本发明涉及一种肺癌多基因变异文库构建方法，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：目前肿瘤的发病率和死亡率高于其他疾病，开发以非侵入式诊断策略进行肿瘤基因诊断研发，针对肿瘤靶标与化疗用药后复发、转移与抗药性，而传统疾病诊断通过临床经验、病理监测、细胞检测作为依据，有灵敏度的限制，也无法做到早期发现早期治疗或提早预测提早预防。新一代高通量基因检测技术，当今主要以Illumina公司的Hiseq，Miseq系列和Life公司的IonTorrentTM系列测序仪为代表，有着其他技术不可比拟的高通量、低成本等优势。已被广泛用于各类生物学研究核医学检测。对有参考的物种序列，进行全基因组重测序，在全基因组水平上检测突变位点，发现个体差异的分子基础。新一代测序技术通过全基因组测序构建了大量常规物种的基因组图谱，也促进了测序技术的告诉发展。同时，高通量测序技术在基因诊断和基因治疗方面也有着重要的作用，某些疾病的易感基因通常只占基因组很小的一部分，对这些易感基因的研究并不需要对全基因组测序，而只需要对特定的几个基因进行研究，目标序列捕获测序的出现，使得对基因组塔顶区域的研究成为可能。这项技术首先合成大量能与基因组特定区域互补结合的寡核苷酸序列，通过PCR扩增富集目标区段，然后用高通量测序技术对这些区段进行测序。SNPs(单核苷酸多态性)指在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一直，而只有一个碱基不同的现象。SNP是人类DNA中常见的变异形式，数以百万存在整个人类的基因组中，部分SNP能够导致蛋白质氨基酸编码改变或基因表达调控改变。拷贝数变异(CNV，Copynumbervariations)指在人类基因组中广泛存在的，从1Kbp到数百万bp范围内的缺失、插入、重复和复杂多位点的变异。SNPs和CNVs是人类表型变异的两个重要潜在来源，都是与基因组参考序列比对，与基因表达形状各有不同程度的显著相关。对SNPs的关联研究目前较多，许多CNVs位于基因结构变异的复杂区域，一些CNVs与邻近的SNPs存在连锁不平衡，可通过检验SNPs基因型推测邻近的CNVs。理想的是每个样本DNA能用一个整合的分析同时检测SNPs和CNVs，扩增子测序能根据研究者目的，针对目标区域进行高覆盖度的测序，还可以检测到低频突变。采用扩增子测序，研究者可以对基因组中感兴趣的关键区域进行重点研究。肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，肺癌的发病率在多数国家呈明显上升趋势,且逐年不断增高,是世界各地最常见癌的一种,其发病率及死亡率占各种恶性肿瘤的首位。因此研究和发现与肺癌发生、发展相关的因子对于肺癌的早期发现、早期诊断及治疗方案的拟定和预后的判断具有重要的意义。目前，对于肺癌基因检测的诊断方法多数停留在单个基因或者几个位点的检测水平，检测方法多为荧光PCR、芯片法等，但这种方法存在不同的缺陷，如操作复杂，引物或探针设计复杂、结果不易判读、重复性差、假阳性和假阴性多，检测灵敏度低、联合基因数目较少、通量低等，不能满足临床多样本多位点筛查、诊断和检测的实际需求，从而使肿瘤患者错失了最佳的治疗时期。而且多重PCR扩增效率的一致性一直是大难题。扩增子越多，不均一性越高。这使用大于500Kb的范围的测序，很难用扩增子测序的方法做好。利用深度测序检测CNV是近年来快速发展的新领域，CNV检测的分辨率和准确率随着测序深度的增加而提高。与芯片技术相比较，在足够测序深度的条件下，可以获得更加准确的CNV端点位置。并且，通过深度测序技术，可以检测基因芯片所不能检测的倒位和插入等基因组变异形式，由于深度测序技术无需设计探针，能在全基因组范围内以单个碱基的分辨率检测CNV，因而可以显著提高CNV的检出个数。为获得能满足文库扩增所需要的模板次级文库，经消化后的扩增产物需要聚丙烯酰氨凝胶电泳或琼脂糖凝胶纯化，去除未消化的核酸、消化后的碎片、核酸酶等，可见目前常见的次级文库制备方法存在产量低或者特异性差的缺陷。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种测序通量高，灵敏度强，特异性强，基于二代测序平台技术，能够用于检测游离DNA低频突变的肺癌多基因变异文库构建方法。本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种肺癌多基因变异文库构建方法，包括以下步骤：A.根据肺癌相关基因的变异区域，设计能够检测这些变异区域的引物对；B.通过引物设计软件得到各引物对的参数W1、Tm1、W2和Tm2，从而计算得到各引物对的判断参数R，计算公式如下：R＝0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)]；其中，W1是扩增产物的GC含量，Tm1是扩增产物的退火温度，W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值，Tm2是上游引物退火温度和下游引物退火温度的平均值，将判断参数R的值小于或等于1的引物对，归为第一组引物组合液，将判断参数R的值大于1的引物对，归为第二组引物组合液；C.将待测样品DNA抽提纯化；D.分别采用第一组引物组合液和第二组引物组合液对纯化后的样品进行初始PCR扩增得到目标片段，然后清除引物，采用第一组引物组合液进行初始PCR扩增时的退火温度低于采用第二组引物组合液进行初始PCR扩增时的退火温度；E.对所述目标片段进行接头连接得到带接头片段，然后进行纯化；F.采用第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液对纯化后的带接头片段进行文库PCR扩增，然后进行纯化，得到测序文库。上述肺癌相关基因包括AKT1、ALK、BRAF、BRCA1、BRCA2、CDKN2A、C-met、DDR2、ERBB3、FGFR2、FGFR4、HER2、KRAS、MAP2K1、mTOR、NRAS、NRF2、PIK3CA、PTCH1、RET、SMO、STK11，TSC1、TSC2，EGFR、TP53、PTEN、FGFR1中的一种或多种；其中AKT1、ALK、BRAF、BRCA1、BRCA2、CDKN2A、C-met、DDR2、ERBB3、FGFR2、FGFR4、HER2、KRAS、MAP2K1、mTOR、NRAS、NRF2、PIK3CA、PTCH1、RET、SMO、STK11，TSC1、TSC2的变异测序类型是突变测序，EGFR、TP53、PTEN的变异测序类型是外显子测序；C-met、HER2、FGFR1、PIK3CA的变异测序类型是扩增测序。上述引物对所覆盖的变异区域包括chr1：162754624-162754667、chr1：162754761-162754855、chr1：162759815-162759873、chr1：162775671-162775740、chr1：162778592-162778698、chr14:104770390-104770420、chr14:104772927-104772980、chr14:104773502-104773537、chr14:104773920-104773953、chr14:104775128-104775143、chr14:104776719-104776747、chr14:104780114-104780142、chr14:104792600-92637、chr2:29193886-29193891、chr2:29196820-29196858、chr2:29197575-29197633、chr2:29214035-29214042、chr2:29223520-29223528、chr2:29225500-29225518、chr2:29226922-29226934、chr2:29296963-29296968、chr2:29318371-29318380、chr2:29328373-29328388、chr2:29333767-29333795、chr2:29694861-29694888、chr2:29920019-29920086、chr7:140734607-140734688、chr7:140753301-140753370、chr17：43082440-43082543、chr17：43092005-43092100、chr17：43092907-43092953、chr17：43093990-43094074、chr17：43106475-43106492、chr17：43115753-43115774、chr13：32326505-32326575、chr13：32332322-32332386、chr13：32332536-32332638、chr13：32333139-32333219、chr13：32336459-32336562、chr13：32337435-32337471、chr13：32363206-32363316、chr13：32398684-32398766、chr9：21971186-21971208、chr9：21974764-21974803、chr9：21968234-21968234、chr12：56085007-56085128、chr12：56086541-56086555、chr12：56087577-56087640、chr12：56096505-56096539、chr12：56097153-56097184、chr12：56101967-56102051、chr10：121479871-121479899、chr10：121483723-121483769、chr10：121503794-121503854、chr10：121538612-121538640、chr10：121551339-121551363、chr10：121564503-121564565、chr10：121593750-121593777、chr5：177089639-17789673、chr5：177093269-177093311、chr5：177096144-177096163、chr5：177097296-177097324、chr12：25227304-25227374、chr12：25245285-25245312、chr15：66387410-66387421、chr15：66443280-66443310、chr15：66490556-66490572、chr1：11117046-11117073、chr1：11130582-11130597、chr1：11109657-11109693、chr1：11258571-11258588、chr1：114716116-11471652、chr2:177230956-177230973、chr2:177231581-177231624、chr2:177231869-177231911、chr9:95446922-95446944、chr9:95453505-95453539、chr9:95459693-95459726、chr9:95469086-95469107、chr9:95508250-95508271、chr10:43100510-43100560、chr10:43111228-43111238、chr10:43111342-43111412、chr10:43121969-43121991、chr7:129189158-129189225、chr7:129210436-129210486、chr7:129212139-129212169、chr19:1207007-1207038、chr19:1219351-1219462、chr19:1223130-1223160、chr9:132896605-132896654、chr9:132902616-132902673、chr9:132904419-132904449、chr9:132905730-132905803、chr9:132906751-132906779、chr9:132928836-132928863、chr16:2048689-2048723、chr16:2050409-2050486、chr16:2061964-2062005、chr16:2070478-2070523、chr16:2071878-2071911、chr16:2084534-2084653、chr16:2086217-2086296、chr3:179198915-179198966、chr3:179199803-179199860、chr3:179203618-179203697、chr3:179204553-179204586、chr3:179210214-179210276、chr17:39707104-39707141、chr17:39710358-39710389、chr17:39715774-39715862、chr17:39724825-39724865、chr17:39726571-39726598、chr17:39727871-39727981、chr7:116731688-116731707、chr7:116740046-116740083、chr7:116771552-116771574、chr7:116782003-116782070、chr7:116795915-116795945、chr7:116775003-116775102、chr8:38413973-38414170、chr8:38415881-38415915、chr8:38417348-38417370、chr8:38429801-38429814、chr8:38457373-38457422、chr7:55173921-55174039、chr7:55174726-55174810、chr7:55181301-55181337、chr7:55181365-55181457、chr7:55191729-55191869、chr17:7669616-7669662、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673831、chr17:7674183-7674253、chr17:7675053-7675108、chr17:7676214-7676245、chr10:87933035-87933086、chr10:87933124-87933183、chr10:87960993-87961048中的一个或多个。上述步骤F中的混合液是第一组引物组合液和第二组引物组合液按照体积比为1﹕1混合而成。上述引物对的5’端均引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基。上述步骤D中初始PCR扩增时，在反应体系中加入二甲基亚砜，加入二甲基亚砜的体积占反应体系体积的3％～7％。上述步骤F中文库PCR扩增时，在反应体系中加入甘油，加入甘油的体积占反应体系体积的5％～8％。上述步骤E中带接头片段的纯化是采用磁珠进行纯化，所述步骤F中文库PCR扩增产物的纯化是采用磁珠进行纯化。上述步骤D中第一组引物混合液在初始PCR扩增时的实验条件是：99℃，2min，1个循环；99℃，15s，55℃，20s，72℃，30s15个循环；上述步骤D中第二组引物组合液在初始PCR扩增时的实验条件是：99℃，2min，1个循环；99℃，15s，65℃，20s，72℃，30s，15个循环；上述步骤F中第一组引物组合液和第一组引物组合液的混合液在文库扩增的实验条件是：98℃，2min，1个循环；99℃，15s，62℃，1min，5个循环。本发明具有积极的效果：(1)本发明提供一种基于二代测序平台技术的肺癌多基因文库构建方法，能够实现样本浓度低起始量(低于10ng)、高通量、短周期、低成本的建库。采用本发明的文库构建方法所得到的文库进行测序，可以一次检测27个基因的上百个突变位点和4基因的拷贝数变异，相对于一代测序突变的成本节约5000元/样本。该文库能够同时检测SNPs和CNVs等基因变异，通过对测序结果分析可以对肺癌患者进行预后评估。(2)本发明中所用的引物组合物是针对肺癌相关基因突变位点的特定序列进行设计，通过5’端引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基，使得各引物之间相互干扰性小。通过分管扩增捕获所选取变异区域，相互之间几乎不干扰。根据判断参数R将引物组合物分管进行扩增，在其他条件相同的条件下，文库构建的成功率由原来的70％提高到93％。本发明可以用于微量DNA文库构建，降低对检测样本的要求，样本的DNA浓度可以低至1ng～10ng，与其他建库相比，文库起始量降低了40ng。(3)本发明计算的基因突变、基因拷贝数变异与金标准实验结果对比，二代测序的敏感度和特异度分别是98.6％和99.2％；(4)本发明对样本的DNA浓度要求很低，所以可以适用于游离循环肿瘤DNA(针对肺癌病人的外周血DNA，ctDNA)，省去组织穿刺(biopsy)的肿瘤细胞纯度不足、采样不便、不确定风险与传统方法难测到基因突变的感度、覆盖度问题；具有方便采样、可早期检测与复发评估、易定期追踪、高灵敏度、高精准分辨率及专一性的优势。(5)本发明对初始扩增和文库扩增过程中使用的试剂进行优化，建立最适合建库的反应条件，与现有的实验步骤相比，本发明在文库初始扩增和文库扩增，引入一定少量的有机试剂，初始扩增时采用二甲基亚砜、文库扩增时采用甘油，通过在反应步骤中加入有机试剂，文库构建的成功率由原来的93％提高到97％。具体实施方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本
发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。主要试剂：所有试剂购买自正规厂家：MultisourceGenomicDNAMiniprepKit(Axygen)、肺癌多基因检测引物第一组引物组合液和第二组引物组合液(上海百力格生物技术有限公司)、5*IonAmpliSeqTMHiFiMix(Lifetechnologies)、FuPaReagentTM(Lifetechnologies)、AmPureXPReagent磁珠(Lifetechnologies)、IonPGMBeads(Lifetechnologies)、PGMTemplateOT2Solutions(Lifetechnologies)、PlatinumPCRSuperMixHighFidelity(Lifetechnologies)、LibraryAmplificationPrimerMix(Lifetechnologies)等。上机模板准备和上机过程中用到的试剂和耗材与IonTorrent二代测序平台相配套，包括PGMTemplateOT2kit和Ion314chip等部分。本方法实验前需要新鲜配制的试剂：75％乙醇(100％乙醇与无核酸酶水按3:1比例配制)。主要仪器：IonTorrentPGM测序仪、3.0荧光定量仪、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、灭菌锅、磁力架、移液枪、PCR仪、震荡仪等。本实施例的肺癌多基因变异文库构建方法，包括以下步骤：A.根据肺癌相关基因的变异区域，设计能够检测这些变异区域的引物对；B.根据引物和产物的GC含量、Tm值，将引物对分成两组，即第一组引物组合液和第二组引物组合液；C.将待测样品DNA抽提纯化；D.采用第一组引物组合液和第二组引物组合液对纯化后的样品分别进行初始PCR扩增，得到目标片段，然后清除引物；E.对所述目标片段进行接头连接得到带接头片段，然后采用磁珠进行纯化；F.采用第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液对纯化后的带接头片段进行文库PCR扩增，然后采用磁珠进行纯化，得到测序文库。整个过程中，也可以在任何步骤按照要求通过切胶回收或磁珠片段选择的方法对DNA片段分子大小进行选择，最终获得所需大小DNA片段的文库分子，并且在接头连接中引入特征性序列标签，用于测序中不同文库的区分。与阴性样品，质控品一起进行大规模平行测序，仪器获得的结果经数据处理和生物信息学分析，得出样本中含有的SNP位点信息。所述阴性样本为正常人基因组DNA，所述的质控品为加入1％的controlparticles,是一种商品化试剂，包含在上机测序的试剂盒PGMSequencingOT2kit中，作为上机测序实验的内参，对测序情况进行评估和质控，如果测序结果中不包含1％的controlparticles结果，说明上机实验失败，结果不可靠。一、引物设计。根据肺癌相关基因的变异区域，设计能够检测这些变异区域的引物对。本发明中，肺癌相关基因包括但不限于下列基因：表1肺癌多基因信息表序号基因名称DNALocusmRNALocus测序类型1AKT1NG_012188.1NM_001014431突变测序2ALKNG_009445.1NM_004304突变测序3BRAFNG_007873.3NM_004333突变测序4BRCA1NG_005905.2NM_007294突变测序5BRCA2NG_012772.3NM_000059突变测序6CDKN2ANG_007485.1NM_000077突变测序7DDR2NG_016290.1NM_001014796突变测序8ERBB3NG_011529.1NM_001005915突变测序9FGFR2NG_012449.2NM_000141突变测序10FGFR4NG_012067.1NM_001291980突变测序11KRASNG_007524.1NM_004985.4突变测序12MAP2K1NG_008305.1NM_002755突变测序13mTORNG_033239.1NM_004958突变测序14NRASNG_007572.1NM_002524突变测序15NRF2NC_000002.1NM_001145412突变测序16PTCH1NG_007664.1NM_000264突变测序17RETNG_007489.1NM_020630突变测序18SMONG_023340.1NM_005631突变测序19STK11NG_007460.2NM_000455突变测序20TSC1NG_012386.1NM_000368突变测序21TSC2NG_005895.1NM_000548突变测序22PIK3CANG_012113.2NM_006218突变、扩增测序23HER2NG_007503.1NM_001005862突变、扩增测序24C-metNG_008996.1NM_000245突变、扩增测序25FGFR1NG_007729.1NM_001174063扩增测序26EGFRNG_007726.3NM_005228外显子测序27TP53NG_017013.2NM_000546外显子测序28PTENNG_007466.2NM_000314外显子测序本实施例根据上述各肺癌相关基因的变异区域，设计用于检测这些肺癌相关基因的变异区域是否存在变异的引物对。变异区域包括各基因的外显子区域，或者与外显子相连的上下游30bp的内含子区域，或者与肺癌相关的其他突变区域。引物对能够覆盖表1中所有基因的需要检测的变异区域。所覆盖的区域如下：chr1：162754624-162754667、chr1：162754761-162754855、chr1：162759815-162759873、chr1：162775671-162775740、chr1：162778592-162778698、chr14:104770390-104770420、chr14:104772927-104772980、chr14:104773502-104773537、chr14:104773920-104773953、chr14:104775128-104775143、chr14:104776719-104776747、chr14:104780114-104780142、chr14:104792600-92637、chr2:29193886-29193891、chr2:29196820-29196858、chr2:29197575-29197633、chr2:29214035-29214042、chr2:29223520-29223528、chr2:29225500-29225518、chr2:29226922-29226934、chr2:29296963-29296968、chr2:29318371-29318380、chr2:29328373-29328388、chr2:29333767-29333795、chr2:29694861-29694888、chr2:29920019-29920086、chr7:140734607-140734688、chr7:140753301-140753370、chr17：43082440-43082543、chr17：43092005-43092100、chr17：43092907-43092953、chr17：43093990-43094074、chr17：43106475-43106492、chr17：43115753-43115774、chr13：32326505-32326575、chr13：32332322-32332386、chr13：32332536-32332638、chr13：32333139-32333219、chr13：32336459-32336562、chr13：32337435-32337471、chr13：32363206-32363316、chr13：32398684-32398766、chr9：21971186-21971208、chr9：21974764-21974803、chr9：21968234-21968234、chr12：56085007-56085128、chr12：56086541-56086555、chr12：56087577-56087640、chr12：56096505-56096539、chr12：56097153-56097184、chr12：56101967-56102051、chr10：121479871-121479899、chr10：121483723-121483769、chr10：121503794-121503854、chr10：121538612-121538640、chr10：121551339-121551363、chr10：121564503-121564565、chr10：121593750-121593777、chr5：177089639-17789673、chr5：177093269-177093311、chr5：177096144-177096163、chr5：177097296-177097324、chr12：25227304-25227374、chr12：25245285-25245312、chr15：66387410-66387421、chr15：66443280-66443310、chr15：66490556-66490572、chr1：11117046-11117073、chr1：11130582-11130597、chr1：11109657-11109693、chr1：11258571-11258588、chr1：114716116-11471652、chr2:177230956-177230973、chr2:177231581-177231624、chr2:177231869-177231911、chr9:95446922-95446944、chr9:95453505-95453539、chr9:95459693-95459726、chr9:95469086-95469107、chr9:95508250-95508271、chr10:43100510-43100560、chr10:43111228-43111238、chr10:43111342-43111412、chr10:43121969-43121991、chr7:129189158-129189225、chr7:129210436-129210486、chr7:129212139-129212169、chr19:1207007-1207038、chr19:1219351-1219462、chr19:1223130-1223160、chr9:132896605-132896654、chr9:132902616-132902673、chr9:132904419-132904449、chr9:132905730-132905803、chr9:132906751-132906779、chr9:132928836-132928863、chr16:2048689-2048723、chr16:2050409-2050486、chr16:2061964-2062005、chr16:2070478-2070523、chr16:2071878-2071911、chr16:2084534-2084653、chr16:2086217-2086296、chr3:179198915-179198966、chr3:179199803-179199860、chr3:179203618-179203697、chr3:179204553-179204586、chr3:179210214-179210276、chr17:39707104-39707141、chr17:39710358-39710389、chr17:39715774-39715862、chr17:39724825-39724865、chr17:39726571-39726598、chr17:39727871-39727981、chr7:116731688-116731707、chr7:116740046-116740083、chr7:116771552-116771574、chr7:116782003-116782070、chr7:116795915-116795945、chr7:116775003-116775102、chr8:38413973-38414170、chr8:38415881-38415915、chr8:38417348-38417370、chr8:38429801-38429814、chr8:38457373-38457422、chr7:55173921-55174039、chr7:55174726-55174810、chr7:55181301-55181337、chr7:55181365-55181457、chr7:55191729-55191869、chr17:7669616-7669662、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673831、chr17:7674183-7674253、chr17:7675053-7675108、chr17:7676214-7676245、chr10:87933035-87933086、chr10:87933124-87933183、chr10:87960993-87961048。本实施例中的引物对的设计和制备采用现有的常规方法。本实施例中的引物对包括特异性上游引物和特异性下游引物，上游引物和下游引物是根据所覆盖的变异区域在参考基因组的起始和终止位置设计的。引物均由母液稀释而成，母液由百力格生物技术有限公司合成的干粉稀释而成，引物的最终浓度为100nM。引物纯度应达到PAGE或者HPLC级，不含杂带。设计时所用核苷酸序列均来自NCBI数据库公布的基因序列，引物扩增后的产物长度主要集中在100bp-500bp之间。引物的核苷酸序列可为任意的已知序列，其序列自身不形成发卡二级结构，且G、C含量占碱基数量总和的30％～70％，引物序列选择长度18bp～25bp的核苷酸序列。使用专门的多重引物设计软件包(如DNAsoftwares的VisualOMP,MultiPLX，ABI的PrimerExpress等)来设计引物，为了减少在核酸扩增过程中假象例如引物二聚体的形成，引物对经过预测在扩增过程中显示最小的与引物中其他引物的相互作用、各个引物对的Tm等参数尽量接近、不要存在严重的二级结构比如发夹、dimers等。通过使用不同的软件，综合评价，将引物尽可能设计为靶特异性或者扩增子特异性的，并且引物通常被分组为子集以使引物间相互作用、引物二聚体形成和超级扩增子减少至最低程度。PCR的延伸是从引物3’端开始的，并决定着PCR产物的特异性，而5’端则限定PCR产物的长度。5’端修饰后不但不影响正常的PCR反应，而且修饰后的引物能够更稳定地与模板结合，对于PCR产物的分析与进一步操作有很大的方便，在引物上进行基团修饰，引物所携带的修饰基团隔离开其他引物，使得同一反应体系中，完成更多引物的同时扩增。引物5’端修饰包括磷酸化修饰、氨基修饰和引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基，优选地为5’端引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基。本实施例中设计的引物对是经过反复实验筛选验证得到的最佳组合引物对，能够实现高效、快速、微量建库，保持了与现有建库方法的文库测序流程的兼容性，灵活方便，可以用于IonProton测序平台，适于构建IonProton的文库，构建文库可以直接上机测序。本实施例中的引物对可以直接应用到不同的第二代测序平台，包括但不限于由Illumina，LifeTechnologies(ABI)，Roche，HelicosBiotechnologies，PacificBiosciences这些公司制造的仪器，同样也适用于其它厂商生产的测序仪。二、引物对分组。由于扩增的模板是固定的序列模板，设计引物时不可避免会有GC含量和Tm值不一致的引物对，为了顺利构建测序文库，这些差别较大的引物对在实验的过程中对实验条件和样本的要求会更加严格，并且实验结果不一定立项。退火温度是引物和模板结合时候的温度参数，即当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度，它是影响PCR特异性的较重要因素，为了确定较适合的退火温度，根据引物和产物的GC含量、退火温度等相关参数计算的判断参数R，从而更加方便准确地将设计合成、稀释后引物分成两组。判断参数R的计算公式如下：R＝0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)]。其中，W1是扩增产物的GC含量，Tm1是扩增产物的退火温度，W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值，Tm2是上游引物退火温度和下游引物退火温度的平均值。W1、W2、Tm1、Tm2是设计引物核苷酸序列时，通过多重引物设计软件包，自动生成的参数。通过软件包生成的参数代入，计算公式得到所有引物对的判断参数R(R一般保留5位有效数字)，其中判断参数R的值小于或等于1的引物对，归为第一组引物混合液，判断参数R的值大于1的引物对，归为第二组引物混合液。以基因DDR2为例，在NCBI数据库中找到该基因的DNA序列(NG_016290)，找到DNA序列中检测覆盖区域：chr1：162754624-162754667、chr1：162754761-162754855、chr1：162759815-162759873、chr1：162775671-162775736、chr1：162778592-162778698；根据软件PrimerExpress设计覆盖目的区域的引物对，引物对尽可能设计为靶特异性并且与其他引物不相互干扰，设计后的引物核苷酸序列如表2所示。表2DDR2引物序列表表2中的引物由百力格生物技术有限公司合成，合成引物的5’端引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基。根据判断参数R的取值，序号为1、2、4的引物对归为第一组引物组合液；序号为3和5的引物对归为第二组引物组合液。其他肺癌相关基因的引物设计和分组参照DDR2基因，最终将设计检测肺癌相关基因变异区域的所有引物对分组，引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基的引物对分别合成稀释后，按照分组的结果配置成第一组引物对组合液和第二组引物组合液。第一组引物对组合液和第二组引物组合液在初始扩增分别进行初始扩增反应，能够增加每个反应扩增产物的总体产物率，然后在引物清除步骤再将扩增产物等量混合在一起进行实验。三、待测样品DNA抽提纯化。本实施例中检测5例肺癌患者的组织样本和5例正常组织样本，这10例样本的相关位点已经经过ARMS验证。本发明中的检测样本为能提取核酸的任意形式的肿瘤样品，较佳地为组织样本，包括但不限于：全血、血清、血浆和组织样品；组织样品包括但不限于：石蜡包埋组织、新鲜组织和冰冻切片。3.1样本DNA抽提采用试剂盒(AxygenMultisourceGenomicDNAMiniprepKit)提取肺癌患者组织样本的DNA，具体的操作参见试剂盒产品说明书。抽提结束后用Thermo-Fisher核酸蛋白定量仪(NanoDrop2000)测定样本浓度。3.2DNA纯化1)取5ngDNA，加入Nuclease-freeWater至40μL；2)加入1.5倍体积(60μL)Ampurebeads，室温放置5min，再放置于磁力架上约5min，至澄清；3)弃上清，用75％的酒精(200μL，现配现用)洗涤2次，晾干(不要过干)；4)用25μLNuclease-freeWater溶解，Qubit检测浓度。3.3组织样本DNA浓度测定采用3.0对抽提后的DNA浓度测定：1)向样本管加入1ulQubitdsDNAHSReagent和199ulQubitdsDNAHSbuffer,漩涡混匀4s；2)向已添加工作液的样品管内吸弃1ul工作液，加入1ul的DNA样本，漩涡混匀4s，每管的最终体积是200ul；3)所有管在室温避光孵育2分钟；4)在3.0主屏上点击“DNA”键，然后选择dsDNAHighSensitivity分析模式；5)把样本管放入3.0中，盖上盖子，点击read；6)选择CalculateInitial初始浓度，然后选择VolumeofSampleUsed:1ul，此时显示的结果为样本初始浓度，单位ng/ul；7)读取下一个样本：取出Qubit3.0荧光光度计中样本。四、获得目标片段。分别采用第一组引物组合液和第二组引物组合液对纯化后的样品进行初始PCR扩增得到目标片段，然后清除引物。4.1初始PCR扩增由于初始PCR扩增是多重PCR反应，每一个引物对在扩增反应中与另外的引物竞争有限量的dNTPs、聚合酶和其他试剂，因此存在对改进的方法和组合物需要，以允许选择性扩增一群核酸分子内的多个靶核酸分子，同时避免非特异性扩增产物和引物二聚体的形成，或者将非特异性扩增产物和引物二聚体的程度降至最低，达到更高效、低浓度检测。本发明在反应体系中加入有机试剂，有机试剂包括甘油、橄榄油、DMSO(二甲基亚砜)，优选地，在初始扩增加入的有机试剂为DMSO(二甲基亚砜)。采用本实施例的第一组引物组合液和第二组引物组合液，若样本的浓度大于10ng，可以将第一组引物组合液和第二组引物组合液混合在一起对样本进行初始PCR扩增。若样本的浓度小于10ng，必须分别采用第一组引物组合液和第二组引物组合液进行初始PCR扩增，以保证文库的质量，下面以样本的浓度小于10ng为例。按照表3中的初始PCR扩增反应体系，进行试剂配比。表3初始PCR扩增反应体系成分反应体系分为两管，一管反应体系采用第一组引物组合液，另一管反应体系采用第二组引物组合液，其他成分相同。在反应体系中加入少量的二甲基亚砜(DMSO)，能够降低熔解温度，有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区，提高引物特异性，有效促进GC含量高达52％～73％模板的扩增，使用低浓度的引物，少量循环，使得引物间互不干扰。分两管分别进行初始PCR扩增反应得到目标片段(目标区域测序目的片段)，采用第一组引物组合液的扩增反应程序如表4所示，采用第二组引物组合液的扩增反应程序如表5所示。表4采用第一组引物组合液的扩增反应程序表5采用第二组引物组合液的扩增反应程序PCR反应条件：特异引物与靶序列退火延伸，选择较高的复性温度以减少引物和模板间的非特异性结合,确保PCR反应的特异性。复性时间略微延长,以使引物与模板之间完全结合，但是延伸时间不宜过长,否则会导致非特异性扩增带的出现。4.2引物清除在两管扩增反应分别获得目标片段后，不同的扩增目标区域产物再混合在同一个反应体系中，进行文库构建步骤，降低了样品检测的要求，提高测序反应的效率。将两管初始PCR扩增的产物等体积混合成一管，取20ul的PCR产物混合物，加入2ulFuPaReagent，此时总体积为22μL，漩涡充分混匀，瞬间离心2秒，根据表6的程序清除引物。表6引物清除反应程序PCR产物可立即使用或保存于-20℃冰箱。五、获得接头片段。对目标片段进行接头连接得到带接头片段，然后采用磁珠进行纯化。5.1接头反应拿出SwitchSolution，室温混匀，将清除引物后的目标片段置于样品管中，漩涡充分混匀，瞬间离心2秒,取2ul加入如表7所示的接头反应体系中。表7接头反应体系成分表将上述反应体系放入PCR仪内，进行引物清除，反应程序如表8所示。表8接头反应程序表Barcode为合成的单链，其中所述随机序列有6～12个碱基随机组成且位于靠近单链游离DNA3’端的一侧，所述Adaptor序列为任意的已知序列且位于远离单链游离DNA3’端的一侧，两种试剂均由LifeTechnologies提供。通过连接反应，获得各连接唯一标签序列的核酸样本，样品可立即使用或保存于-20℃冰箱。5.2纯化，采用AmpureXPReagent磁珠：1)向样品管中加入45μL(1.5倍样品体积)AmpureXPReagent，混匀，室温孵育5min；2)将样品管放在磁力架上，静置2min，至管内溶液完全澄清；3)弃上清，保持离心管在磁力架上，温和添加150μL70％酒精(现配现用)洗涤beads(轻轻旋转样品管，充分洗涤)；4)重复上述步骤，充分去除酒精，晾干(磁力架上晾干，不要过干)。5.3测定样本库的浓度1)向样本管加入1ulQubitdsDNAHSReagent和199ulQubitdsDNAHSbuffer,漩涡混匀4s；2)向已添加工作液的样品管内吸弃3ul工作液，加入3ul的DNA样品，漩涡混匀4s，每管的最终体积是200ul；3)所有管在室温避光孵育2分钟；4)在3.0主屏上点击“DNA”键，然后选择dsDNAHighSensitivity分析模式；5)把样本管放入3.0中，盖上盖子，点击read；6)选择CalculateInitial初始浓度，然后选择VolumeofSampleUsed:3ul，此时显示的结果为样本初始浓度，单位ng/ul；7)读取下一个样品：取出Qubit3.0荧光光度计中样品，放入新的样品，按“ReadNextSsmple”；8)重复样本读数，直到所有样品读完。六、文库扩增和纯化6.1文库扩增由于文库构建是多重PCR反应，每一个引物对在扩增反应中与另外的引物竞争有限量的dNTPs、聚合酶和其他试剂，因此存在对改进的方法和组合物需要，以允许选择性扩增一群核酸分子内的多个靶核酸分子，同时避免非特异性扩增产物和引物二聚体的形成，或者将非特异性扩增产物和引物二聚体的程度降至最低，达到更高效、低浓度检测。本发明在反应体系中加入有机试剂，有机试剂包括甘油、橄榄油、DMSO(二甲基亚砜)，优选地，在文库扩增加入的有机试剂为甘油。向纯化后风干的样品中加入50μLPlatinumPCRSuperMixHighFidelity(黑色盖)、3.5ul甘油和2ul的第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液,重悬磁珠混匀，磁力架上放置3min，取上清至PCR管中，漩涡混匀进行PCR扩增，扩增反应程序如表9所示。表9文库扩增反应程序表甘油能够提高文库产量，有利于扩增后上机测序，扩增后的PCR产物可立即使用或保存于-20℃冰箱。6.2文库纯化文库进行磁珠纯化，采用AMPureXPReagent磁珠：1)将PCR产物转移至1.5ml离心管内，加入25ul(0.5倍样品体积)AMPureXPReagent充分吹打混匀，室温孵育5min；2)将样本放置磁力架上，等待5min至管内溶液完全澄清；4)小心吸取上清液并转移到新的1.5ml离心管内；5)向上述步骤的离心管中加入60ul(1.2倍原始样品体积)的AMPureXPReagent磁珠，吹打混匀，室温孵育5min；6)将样本管放在磁力架上静止3min或至溶液澄清，弃上清；7)保持离心管在磁力架上，温和添加150ul新鲜配制的75％酒精溶液洗涤beads(轻轻转动样品管，充分洗涤)，旋转离心管，小心去除酒精；8)重复上述步骤清洗一次，充分去除酒精，晾干(磁力架上晾干，不要过干)，室温风干磁珠5min，不要过度干燥；9)将样品管从磁力架上取下，加入50μLLowTE溶液到样本管内，漩涡混匀；10)将样本管放置在磁力架上，静止2min，将洗脱的上清液转移到新的离心管内，用Qubit检测样品浓度；6.3用3.0测定样本库的浓度1)向样本管加入1ulQubitdsDNAHSReagent和199ulQubitdsDNAHSbuffer,漩涡混匀4s；2)向已添加工作液的样品管内吸弃3ul工作液，加入3ul的DNA样品，漩涡混匀4s，每管的最终体积是200ul；3)所有管在室温避光孵育2分钟；4)在3.0主屏上点击“DNA”键，然后选择dsDNAHighSensitivity分析模式；5)把样本管放入3.0中，盖上盖子，点击read；6)选择CalculateInitial初始浓度，然后选择VolumeofSampleUsed:3ul，此时显示的结果为样本初始浓度，单位ng/ul；7)读取下一个样品：取出Qubit3.0荧光光度计中样品，放入新的样品，按“ReadNextSample”；8)重复样本读数，直到所有样品读完；纯化后的文库可直接通过IonTorrent平台进行上机测序，测序结束以后，对获得的测序数据进行分析，通过比对设计的引物和位点信息，筛选出肺癌相关基因上的基因突变和变异。本发明的检测结果与临床ARMS法检测结果一致，测序反应样本的数量分布均匀。本发明对肺癌多基因变异具有检测通量高、特异性强、不易污染、安全性高的优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，对肺癌患者的临床治疗提供辅助诊断和提示作用。根据收集的样本检测情况，按照阴性样本的结果去除的SNP位点，5例肺癌患者在10个基因上共检测出11个热点SNP位点，而正常组织样本未检测出所述热点SNP位点。本发明实施方式中，所述的基因变异存在于肺癌但不仅限于如表1列出的肺癌相关基因，也存在常见胃癌、肝癌、乳腺癌、肠癌、食管癌等相关基因。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。发明人经深入研究和筛选得到一组可以用于IonProton的文库，构建的文库可以直接可以上机测序。多基因的变异包括突变、拷贝数变异和倒位中的至少两种，能够全面对肺癌患者的治疗和预后做出指南。为了降低对组织样本浓度和质量的要求，提高测序文库构建的成功率，本发明进行了以下尝试1)采用1ng、3ng、5ng、7ng、9ng的组织抽提DNA样本，根据常用的退火温度55℃进行初始浓度扩增，对文库扩增使用60℃退火温度，测得文库的浓度均低于0.5ng/ul。对初始扩增和文库扩增的退火温度进行50℃～65℃的梯度实验，文库的成功率仍然很低；2)根据软件设计引物参数对引物对进行分组，分组以50％为界，上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值小于等于50％为第一组引物组合物，上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值大于50％为第二组引物组合物，第一组引物组合物采用的50℃退火温度进行初始浓度扩增，文库扩增使用60℃退火温度，第二组引物组合物采用的60℃退火温度进行初始浓度扩增，文库扩增使用60℃退火温度，相对于初始扩增不分管扩增，文库的成功率虽然有所提高，但是低于50％；3)退火温度是影响PCR特异性的较重要因素，良好的退火温度，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂，退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成，还有模板序列组成和长度。本发明综合考虑了引物和产物的GC含量和退火温度参数对PCR反应的影响，设计了分管判断参数R，根据判断参数R对引物对分组，在初始扩增和文库扩增的退火温度进行50℃～65℃的梯度试验，选择文库成功率较高的退火温度，最终优选第一组引物组合液初始扩增的退火温度为55℃，第二组引物组合液初始扩增的退火温度为65℃，第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液在文库扩增的退火温度为62℃，文库构建成功率大幅度提升，特别适用于文库起始量低至1ng～10ng的情况。上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。当前第1页1 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