本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种鉴定木薯块根肉质颜色的分子标记方法。
背景技术：
木薯（Manihot Esculenta Crantz）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot） 植物，耐旱抗贫瘠，广泛种植于非洲、美洲和亚洲等100余个国家或地区，是世界三大薯类作物之一，热区第三大粮食作物，全球第六大粮食作物，被誉为“淀粉之王”。。木薯用途广泛，除作粮食外，还是重要的工业原料，如木薯块根淀粉、干片可制变性淀粉、酒精和山梨醇等，而这些产品又是食品、医药、纺织、造纸等产业的重要原料。
木薯块根具有较高的营养价值。相关研究表明(魏艳，2014)，薯肉的干物率，淀粉含量分别是甘薯的0.8～3.9倍、0.7～1.3倍，是马铃薯的1.7～3.7倍、1.7～4.0倍，其维生素C、粗蛋白和可溶性糖含量可与甘薯媲美。钙、镁、铁含量分别是马铃薯的9.4～180.7倍，锌含量是甘薯的0.3～5.8倍。因此，木薯块根的营养价值和矿物质含量与马铃薯、甘薯相当，甚至比马铃薯、甘薯还更具营养价值。
木薯不仅营养丰富，还具有良好的保健功能。食用木薯低脂肪、低糖、低盐，且饱腹感强，利于抑制体重增长，预防肥胖。鲜薯中富含膳食纤维，有助于改善肠胃微环境，预防消化系统疾病。然而我国木薯食用品种缺乏，推广面大的品种仅有华南9号等，迫切需要选育更多更好的食用木薯品种。到目前为止，木薯育种策略主要集中为资源引进与系统选育，杂交或实生种选育，但育种周期相对较长，效率低下，分子标记辅助育种为木薯品种选育或资源筛选提供了一条高效的途径。
酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, CAPS)是利用特异引物PCR与限制性酶切相结合而产生的一种检测SNP位点的DNA标记(Konieczny, 1993)，自建立以来受到了广大研究者的重视，现已成为生物研究的重要分子标记技术，目前被广泛应用于辅助品种选育中，具有共显性、低成本、操作简单等优点。其基本原理是根据己知位点的序列设计特异性的PCR引物(18-25bp)，然后扩增该位点的DNA片段，用限制性内切酶对片段进行切割得到产物，利用凝胶电泳使酶切片段分开并分析位点变化情况。
Welsch等(2010)针对木薯块根维生素A含量开展研究，发现木薯块根肉色黄与白，即维生素A含量高低，由八氢番茄红素基因PSY2中的一个SNP位点变异决定，该突变位点的野生型为AGAT，突变型为AGCT，AGCT是限制性内切酶AluI的酶切位点。根据这一序列特征，我们开发出一个基于AluI内切酶位点的CAPS标记来区分黄肉木薯与白肉木薯，并将其应用于黄色肉质食用木薯种质鉴定和筛选，这样不仅可以为拓宽木薯选育途径提供重要信息，还可以丰富木薯种质资源，选育食用木薯优良品种。
技术实现要素：
本发明的目的在于：针对上述存在的不足，本发明提供了一种鉴定木薯块根肉质颜色的分子标记方法。本发明可用于木薯块根肉质颜色的分子标记辅助育种，可实现在苗期时通过抽提叶片DNA进行分子标记分析检测，进而准确鉴别木薯块根肉质颜色，能快速选择符合育种目标的块根肉质颜色材料进行大田移栽，从而提高育种效率，加快育种进程。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种鉴定木薯块根肉质颜色的分子标记方法，由以下步骤组成：
（1）采用CTAB法从木薯叶片中提取木薯基因组DNA，根据PSY2基因的DNA序列，设计一对特异引物可以扩增包含SNP2位点的260bp核苷酸序列，然后用该特异引物对木薯基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
（2）利用限制性内切酶Alu I酶切步骤（1）得到的PCR扩增产物，获得酶切产物；
（3）使用浓度为3.0%琼脂糖凝胶对步骤（2）的酶切产物进行电泳分离，然后根据电泳结果进行木薯材料的块根肉质颜色判定，块根肉质颜色判定标准为：
若电泳后可见2条带——194bp和66bp，或电泳后见1条带——194bp，则该木薯材料的块根肉质颜色为黄色；
若电泳后可见2条带——172bp和66bp，或电泳后见1条带——172bp，则该木薯材料的块根肉质颜色为白色；
若是电泳后可见3条带——194bp、172bp和66bp，或电泳后见2条带——194bp和172bp，则该木薯材料的块根肉质颜色为浅黄色。
其中优选的技术方案是，在步骤（1），所述特异引物核苷酸序列为：
上游引物：5’GCTTCACACATAACGCCAACA-3’；
下游引物：5’TGGCTGAAACAGATGTTCAAAGG-3’。
进一步优选的技术方案是，在步骤（1），所述PCR扩增的反应体系为25μL，由下列成分组成：10×PCR buffer反应缓冲液2.5μL、MgCl2（25mmol/L）2μL、dNTPs（2.5mmol/L）2μL、正向引物（10μmol/L）0.5μL、反向引物（10μmol/L）0.5μL、Taq（5 U/μL）0.5μL、模板DNA（50ng/μL）1μL。
进一步优选的技术方案是，在步骤（1），所述PCR扩增的条件为：先在94℃下预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，72℃延伸10 min，4℃下保存。
进一步优选的技术方案是，在步骤（2），所述酶切体系为15μL，其中包含：PCR产物10μL、10×Lbuffer1.5μL、限制性内切酶AluI3.0U，其余为ddH2O。
进一步优选的技术方案是，在步骤（3），所述电泳方法为：用3.0%琼脂糖凝胶电检测泳，缓冲液为0.5×TBE，上样量为15μL，在5V/cm恒压下电泳1.5h。
本发明的原理为：Plant Cell （2010 ）文章报道PSY2基因的SNP2位点可决定栽培木薯的块根肉质是黄色还是白色，该突变位点的野生型为AGAT，突变型为AGCT，AGCT是限制性内切酶AluI的酶切位点，因此根据这一序列特征，我们开发出一个基于Alu I的CAPS标记来区分黄肉木薯与白肉木薯。根据PSY2基因的DNA序列，设计一对特异引物可以扩增包含SNP2位点的长度为260bp的序列，该260bp核苷酸序列为：
GCTTCACACATAACGCCAAC（AGCT）TTAGATAGGTGGGAAGCAAGGTTGGAAGATATGTTT （AGAT）
CGAGGTCGTCCCTTTGATATGCTTGATGCTGCTTTATCAGATACAGTTACTAAATTTCCTGTTGATATTCAGGTTAGCCATTATTAAATCAAGTCTTTAACACTACATAAACTTTTAAACAATCAAAACTACAGCTTATAATGCCATTTCTGTGTTTGTTTCTCATTTTGGCTGATTCCTTTGAACATCTGTTTCAGCCA，该260bp序列中存在2个AGCT位点，当限制性内切酶AluI酶切PCR产物时，
若产物是AGAT黄色纯合型，则电泳后可见2条带：194bp和66bp；如果产物是AGCT白色纯合型，则电泳后也可见2条带：172bp和66bp；若产物是AGAT/AGCT淡黄色杂合型，则电泳后可见3条带：194bp，172bp和66bp；而22bp在胶上基本不可见。
综上所述，本发明由于采用了上述方案，本发明具有以下积极效果：本发明可用于木薯块根肉质颜色的分子标记辅助育种，可实现在苗期时通过抽提叶片DNA进行分子标记分析检测，进而准确鉴别木薯块根肉质颜色，能快速选择符合育种目标的块根肉质颜色材料进行大田移栽，从而提高育种效率，加快育种进程；可以节省大量田地面积，避免了因为主观判断而导致的误差，同时也避免消耗在大田收获时挖取块根的人力物力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实例或现有技术中的技术方案，下面将对实施实例或现有技术描述中所需要的附图做简单地介绍，显然，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图；
图1是本发明实施例1的电泳图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
一种鉴定木薯块根肉质颜色的分子标记方法，由以下步骤组成：
（1）选取种植于广西农业科学院里建基地，主栽木薯品种新选048自交所得的26份木薯叶片，采用CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵法）从木薯叶片中提取木薯基因组DNA，根据PSY2基因的DNA序列，设计一对特异引物可以扩增包含SNP2位点的长度为260bp的核苷酸序列，所述特异引物核苷酸序列为：
上游引物：5’GCTTCACACATAACGCCAACA-3’；
下游引物：5’TGGCTGAAACAGATGTTCAAAGG-3’，然后用该特异引物对木薯基因组DNA进行PCR扩增，所述PCR扩增的反应体系为25μL，由下列成分组成：10×PCR buffer反应缓冲液2.5μL、MgCl2（25mmol/L）2μL、dNTPs（2.5mmol/L）2μL、正向引物（10μmol/L）0.5μL、反向引物（10μmol/L）0.5μL、Taq（5 U/μL）0.5μL、模板DNA（50ng/μL）1μL，所述PCR扩增的条件为：先在94℃下预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，72℃延伸10 min，4℃下保存，得到PCR扩增产物；
（2）利用限制性内切酶AluI酶切步骤（1）得到的PCR扩增产物，所述酶切体系为15μL，其中包含：PCR产物10μL、10×L buffer1.5μL、限制性内切酶AluI3.0U，其余为ddH2O，获得酶切产物；
（3）使用浓度为3.0%琼脂糖凝胶对步骤（2）的酶切产物进行电泳分离，所述电泳方法为：用3.0%琼脂糖凝胶电检测泳，缓冲液为0.5×TBE，上样量为15μL，在5V/cm恒压下电泳1.5h，然后根据电泳结果进行木薯材料的块根肉质颜色判定，块根肉质颜色判定标准为：
若电泳后可见2条带——194bp和66bp，或电泳后见1条带——194bp，则该木薯材料的块根肉质颜色为黄色；
若电泳后可见2条带——172bp和66bp，或电泳后见1条带——172bp，则该木薯材料的块根肉质颜色为白色；
若是电泳后可见3条带——194bp、172bp和66bp，或电泳后见2条带——194bp和172bp，则该木薯材料的块根肉质颜色为浅黄色。
实验结果分析：26份木薯的分子标记的电泳图详见图1。由电泳图可知，黄色木薯材料有4份，白色木薯材料有7份，淡黄色木薯材料有15份。
综上所述，本发明可用于木薯块根肉质颜色的分子标记辅助育种，可实现在苗期时通过抽提叶片DNA进行分子标记分析检测，进而准确鉴别木薯块根肉质颜色，能快速选择符合育种目标的块根肉质颜色材料进行大田移栽，从而提高育种效率，加快育种进程；可以节省大量田地面积，避免了因为主观判断而导致的误差，同时也避免消耗在大田收获时挖取块根的人力物力。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在没有背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同腰间的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。