本发明涉及利用基因检测技术鉴别皮革及皮革制品的生物源性技术领域，具体的是涉及一种提取鞣制皮革DNA的方法。
背景技术：
国内外一直没有针对皮革制品动物物种进行鉴别的方法标准。对于皮革制品，目前可参照的标准是ISO 17131：2012《皮革-皮革鉴别显微镜法》和QB/T2262-1996《皮革工业术语》，其中ISO 17131:2012只适用于区别皮革和非皮革，QB/T 2262-1996仅规定了皮革工业术语，并没有提到具体的鉴别方法。检测标准的缺失，导致大量的皮革制品未经检验便流入市场。
目前，国内外正在积极研究皮革和毛皮制品动物物种的鉴别方法，主要有4类基本方法：
1)感官经验鉴别法：目前国内各检测机构主要依据感官经验，即眼看、手摸、鼻子闻等手段，对皮革和毛皮制品的动物物种进行观察。但是，感官经验鉴别法对检验人员的专业知识及检测经验要求较高，且是主观判断的结果，所以各检测机构间的检测报告时常出现不一致的现象。另外，随着现代加工技术的进步，人们可以按照客户要求改变产品的毛孔排列和表面纹理，这给传统的鉴别方法提出了挑战。此外，专业打假人士也经常拿着检测机构出具的不同检测报告，对企业提出不合理要求，严重扰乱检测机构和企业的正常运作。
2)显微镜鉴别法：显微镜法主要是借助光学显微镜或电子显微镜对皮革和毛皮制品的纤维形态结构进行观察，但是显微镜鉴别法适用于形态学差异较大的皮革及毛皮制品，对于形态学差异较小的样品，显微镜法也不容易区分。
3)红外光谱鉴别法：红外光谱鉴别法是基于红外光与物质间相互作用的结果，即以连续波长的红外光照射样品，当光的能量恰好等于基态与某一激发态的能量之差时，分子能够吸收红外光的能量，使分子、原子的振动和转动能级发生跃迁，从而产生红外吸收光谱。但是，皮革制品通常经过复杂的加工工艺，其表面常含有涂饰层，会对红外光谱会产生较大影响，从而增加鉴别的难度。所以红外光谱法鉴别皮革和毛皮制品的研究和应用目前还处于探索阶段。
4)分子生物技术鉴别法：分子生物技术主要是针对DNA分析法，利用显示生物特征的各种生物物种所具有的不同DNA序列信息进行鉴别，它可以突破依据动物纤维形态结构鉴别的局限性，与传统分析方法相比，更加具有客观性和准确性。DNA是由脱氧核糖核昔酸组成的长链多聚物，不同生物DNA的分子大小(分子量或长度)、结构都有一定的差异。因此，通过DNA检测可以比较准确地鉴别各种动物纤维和皮革。常用的分子生物技术方法包括PCR技术、基因条形码技术和二代高通量测序分析技术。但是采用这种鉴别方法，DNA的提取比较麻烦，耗费时间长，成本高。
因此，亟需一种能够快速、简便地提取鞣制皮革DNA的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述技术的不足，提供一种提取鞣制皮革DNA的方法。
本发明提供的一种提取鞣制皮革DNA的方法，包括顺次执行的以下步骤：
S2、向第一离心管中加入制备好的皮革裂解缓冲液和蛋白酶K，皮革裂解缓冲液和蛋白酶K的体积比为975:25；向所述第一离心管中加入皮革样品，加入皮革样品的量不要使液体溢出管外；
S3、盖好所述第一离心管的管盖，震荡混匀后，将所述第一离心管置于53至58℃金属浴孵育40-48小时；
S4、从孵育后的所述第一离心管中吸出第一体积的裂解液至第二离心管中；
S5、向所述第二离心管中加入第一体积的tris饱和酚，颠倒混匀，以不低于12000转/分钟的速度离心20分钟以上；
S6、从离心后的所述第二离心管中吸上层液体至第三离心管中，所吸的上层液体的体积为第二体积；向所述第三离心管中加入第二体积的tris饱和酚，颠倒混匀，以不低于12000转/分钟的速度离心20分钟以上；
S7、从离心后的所述第三离心管中吸上层液体至第四离心管中，所吸的上层液体的体积为第三体积；并向所述第四离心管中加入第三体积的氯仿，颠倒混匀，以不低于12000转/分钟的速度离心20分钟以上；
S8、从离心后的所述第四离心管中吸上层液体至第五离心管中，所吸的上层液体的体积为第四体积；向所述第五离心管中加入1/10倍第四体积的乙酸钠溶液和2.5倍第四体积的预冷无水乙醇，混匀后静置2小时以上，然后以不低于13000转/分钟的速度离心25分钟以上；
S9、吸弃离心后的所述第五离心管中的上层清液后，向所述第五离心管中加入第五体积的75％乙醇，用移液器吹洗管壁，然后将液体转移至第六离心管中，并对所述第六离心管以不低于13000转/分钟的速度离心10分钟以上，吸弃离心后的所述第六离心管中的上层清液；
S10、对所述第六离心管内的剩余物进行干燥，直至无酒精残留，然后加入第六体积的TE缓冲液溶解管壁上的DNA；
S11、测定提取的DNA浓度。
进一步地，步骤S2之前还包括步骤S1：裁取一块皮革样品，将皮革样品的涂饰层刮去，剪碎皮革样品。
进一步地，步骤S2中，所述皮革裂解缓冲液的制备，包括以下步骤：
将20mmol/L的Tris-Cl缓冲液、5mmol/L的EDTA乙二胺四乙酸二钠、400mmol/L的NaCl氯化钠、1％(m/v)的SDS十二烷基磺酸钠和1％的CTAB十六烷基三甲基溴化铵按比例配好；
对配好后的溶液进行过滤除菌。
进一步地，对配好的溶液用0.22um的硝酸纤维素膜进行过滤除菌。
进一步地，步骤S10中，所述TE缓冲液包括10mmol/L的Tris-Cl缓冲液和1mmol/L的EDTA乙二胺四乙酸二钠。
进一步地，所述Tris-Cl缓冲液和EDTA乙二胺四乙酸二钠的PH值都为8.0。
进一步地，步骤S10中，对所述第六离心管内的剩余物进行干燥的方式为晾干或置于50℃温度中进行干燥。
进一步地，步骤S3中，将所述第一离心管置于56℃金属浴孵育40-48小时。
进一步地，步骤S2中，所述皮革裂解缓冲液的体积为975ul，所述蛋白酶K的体积为25ul，加入的皮革样品的重量为0.1g；步骤S4中，所述第一体积为2ml；步骤S8中，所述乙酸钠溶液为3mol/L乙酸钠溶液，所述预冷无水乙醇为-20℃预冷无水乙醇，混匀后于-20℃中静置3小时；步骤S9中，所述第五体积为1ml；步骤S10中，所述第六体积为50ul。
进一步地，步骤S5中、步骤S6中和步骤S7中的离心速度都为12000转/分钟、离心时间都为25分钟；步骤S8中的离心速度为13000转/分钟，离心时间为30分钟；步骤S9中的离心速度为13000转/分钟，离心时间为15分钟。
实施本发明，能够快速、简便、高效地提取鞣制皮革或皮革制品的DNA，提取DNA耗费的时间较短，成本低，可为采用分子生物技术鉴别皮革及皮革制品提供高质量的DNA样品，使得皮革或皮革制品的动物物种的鉴别准确又高效。
【附图说明】
图1为本发明提供的一种提取鞣制皮革DNA的方法的流程图。
【具体实施方式】
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。
参考图1，本发明提供的一种提取鞣制皮革DNA(脱氧核糖核酸)的方法，可为采用分子生物技术鉴别皮革及皮革制品提供高质量的样品DNA，使得检测准确和高效。该方法包括顺次执行的以下步骤：
S1、裁取一块皮革样品，皮革样品的边长约为5厘米。将皮革样品的涂饰层刮去，以防涂饰层影响DNA浓度的测定。剪碎皮革样品。
S2、向1ml(毫升)的第一离心管中加入制备好的皮革裂解缓冲液和蛋白酶K，皮革裂解缓冲液和蛋白酶K的体积比为975：25。本实施例中，皮革裂解缓冲液和蛋白酶K加入的量分别为975ul(微升)和25ul(微升)。然后用无菌镊子夹取皮革样品加入管中，皮革样品的重量为0.1g。皮革样品的量可通过电子天平称取。加入皮革样品的量不要使液体溢出管外。
S3、盖好第一离心管的管盖，震荡混匀后，将第一离心管置于53至58℃金属浴孵育40-48小时，进行裂解，使DNA从核蛋白中游离出来，从而得到DNA、蛋白质相分离的裂解液。本实施例中，将第一离心管置于优选为56℃金属浴孵育。
S4、从孵育后的第一离心管中通过移液器吸出第一体积的裂解液至15ml的第二离心管中。本实施例中，第一体积为2ml。
S5、向第二离心管中加入第一体积的tris(三羟甲基氨基甲烷)饱和酚，用于除去液体中未消化的蛋白质。颠倒混匀，注意不要用力震荡，通过离心机以不低于12000转/分钟的速度离心20分钟以上，得到的液体中DNA存在于上层的水相中。优选地，离心的速度为12000转/分钟，离心时间为25分钟。
S6、从离心后的第二离心管中通过移液器吸上层液体至15ml的第三离心管中，所吸的上层液体的体积为第二体积。向第三离心管中加入第二体积的tris饱和酚，以进一步除去液体中未消化的蛋白质。颠倒混匀，通过离心机以不低于12000转/分钟的速度离心20分钟以上。优选地，离心的速度为12000转/分钟，离心时间为25分钟。
S7、从离心后的第三离心管中通过移液器吸上层液体至15ml的第四离心管中，所吸的上层液体的体积为第三体积。向第四离心管中加入第三体积的氯仿，氯仿有助于水相和有机相分离以及除去液体中的酚。颠倒混匀，通过离心机以不低于12000转/分钟的速度离心20分钟以上，得到上层的DNA溶液。优选地，离心的速度为12000转/分钟，离心时间为25分钟。
S8、从离心后的第四离心管中通过移液器吸上层液体至15ml的第五离心管中，所吸的上层液体的体积为第四体积。向第五离心管中加入1/10倍第四体积的乙酸钠溶液和2.5倍第四体积的预冷无水乙醇，使DNA下沉淀，混匀后于-20℃静置2小时以上，优选为3小时。然后通过离心机以不低于13000转/分钟的速度离心25分钟以上。优选地，乙酸钠溶液为3mol/L(摩尔每升)乙酸钠溶液，预冷无水乙醇为-20℃预冷无水乙醇。离心的速度为13000转/分钟，离心时间为30分钟。
S9、吸弃离心后的第五离心管中的上层清夜，向第五离心管中加入第五体积的75％乙醇，用于洗去下沉淀的DNA中的盐。用移液器吹洗管壁，然后通过移液器将液体转移至1ml的第六离心管中，并对第六离心管通过离心机以不低于13000转/分钟的速度离心10分钟以上。吸弃离心后的第六离心管中的上层清夜。本实施例中，第五体积为1ml。离心的速度为13000转/分钟，离心时间为15分钟。
S10、对第六离心管内的剩余物即DNA进行干燥，直至无酒精残留，然后加入第六体积的TE缓冲液溶解管壁上的DNA。本实施例中，第六体积为50ul(微升)。其中，对第六离心管内的DNA进行干燥的方式为晾干。在另一种替换方案中，可将第六离心管置于50℃温度中进行干燥。TE缓冲液包括10mmol/L(毫摩尔每升)的Tris-Cl缓冲液(即，在Tris溶液中加入适当量的盐酸)和1mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸二钠)。Tris-Cl缓冲液和EDTA(乙二胺四乙酸二钠)的PH值都为8.0，便于使DNA溶解于水相中。
S11、通过酶标仪测定提取的DNA浓度，这样采用分子生物技术鉴别法就可鉴别出皮革样品属于哪种动物物种。
本发明的皮革裂解缓冲液的制备包括以下步骤：
首先，将20mmol/L的Tris-Cl缓冲液、5mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸二钠)、400mmol/L的NaCl(氯化钠)、1％(m/v)的SDS(十二烷基磺酸钠)和1％的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)按比例配好。Tris-Cl缓冲液和EDTA(乙二胺四乙酸二钠)的PH值都为8.0，便于DNA溶解于水相中。SDS(十二烷基磺酸钠)和CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)可将皮革样品的细胞膜裂解，在蛋白酶K和EDTA(乙二胺四乙酸二钠)的存在下消化蛋白质或多肽，使核蛋白变性降解，从而使DNA从核蛋白中游离出来。
然后对配好后的溶液用0.22um(微米)的硝酸纤维素膜进行过滤除菌。
实施本发明的提取DNA的方法之后，可快速地、高效简便地提取鞣制皮革或皮革制品的DNA，耗费时间短，成本低，可为采用分子生物技术鉴别皮革及皮革制品提供高质量的DNA的样品，这样通过分子生物技术鉴别法就可鉴别出皮革或皮革制品的动物物种，鉴别准确又高效。为满足采用分子生物技术鉴别法的鉴别的DNA浓度的要求，可以准备好多份相同的皮革样品同时通过本发明的方法进行DNA提取，这样提取的DNA浓度就比较精确，进一步提高鉴别的准确度和效率。
以上实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，如对各个实施例中的不同特征进行组合等，这些都属于本发明的保护范围。