA抽提纯化;

D.分别采用第一组引物组合液和第二组引物组合液对纯化后的样品进行初始PCR扩增得到目标片段,然后清除引物,采用第一组引物组合液进行初始PCR扩增时的退火温度低于采用第二组引物组合液进行初始PCR扩增时的退火温度;

E.对所述目标片段进行接头连接得到带接头片段,然后进行纯化;

F.采用第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液对纯化后的带接头片段进行文库PCR扩增,然后进行纯化,得到测序文库。

2.根据权利要求1所述的肺癌多基因变异文库构建方法,其特征在于:所述肺癌相关基因包括AKT1、ALK、BRAF、BRCA1、BRCA2、CDKN2A、C-met、DDR2、ERBB3、 FGFR2、FGFR4、HER2、KRAS、MAP2K1、mTOR、NRAS、NRF2、PIK3CA、PTCH1、RET、SMO、STK11,TSC1、TSC2,EGFR、TP53、PTEN、FGFR1中的一种或多种;其中AKT1、ALK、BRAF、BRCA1、BRCA2、CDKN2A、 C-met、DDR2、ERBB3、FGFR2、FGFR4、HER2、KRAS、MAP2K1、mTOR、NRAS、NRF2、PIK3CA、PTCH1、RET、SMO、STK11,TSC1、TSC2的变异测序类型是突变测序,EGFR、TP53、PTEN的变异测序类型是外显子测序;C-met、HER2、FGFR1、PIK3CA的变异测序类型是扩增测序。

3.根据权利要求1所述的肺癌多基因变异文库构建方法,其特征在于:所述引物对所覆盖的变异区域包括chr1:162754624-162754667、chr1:162754761-162754855、chr1:162759815-162759873、chr1:162775671-162775740、chr1:162778592-162778698、chr14:104770390-104770420、chr14:104772927-104772980、chr14:104773502-104773537、chr14:104773920-104773953、chr14:104775128-104775143、chr14:104776719-104776747、chr14:104780114-104780142、chr14:104792600-92637、chr2:29193886-29193891、chr2:29196820-29196858、chr2:29197575-29197633、chr2:29214035-29214042、chr2:29223520-29223528、chr2:29225500-29225518、chr2:29226922-29226934、chr2:29296963-29296968、chr2:29318371-29318380、chr2:29328373-29328388、chr2:29333767-29333795、chr2:29694861-29694888、chr2:29920019-29920086、chr7:140734607-140734688、chr7:140753301-140753370、chr17:43082440-43082543、chr17:43092005-43092100、chr17:43092907-43092953、chr17:43093990-43094074、chr17:43106475-43106492、chr17:43115753-43115774、chr13:32326505-32326575、chr13:32332322-32332386、chr13:32332536-32332638、chr13:32333139-32333219、chr13:32336459-32336562、chr13:32337435-32337471、chr13:32363206-32363316、chr13:32398684-32398766、chr9:21971186-21971208、chr9:21974764-21974803、chr9:21968234-21968234、chr12:56085007-56085128、chr12:56086541-56086555、chr12:56087577-56087640、chr12:56096505-56096539、chr12:56097153-56097184、chr12:56101967-56102051、chr10:121479871-121479899、chr10:121483723-121483769、chr10:121503794-121503854、chr10:121538612-121538640、chr10:121551339-121551363、chr10:121564503-121564565、chr10:121593750-121593777、chr5:177089639-17789673、chr5:177093269-177093311、chr5:177096144-177096163、chr5:177097296-177097324、chr12:25227304-25227374、chr12:25245285-25245312、chr15:66387410-66387421、chr15:66443280-66443310、chr15:66490556-66490572、chr1:11117046-11117073、chr1:11130582-11130597、chr1:11109657-11109693、chr1:11258571-11258588、chr1:114716116-11471652、chr2:177230956-177230973、chr2:177231581-177231624、chr2:177231869-177231911、chr9:95446922-95446944、chr9:95453505-95453539、chr9:95459693-95459726、chr9:95469086-95469107、chr9:95508250-95508271、chr10:43100510-43100560、chr10:43111228-43111238、chr10:43111342-43111412、chr10:43121969-43121991、chr7:129189158-129189225、chr7:129210436-129210486、chr7:129212139-129212169、chr19:1207007-1207038、chr19:1219351-1219462、chr19:1223130-1223160、chr9:132896605-132896654、chr9:132902616-132902673、chr9:132904419-132904449、chr9:132905730-132905803、chr9:132906751-132906779、chr9:132928836-132928863、chr16:2048689-2048723、chr16:2050409-2050486、chr16:2061964-2062005、chr16:2070478-2070523、chr16:2071878-2071911、chr16:2084534-2084653、chr16:2086217-2086296、chr3:179198915-179198966、chr3:179199803-179199860、chr3:179203618-179203697、chr3:179204553-179204586、chr3:179210214-179210276、chr17:39707104-39707141、chr17:39710358-39710389、chr17:39715774-39715862、chr17:39724825-39724865、chr17:39726571-39726598、chr17:39727871-39727981、chr7:116731688-116731707、chr7:116740046-116740083、chr7:116771552-116771574、chr7:116782003-116782070、chr7:116795915-116795945、chr7:116775003-116775102、chr8:38413973-38414170、chr8:38415881-38415915、chr8:38417348-38417370、chr8:38429801-38429814、chr8:38457373-38457422、chr7:55173921-55174039、chr7:55174726-55174810、chr7:55181301-55181337、chr7:55181365-55181457、chr7:55191729-55191869、chr17:7669616-7669662、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673831、chr17:7674183-7674253、chr17:7675053-7675108、chr17:7676214-7676245、chr10:87933035-87933086、chr10:87933124-87933183、chr10:87960993-87961048中的一个或多个。

4.根据权利要求1所述的肺癌多基因变异文库构建方法,其特征在于:所述步骤F中的混合液是第一组引物组合液和第二组引物组合液按照体积比为1﹕1混合而成。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的肺癌多基因变异文库构建方法,其特征在于:所述引物对的5’端均引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的肺癌多基因变异文库构建方法,其特征在于:所述步骤D中初始PCR扩增时,在反应体系中加入二甲基亚砜,加入二甲基亚砜的体积占反应体系体积的3%~7%。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的肺癌多基因变异文库构建方法,其特征在于:所述步骤F中文库PCR扩增时,在反应体系中加入甘油,加入甘油的体积占反应体系体积的5%~8%。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的肺癌多基因变异文库构建方法,其特征在于:所述步骤D中第一组引物混合液在初始PCR扩增时的实验条件是:99℃,2min,1个循环;99℃,15s,55℃,20s,72℃,30s 15个循环;

所述步骤D中第二组引物组合液在初始PCR扩增时的实验条件是:99℃,2min,1个循环;99℃,15s,65℃,20s,72℃,30s,15个循环。

9.根据权利要求1至4中任一项所述的肺癌多基因变异文库构建方法,其特征在于:所述步骤F中第一组引物组合液和第一组引物组合液的混合液在文库扩增的实验条件是:98℃,2min,1个循环;99℃,15s,62℃,1min,5个循环。

10.一种采用如权利要求1所述的肺癌多基因变异文库构建方法所构建的测序文库。

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