本发明属于天然产物提取
技术领域：
，具体涉及一种蝇蛆非甲壳素多糖及其提取方法和应用。
背景技术：
：多糖一般是由10个以上相同或不同的单糖基通过苷键连接而成的聚糖，在生物体内具有调节免疫等功能。具体功能与其分子结构密切相关。微生物、植物和动物均含多糖。不同来源多糖的生物活性不尽相同。昆虫是自然界种类最多、数量最大的生物类群。蚕蛹多糖的提取已见报道。家蝇(MuscadomesticaLinnaeus)是一种世代周期短、繁殖率高、养殖技术简单、养殖设备投资小的昆虫资源。家蝇幼虫(俗称蝇蛆)体内含有多种活性物质，不同的蝇蛆提取物陆续见诸报道。包括蝇蛆蛋白质、抗菌肽、甲壳素、壳聚糖和磷脂。曾有报道从家蝇中提取调节免疫的物质的报道(高嘉，家蝇中免疫及抗菌活性物质的分离与纯化，天津轻工业学院研究生学位论文)。究其实际的提取物，实际上是凝集素和抗菌肽的分离。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种蝇蛆非甲壳素多糖。本发明的另一目的在于提供上述蝇蛆非甲壳素多糖的提取方法。本发明的再一目的在于提供上述蝇蛆非甲壳素多糖的应用本发明的技术方案如下：一种蝇蛆非甲壳素多糖，外观为灰白色粉末；易溶于水，水溶液呈中性；不溶于有机溶剂，该有机溶剂包括无水乙醇、丙酮和乙醚；其水溶液与酚-硫酸反应后作吸光度测定，特征吸收峰波长为490nm；其水溶液在浓硫酸与α-茶酚作用，于界面呈处紫色环；其水解前与斐林试剂呈阴性反应，水解后与斐林呈阳性反应，产生棕红色氧化亚酮沉淀，在纸上与雪夫试剂产生玫瑰色反应。上述蝇蛆非甲壳素多糖的提取方法，具体包括如下步骤：(1)将适量家蝇3龄幼虫，至于磷酸盐缓冲液中孵育，并除去虫体外表面的液体；(2)将步骤(1)所得的物料进行匀浆，得匀浆液；(3)在上述匀浆液中加入3～6倍体积的丙酮，室温下搅拌浸泡0.5～14h，去上清后，再加入沉淀的1.5～3倍体积的丙酮，室温下搅拌浸泡0.5～14h，去上清后，接着再加入沉淀的1.5～3倍体积的丙酮，室温下搅拌浸泡0.5～14h，去上清，得沉淀；(4)待步骤(3)所得沉淀中的丙酮挥发后，加入沉淀的1.5～3倍体积的水，95～100℃孵育1～2h后取上清，重复3～5次，累积上清液；(5)在步骤(4)所得的上清液中加入3～5倍体积的95％乙醇，充分搅拌，于0～4℃放置8～24h后，离心收集沉淀；(6)用无水乙醇清晰步骤(5)所得的沉淀，得到粗多糖湿品；(7)将步骤(6)所得的粗多糖湿品于45～55℃烘干，即得所述蝇蛆非甲壳素多糖。在本发明的一个优选实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH为7.4。进一步优选的，所述磷酸盐缓冲液的配方如下：1000mL蒸馏水含NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO41.44g和KH2PO40.24g。在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)为：将适量家蝇3龄幼虫，至于磷酸盐缓冲液中孵育1h后，更换磷酸盐缓冲液再孵育1h，然后除去虫体外表面的液体。在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)为：在上述匀浆液中加入3～6倍体积的丙酮，室温下搅拌浸泡0.5～14h，去上清后，再加入沉淀的2倍体积的丙酮，室温下搅拌浸泡0.5～14h，去上清后，接着再加入沉淀的2倍体积的丙酮，室温下搅拌浸泡0.5～14h，去上清，得沉淀。在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(4)为：待步骤(3)所得沉淀中的丙酮挥发后，加入沉淀的2倍体积的水，95～100℃孵育1～2h后取上清，重复4次，累积上清液。在本发明的一个优选实施方案中，4℃放置8～24h后，离心收集沉淀。上述蝇蛆非甲壳素多糖在调节免疫功能中的应用。本发明的有益效果：1、本发明所提取的非甲壳素多糖具有调节免疫的功能。2、本发明的操作过程简单，成本低廉，产率高，适合工业化生产。附图说明图1为本发明实施例2中的标准曲线图。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例1蝇蛆多糖的制备笼养方式获得家蝇3龄幼虫120g，置于0.01M磷酸盐缓冲液(1000ml蒸馏水含NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO41.44g和KH2PO40.24g，用Na2HPO4调节pH到7.4)中，在室温下孵育1h，更换液体，再孵育1h。沥去虫体外面的液体。经匀浆器搅拌(Waring组织捣碎机，18000rpm)，制成匀浆。加3倍体积的丙酮，室温下搅拌浸泡30min，去上清。加2倍体积的丙酮，室温下搅拌浸泡30min，去上清，重复1次。挥去丙酮后加2倍体积的水，置水浴100℃1h后取上清，重复4次，累积上清液。加入4倍体积、浓度为95％的乙醇，轻轻搅拌，放置4℃冰箱中过夜，次日离心收集沉淀，上清液回收乙醇。用无水乙醇对沉淀洗涤两次，即得粗多糖湿品。将粗多糖湿品转入电热鼓风干燥箱中50℃下烘干，得干燥的蝇蛆非甲壳素多糖本实施例制得的蝇蛆非甲壳素多糖的理化性质如下：为灰白色粉末，易溶于水，其溶液呈中性；不溶于无水乙醇、丙酮、乙醚等有机溶解中。其水溶液与酚-硫酸反应后作吸光度测定，其特征吸收峰波长为490nm，其水溶液在浓硫酸与α一茶酚作用，于界面呈处紫色环。水解前与斐林试剂呈阴性反应；水解后与斐林呈阳性反应，产生棕红色氧化亚酮沉淀，在纸上与雪夫试剂产生玫瑰色反应。实施例2蝇蛆多糖的制备笼养方式获得家蝇3龄幼虫5kg，分置于0.01M磷酸盐缓冲液，(pH7.4)中，在室温下孵育1h，更换液体，再孵育1h。沥去虫体外面的液体。经匀浆器分次搅拌(Waring组织捣碎机，18000rpm)，累积匀浆。加3倍体积的丙酮，室温下搅拌浸泡30min，去上清。加2倍体积的丙酮，室温下搅拌浸泡30min，去上清，重复1次。挥去丙酮后加2倍体积的水，置水浴100℃1h后取上清，重复4次，累积上清液。加入4倍体积、浓度为95％的乙醇，轻轻搅拌，放置4℃冰箱中过夜，次日离心收集沉淀，上清液回收乙醇。用无水乙醇对沉淀洗涤两次，即得粗多糖湿品。将粗多糖湿品转入电热鼓风干燥箱中50℃下烘干，得干燥的蝇蛆非甲壳素多糖，其理化性质与实施例1制得蝇蛆非甲壳素多糖的相同。标准曲线制作：精确称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖90.0mg，置100mL容量瓶中定容。准确吸取标准葡萄糖溶液0、10、20、30、40、50、60μL，注明标记后分别置于比色管中，各加蒸馏水使体积为1.0mL，再加入5％的苯酚1.0mL摇匀，迅速加入98％浓硫酸3.25mL，显色20min，冷水中冷却至室温。以不含葡萄糖的溶液(标记为0μL)为空白对照，于最大吸收波长490nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程y＝0.009x+0.002(R2＝0.999)，如图1所示。样品多糖含量测定：准确称量本实施例制得的干燥的蝇蛆非甲壳素多糖2.0mg，加蒸馏水至10.0mL，得待测样品溶液。准确吸取待测样品溶液0.4、0.6、0.8mL，补加蒸馏水至1.0mL，按测定标准曲线方法显色，于490nm处分别测定吸光度，由回归方程计算取其平均值，得粗多糖含量为26.3％。实施例3蝇蛆多糖调节免疫功能的检测供试多糖配制：称取实施例1或实施例2制得的蝇蛆粗多糖粉末250mg用20mL注射用氯化钠溶液溶解，2000rpm离心10min，取上清液过滤除菌，配成浓度为12.5mg/mL的高剂量组溶液。然后取上述液体10mL，加注射用氯化钠溶液倍比稀释成6.25mg/mL、3.125mg/mL的中剂量组、低剂量组溶液。按试验检测指标分批饲养小鼠(清洁级昆明种小鼠，雄性，体重18-22g)，适应性喂养4天后随机分为5组，空白组、环磷酞胺(Cyclophosphamide，CY)模型组、CY+多糖小剂量组、CY+多糖中剂量组、CY+多糖大剂量组，每组8只。每周空腹称重一次。第一组为对照组，第三、四、五组为实验组，按0.2mL/10g的量每日尾静脉注射高、中、低剂量的蝇蛆多糖溶液，第二和三组经同途径给予等体积的生理盐水，自由采食。第19天第三、四、五组开始腹腔注射环磷酞胺100mg/kg，1次/d，连续3天。具体试验如下：(1)碳廓清法试验：22日龄小鼠40只，称重后腹腔注射CY。1h后按小鼠空腹体重0.1mL/10g计算每只尾静脉注入50％印度墨汁(临用前配置，稀释于生理盐水)。2min(T1)和10min(T2)后立即分别从眼眶静脉丛采取20μL，并立即注入4mL0.1％NaHCO3溶液中。两次采血完毕之后脱颈处死，取脾脏和肝脏并称重。以正常小鼠血注入4mL0.1％NaHCO3溶液中作对照。在可见分光光度计600nm波长处，以NaHCO3溶液作校对，测A值。结果以吞噬指数来表示。碳廓清指数K＝(logA1-logA2)/(T2-T1)，吞噬指数a＝[体重/(肝重+脾重)]*k1/3，试验结果如表1所示：表1蝇蛆多糖对免疫抑制小鼠吞噬指数α的影响组别吞噬指数α空白组5.7035±0.0063CY模型组3.0820±0.0382小剂量多糖+CY组3.9625±0.0376#○中剂量多糖+CY组4.1820±0.2578□●大剂量多糖+CY组5.0833±0.0792□●注：空白组和CY模型组彼此对照，统计学处理结果显示为极显著差异(P＜0.01，未标记号)；#与空白组比较差异显著(P＜0.05)；●与CY模型组比较差异显著(P＜0.05)；□与空白组比较差异不显著(P＞0.05)；○与CY模型组比较差异不显著(P＞0.05)；中剂量多糖+CY组与其它两个剂量组比较差异不显著(P＞0.05，未标记号)；大、小剂量组之间比较差异显著(P＜0.05，未标记号)。(2)脾淋巴细胞增殖反应的测定：22日龄小鼠40只，称重后腹腔注射CY。1h后摘眼球取血，分离血清，4℃保存备用。脱颈处死小鼠，无菌采取脾脏，4℃放置，在200目铜网上轻轻研磨并过滤，加入Hank′S液，转入灭菌好的离心管中，做好标记，4℃保存。用Hank′S液配平后，1500rpm，10min离心，弃上清，重复三次。加入配好的细胞培养液，振荡重悬后，置于4℃冰箱保存，以备细胞计数用。将细胞液置于血细胞计数板上计数，将计数好的细胞进行浓度调整，统一调整至5.0×106个/mL。于96孔细胞培养板中每孔加入100μL的脾淋巴细胞液，每个样本设三个重复孔。再加入150μLconA(终浓度为5μg/ml)，并用含100mL/L小牛血清的RPMI1640做空白对照。置于5％CO2培养箱中培养72h，结束培养4h前，每孔加入50μL的MTT浓度为(2mg/ml)。继续孵育4h，弃上清液，每孔加入150μLDMSO，轻微振荡15min，在酶标仪上570nm读数，以空白对照孔校正零点，试验结果以0D值表示，试验结果如表2所示：表2蝇蛆多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖的影响组别OD值空白组0.5013±0.0036CY模型组0.2377±0.0093小剂量多糖+CY组0.3808±0.0349#○中剂量多糖+CY组0.4120±0.0339□●大剂量多糖+CY组0.4862±0.0581□●注：空白组和CY模型组彼此对照，统计学处理结果显示为显著差异(P＜0.05，未标记号)；#与空白组比较差异显著(P＜0.05)；●与CY模型组比较差异显著(P＜0.05)；□与空白组比较差异不显著(P＞0.05)；○与CY模型组比较差异不显著(P＞0.05)；三个剂量组之间差异不显著(P＜0.05，未标记号)。(3)免疫脏器重量测定：各组动物于末次给药后24h处死，取脾脏和胸腺，用滤纸吸干水分后在分析天平上称重计算脏器系数，公式如(1)和(2)：脾脏指数＝(脾脏重量(g))×100/(处死时体重(g))(1)胸腺指数＝(胸腺重量(g))×100/(处死时体重(g))(2)试验结果如表3所示：表3蝇蛆多糖对免疫抑制小鼠脾和胸腺重量及其指数的影响组别脾重(g)胸腺重(g)脾指数胸腺指数空白组0.0825±0.00650.0705±0.00780.0028±0.00030.0021±0.0001CY模型组0.0420±0.00720.0360±0.00920.0015±0.00010.0012±0.0003小剂量多糖+CY组0.0595±0.0158#○0.0387±0.0149#○0.0017±0.0003#○0.0016±0.0004#○中剂量多糖+CY组0.0665±0.0215#○0.0463±0.0126#●0.0021±0.0004#○0.0020±0.0004□●大剂量多糖+CY组0.0760±0.0102□●0.0635±0.0108□●0.0026±0.0002□●0.0020±0.0001□●注：空白组和CY模型组彼此对照，统计学处理结果显示脾重和胸腺重及其指数均为极显著差异(P＜0.01，未标记号)；#与空白组比较差异显著(P＜0.05)；●与CY模型组比较差异显著(P＜0.05)；□与空白组比较差异不显著(P＞0.05)；○与CY模型组比较差异不显著(P＞0.05)；三个剂量组之间差异不显著(P＞0.05，未标记号)。以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。当前第1页1 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