一种cDNA的特异性分子标签及其应用的制作方法

文档序号:12411838阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种cDNA的特异性分子标签,其全长序列中包含:通用引物序列;转座酶接头序列P7;随机序列:(N)n,N为随机序列,共n个;和poly(T)序列;其中,所述通用引物序列如SEQ ID NO.1所示,所述转座酶接头序列P7如SEQ ID NO.2所示,所述poly(T)序列共有30个T碱基即T30VN。

2.根据权利要求1所述cDNA的特异性分子标签,其特征在于,所述特异性分子标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,具体序列如下:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(N)nT30VN,其中,N为随机序列,共n个,n为5-10。

3.如权利要求1或2所述cDNA的特异性分子标签在cDNA建库中的应用。

4.如权利要求1或2所述cDNA的特异性分子标签在利用转座酶打断的cDNA建库中的应用。

5.一种利用转座酶打断的cDNA建库方法,其特征在于,包括如下步骤:

1)分离单细胞,将单细胞裂解后释放总RNA;以mRNA为模板、权利要求1或2所述特异性分子标签为引物逆转录合成第一链cDNA,所述特异性分子标签加在第一链cDNA的5’端,且在逆转录过程中,利用逆转录酶的模板转换活性在第一链cDNA的3’端加上一段接头序列,该接头序列与如SEQ ID NO.1所示的通用引物序列相同;以第一链cDNA为模板,以如SEQ ID NO.1所示的通用引物序列为引物通过PCR扩增合成带所述特异性分子标签的全长cDNA,并进行纯化;

2)将步骤1)所得全长cDNA与转座酶包埋复合物进行孵育,完成cDNA片段化和加接头;其中,所述转座酶包埋复合物包括转座酶和退火接头;

3)使用上游引物N7和下游引物N5对步骤2)所得的片段化产物进行PCR扩增,富集cDNA的5’端;其中,上游引物N7的序列如SEQ ID NO.4所示,下游引物N5的序列如SEQ ID NO.5所示;

4)对步骤3)所得PCR扩增产物进行纯化,获得带所述特异性分子标签的cDNA的5’端文库。

6.根据权利要求5所述的利用转座酶打断的cDNA建库方法,其特征在于,步骤2)中,所述转座酶包埋复合物中的退火接头的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;所述的转座酶为Tn5家族转座酶。

7.根据权利要求5或6所述的利用转座酶打断的cDNA建库方法,其特征在于,步骤2)中,所述的cDNA片段化和加接头方法包括:配制反应混合液:权利要求5或6所述转座酶包埋复合物3-7μl,转座酶反应缓冲液4-8μl;将全长cDNA与反应混合液混合,用移液器吹打混匀;在PCR仪中50-58℃反应10-15min。

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