一种检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒及其用途的制作方法

本发明涉及动物病原分子诊断技术领域，特别涉及一种检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒及其用途。

背景技术：

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)可以引起猪细小病毒病，该病可以引起母猪尤其是初产母猪产弱仔、死胎及流产等繁殖障碍，也有报道称PPV可引起仔猪皮炎、腹泻及呼吸道疾病。该病分布广泛，全世界范围内均可发生。该病一年四季均可发生，但在每年4～10月母猪产仔、交配的季节多发。该病呈地方性流行或者散发，本病发生后，猪场可连续几年不断出现繁殖失败。该病的主要传染对象是青年母猪，尤其是头胎母猪感染性极强，病毒进入胎盘可损害胎盘以及胎儿的很多组织器官，导致死胎、木乃伊胎的发生。

目前，PPV较为成熟的实验室诊断方法主要以血清学检测抗体或可通过抗体反应间接检测病毒，主要包括：(1)血凝(HA)：多用于对病毒培养物的检测，依赖于病毒的血凝活性，因此易受病毒传代、保存时限的影响。(2)血凝抑制试验(HI)：该方法具有操作简便，不需要特殊设备等特点，因此国内长期用于抗体的检测。但该方法使用红细胞，需对检测样品做繁杂的处理，虽能进行快速、大量的诊断，但灵敏度低、特异性不强，只能做辅助诊断方法。(3)中和试验(SN)：用于中和抗体的检测，该方法比HI更加敏感，但操作也更为复杂。(4)酶联免疫吸附试验(ELISA)：多用于抗体检测，Hodals等(1988年)、Westenbrink等(1989年)、邱明建等(1989年)分别建立了ELISA方法用于检测PPV抗体，该方法灵敏度高，适合PPV的早期诊断和流行病学调查。在实践中，由于疫苗的使用，很难通过抗体检测区分疫苗免疫与野毒感染，需要检测抗原的ELISA方法。姜永厚(1997年)建立了检测PPV抗原的ELISA方法，比HA敏感、快速。(5)免疫荧光抗体：Rivera等(1986年)应用固相免疫荧光技术快速检测PPV感染胎儿的抗原与抗体，结果发现该技术与ELISA具有一致的高敏感性，免疫荧光技术具有快速、特异、敏感等优点，但在临床应用过程中常受到试验条件的限制。但是血清学检测技术存在以下缺点：(1)对猪群中存在的免疫耐受现象评估较难，相对不能更加有效、直观和高精准反映猪群的抗体水平。(2)血样及组织样本采集需要多人协助，且需要特殊设备，采集过程相对比较费时。而血清学检测技术存在上述缺点的原因在于：①血清学检测方法是抗原和抗体反应，仅检测1次无法准确判断猪群的感染状况和排毒状况；②血清学检测抗体，检测的抗体水平高低无法精确定量检测分析，血清学仅能评价机体体液免疫产生的水平，很难直接评价病原情况；③血清学评估猪群健康度、对无症状带毒和免疫耐受的猪群评估存在技术上的瓶颈；④血清学需要采集前腔静脉血，血样采集相对费力、费时、且需要特殊设备辅助，多人协助。

分子诊断技术近年来用于检测动物病原，极大的提高诊断的敏感性与特异性，主要包括：(1)核酸探针：核酸探针技术是一种分子水平的检测技术,特别适用于疾病的早期诊断。核酸探针技术检测的技术含量高，仅适合在实验室应用。(2)聚合酶链式反应(PCR)：PPV属于小细小病毒科细小病毒属，基因组为单链线状负链DNA的分子，是自主复制性的DNA病毒，因此可用PCR的方法来扩增并检测病毒核酸。国内外已有很多PPV的PCR检测方法研究报道，这些方法虽然应用比较广泛，但技术含量要求高或未能形成产品化，只能在专业实验室应用，不适合大面积临床诊断和现场应用。分子诊断技术存在以下缺点：(1)需要复杂的仪器设备：核酸提取仪器、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统和分析软件。(2)操作复杂操作时间长：需要提取核酸、PCR试剂配置、PCR反应、电泳、凝集成像、分析结果等，做一次病原检测需要近一天时间。(3)结果相对不可靠：非常容易污染，即使是国内权威的实验室检测结果都存在假阳性结果。(4)技术操作要求高：很难在基层推广，猪场配备了设备但是没有人和时间使用。(5)质量控制不到位，难以标准化。分子诊断技术存在上述缺点的原因在于：①普通PCR本身操作较复杂操作时间较长；②普通PCR所用试剂相对成本较低所导致。同时上述检测方法实验室应用较多，临床应用较少。

目前的检测多是在规模化猪场出现疑似猪细小病毒病的疫情后，送检患病猪的病料(包括流产或死产胎儿的脑、肺、肝、肾和母猪胎盘)，利用常规PCR方法进行检测，根据检测结果，结合该猪场其他情况给出诊断报告并制定疫病防控计划。一方面由于这种“事后”检测导致诊断结果对猪场疫病防控的指导意义有一定的局限性，无法做到未雨绸缪。另一方面，常规PCR方法操作时间较长，操作过程中容易发生污染。

实时荧光定量PCR是在常规PCR技术的基础上发展起来的一种较新的核酸检测技术，具备灵敏度高、快速便捷、抗污染能力强、安全系数好、结果可视化等优点。通过对探针的巧妙设计，可以检测区分单个的核苷酸碱基差异，因此能很好的用于不同类型毒株的差异化检测。

猪属于上皮绒毛胎盘，猪胎盘生理正常的结构即血胎屏障，胎盘屏障的存在使正常的脐带血内不存在任何病原和抗体等大分子物质，但在如某些病毒单独或协同感染的情况下，屏障通透性变化导致病原从母体垂直传播至新生个体。PPV病毒颗粒小，且主要引起繁殖障碍相关症状，且鉴于猪的多病毒混合感染非常严重，因此采用从仔猪脐带血中检测PPV来评价及预警猪细小病毒病的发病情况，这种寻找“源头”的检测方法更加科学、直接、有效。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒。该试剂盒具有灵敏度高、特异性好、重复性优、检测结果快速客观准确等优点，能同时反映母、仔猪PPV带毒状况，评估母猪疫苗的免疫效果，有益于对猪群PPV感染和免疫情况的早期预警评判，进一步有助于猪场做好该疾病的防控工作。

基于上述目的，本发明提供了一种检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：

上游扩增引物PPV-f：5’-GAACAAGAAATATTCAATGTAGTA-3’，其为SEQ ID NO:1序列；

下游扩增引物PPV-r：5’-TGTGTTATTGGTGTCTAGT-3’，其为SEQ IDNO:2序列；

特异性荧光探针PPV-p：FAM-5’-CAGCAACCTCACCACCAACC-3’-TAMRA，其为SEQ ID NO:3序列，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

合理的引物和荧光探针设计是成功应用实时荧光PCR技术的关键。引物和探针的特异性对反应有很大影响，如果引物和探针特异性不高，可能在扩增构成中产生非靶标条带，影响检测结果的判定。

PPV基因组为单链线状DNA分子，主要有2个开放阅读框(ORF)，5’端的ORF编码3种非结构蛋白NS1、NS2、NS3，3’端ORF编码2种结构蛋白VP1和VP2，VP3是VP2的水解产物。本发明对GenBank中公布的PPV和其它宿主的细小病毒毒株基因序列进行对比分析，筛选出PPV病毒基因组中VP2基因的一段基因片段，该基因片段在猪细小病毒中高度保守，大小为123bp，作为本发明设计引物的靶片段。发明人针对该保守片段设计了多对引物和探针，最终根据扩增效果(扩增效率、灵敏度等)筛选出本发明的引物和探针。该引物为只针对PPV的通用上下游扩增引物，且匹配性和特异性良好。同时在该上下游引物扩增区123bp片段间设计了高度保守的特异性荧光探针，该特异性荧光探针能与PPV病毒核酸特异性结合，引物进行扩增过程中，探针发生酶解，致荧光积累被仪器检测到。该组引物与探针扩增效率较好，能特异性扩增PPV核酸，同其它宿主细小病毒无交叉。

在本发明中，优选的，所述上游扩增引物PPV-f、所述下游扩增引物PPV-r和所述特异性荧光探针PPV-p的摩尔比为2:2:1。

在本发明中，优选的，所述上游扩增引物PPV-f、所述下游扩增引物PPV-r在所述试剂盒中的终浓度为0.3～0.6μM，所述特异性荧光探针PPV-p在所述试剂盒中的终浓度为0.15～0.3μM。

在本发明中，优选的，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、荧光PCR反应液(含酶)、病毒裂解液及说明书。

在PCR反应体系中加入荧光PCR反应液，该反应液中含有UNG酶系统，在扩增环节可以有效解决扩增污染现象，抗污染能力强等。本发明的荧光PCR反应液中还含有dNTPs、TaqDNA聚合酶和一些增强成分(MgCl₂、DMSO或甲酰胺)的混合物，具体的增强成分根据实际需要进行添加。

在本发明中，优选的，所述阴性对照为无DNA酶的ddH₂O，所述阳性对照为含有猪细小病毒VP2基因序列的克隆质粒pEASY-VP2，克隆质粒pEASY-VP2的终浓度为1.0×10⁵copies/μL～1.0×10⁷copies/μL；所述病毒裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS 0.1-0.2％；③吐温20 1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40 1-2％。

在本发明中，所述猪细小病毒VP2基因123bp目的片段的核苷酸序列如下所示：

GAACAAGAAATATTCAATGTAGTACTTAAAACAATTACAGAATCAGCAACCTCACCACCAACCAAAATATATAATAATGATCTAACTGCAAGCTTAATGGTCGCACTAGACACCAATAACACA，其为SEQ ID NO:4序列。

在本发明中，优选的，所述克隆质粒pEASY-VP2采用以下方法制备得到：提取猪细小病毒DNA，利用引物PPV-f和PPV-r扩增得到猪细小病毒VP2基因序列，通过TA克隆将该猪细小病毒VP2基因序列连接至pEASY-T1载体，转化后筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为pEASY-VP2。

进一步的，本发明还提供了一种所述的检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)使用所述的实时荧光PCR试剂盒进行扩增时，反应体系以20μL计为：

荧光PCR反应液(含酶)：15μL；

10μM SEQ ID NO:1所示的上游扩增引物PPV-f：0.6～1.2μL；

10μM SEQ ID NO:2所示的下游扩增引物PPV-r：0.6～1.2μL；

10μM SEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针PPV-p：0.3～0.6μL；

DNA模板：2～4μL；

ddH₂O：补足至20μL；

(2)实时荧光PCR的反应条件为：50℃UNG酶激活2min；95℃预变性5min；95℃变性15Sec，60℃退火30Sec并收集荧光，共40个循环；结束反应；

(3)结果分析：

质量控制：阴性对照FAM通道检测无Ct值；阳性对照FAM通道检测Ct值≤30；上述条件同时满足，检测结果有效；

结果判定：FAM通道检测Ct值≤40，则判定样品为猪细小病毒感染阳性；FAM通道检测无Ct值，则判定样品为猪细小病毒感染阴性。

在本发明中，优选的，所述DNA模板采用以下方法制备得到：

(1)脐带血全血、病料组织可使用商品化DNA提纯试剂盒进行提取，提取方法参照所使用试剂盒说明书；或者

(2)脐带血分离血浆或血清使用本发明试剂盒中所提供的病毒裂解液进行DNA释放；具体为：微量取血浆或血清1-2μL置PCR反应管中，加入等体积的病毒裂解液，混匀室温静置5min，加入荧光PCR反应体系进行扩增；

病毒裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS，其在裂解液中的质量分数为0.1-0.2％；③吐温20，其在裂解液中的质量分数为1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的质量分数为1-2％。

本发明在核酸提取环节中，直接使用盐酸胍、SDS、吐温20、NP40对微量样本中的病毒进行高效裂解，DNA经释放后可稳定存在，直接用于后续PCR反应。为避免溶血对PCR的影响，建议溶血严重样本使用商品化DNA提纯试剂盒进行提取。

在本发明中，为了使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值，对待检脐带血中提取的DNA模板浓度、引物浓度和特异性荧光探针的浓度进行了优化，尤其是探针的浓度。引物浓度过低会影响扩增效率，引物浓度过高会引起错配和非特异性扩增，且增加引物之间形成二聚体的机会，同样特异性荧光探针浓度过低会引起特异性的荧光信号变弱，而浓度过高则会引起探针与模板发生非特异性结合，产生非特异性荧光信号从而干扰特异性荧光信号，待检脐带血中提取的DNA模板浓度会影响PCR扩增的效率，应根据目的基因的大小选择合适的DNA模板浓度。本发明经过一系列优化试验，最终确定本发明的荧光PCR反应体系和反应条件，采用本发明的实时荧光PCR方法检测猪细小病毒的扩增效率达到90％以上，并可获得最小的Ct值。

更进一步的，本发明还提供了所述的试剂盒在制备检测仔猪脐带血中猪细小病毒试剂中的用途。

本发明将猪细小病毒的VP2基因和TaqMan探针相结合，在猪细小病毒的VP2基因选取保守区设计特异性引物和特异性探针，通过对待检脐带血中提取的DNA模板浓度、引物浓度以及特异性荧光探针浓度等进行优化，建立了仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR方法。灵敏度试验结果表明，该方法的检测范围为10⁸-10²copies/μL，可以从猪细小病毒感染脐带血中检测到最低100copies的猪细小病毒核酸，灵敏度是常规PCR方法的300倍。特异性试验结果表明，该方法对猪蓝耳经典株，猪圆环病毒，猪轮状病毒，猪传染性胃肠炎病毒，猪伪狂犬病毒，猪流行性腹泻病毒，乙型脑炎病毒，猪瘟病毒，犬细小病毒等的细胞培养物及正常细胞均无非特异性反应，说明该方法特异性和可靠性强。准确性试验结果表明，对于阳性对照与阴性对照的检测，该方法与常规PCR方法检测结果100％符合；对于临床样品的检测，该方法检测猪细小病毒阳性6/67，常规PCR方法检测猪细小病毒阳性5/67，且后者检测的5份样品使用该方法检测均为阳性，说明该方法比常规PCR方法更敏感，准确性高。重复性试验结果表明，该方法对不同核酸浓度(10⁶、10⁵、10⁴copies/μL)的阳性对照pEASY-VP2克隆质粒检测变异系数(CV)均小于2％，具有较好的重复性。

本发明利用实时荧光PCR方法代替常规PCR方法，并制备成试剂盒，主要通过检测猪脐带血中是否含有PPV，评估及预警猪群PPV感染状况，及时制定防控计划。同时，本发明的方法亦可用于对发病猪病料组织的检测，检测更准确、快速。

综上所述，本发明建立的检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR方法和基于该方法建立的试剂盒具有准确度高，灵敏度高，特异性强和重复性优的特点，可以用于猪细小病毒感染的病原学研究、早期诊断，对猪细小病毒的快速诊断、综合防控、病原净化和早期治疗具有重要意义。

本发明试剂盒检测快速、准确、敏感，更适用于脐带血中微量的PPV检测。本发明应用实时荧光PCR检测仔猪脐带血中猪细小病毒的工作原理：猪属于上皮绒毛胎盘，猪胎盘生理正常的结构即血胎屏障，胎盘屏障的存在使正常的脐带血内不存在任何病原和抗体等大分子物质，但在如某些病毒单独或协同感染的情况下，屏障通透性变化导致病原从母体垂直传播至新生个体。PPV病毒颗粒小，且主要引起繁殖障碍相关症状，且鉴于猪的多病毒混合感染非常严重，因此采用从仔猪脐带血中检测PPV来评价及预警猪细小病毒病的发病情况，这种寻找“源头”的检测方法更加科学、直接、有效。基于脐带血的检测步骤为：(1)样品采集；(2)样品处理；(3)DNA提取；(4)实时荧光PCR：利用本发明设计的特异性引物和探针进行；(5)判定结果。

本发明还提供了一种脐带血的采集方法，具体步骤如下：

(1)取干净的青霉素瓶和瓶塞，清洗干净，煮沸灭菌30分钟，烘干后收集备用；

(2)当仔猪出生时，将每头母猪分娩的所有仔猪的“脐带血”都挤到一个干净的青霉素瓶中，每头仔猪3-5滴即可；若母猪分娩出现木乃伊、死胎时，同窝仔猪脐带血重点检测；弱仔的脐带血可以另外单独再收集一份，重点检测；

(3)脐带血收集完后盖好瓶塞，用标签纸或者医用白胶布在青霉素瓶做好标记，注明采集时间、母猪耳号、胎次等信息；

(4)将收集的脐带血的青霉素瓶放至-20℃冰箱冷冻保存，送至实验室检测，并附上采集脐带血样品的数量、母猪耳号、需要检测项目的清单。

本发明脐带血的采集方法克服现有常规采血技术的耗时长、采血困难、对猪只应激大等问题，脐带血采集简单、方便、快捷和无应激。

与现有技术相比，本发明的试剂盒具有以下有益效果：

(1)本发明的检测方法克服了常规检测技术耗时长、敏感度低、安全系数低、抗污染能力差和不能准确定量等问题，检测快速高效，不会造成样品交叉污染。

(2)本发明的检测方法准确度高，灵敏度高，特异性强，重复性优，可以实现较大通量样品的检测。

(3)本发明的检测方法不仅适用于检测脐带血检测，还适用于待检猪的脾脏、淋巴结、血清及血浆等样品，可用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等。

(4)在日常猪细小病毒检测及疾病净化过程中，需进行活体采样，对猪群的应激较大，难度也高，而脐带血避免了这些问题，脐带血虽然含毒量相对于组织而言要低，在实际应用中也对组织及对应脐带血进行了相互印证，确保本发明检测方法的特异性及敏感性。

(5)本发明操作简单操作时间短，做一次病原检测仅需要2-3小时，快捷迅速、节约成本；而且需要仪器设备相对简单，不需要电泳仪、凝胶成像系统及其分析软件；结果相对可靠，不需要电泳，空气中气溶胶相对较少，不易污染；技术操作要求低，可以在基层大量推广；基于该检测方法制备的试剂盒易于质量控制，易于标准化。

附图说明

图1为本发明阳性对照10倍稀释的梯度标准曲线；

图2为本发明敏感性检测结果图；

图3为本发明特异性检测结果图。

图4为本发明重复性检测结果图；

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。

实施例1检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒的组成

(1)荧光PCR反应液(含酶)：该反应液中含有UNG酶系统，在扩增环节可以有效解决扩增污染现象，抗污染能力强等；

(2)上下游引物组PPV-f和PPV-r：由上海生工生物工程公司合成，用DEPC水配制成浓度为10μM。

上游扩增引物PPV-f：5’-GAACAAGAAATATTCAATGTAGTA-3’，其为SEQ ID NO:1序列；

下游扩增引物PPV-r：5’-TGTGTTATTGGTGTCTAGT-3’，其为SEQID NO:2序列；

(3)特异性荧光探针PPV-p：由华大基因公司合成，用DEPC水配制成浓度为10μM。

特异性荧光探针PPV-p：FAM-5’-CAGCAACCTCACCACCAACC-3’-TAMRA，其为SEQ ID NO:3序列，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；

本发明对GenBank中公布的PPV和其它宿主的细小病毒毒株基因序列进行对比分析，在PPV病毒基因组高度保守的VP2基因上设计了只针对PPV的通用上下游扩增引物，且匹配性和特异性良好。同时在该上下游引物扩增区123bp片段间计了高度保守的特异性荧光探针，该特异性荧光探针能与PPV病毒核酸特异性结合，引物进行扩增过程中，探针发生酶解，致荧光积累被仪器检测到。该组引物与探针扩增效率较好，能特异性扩增PPV核酸，同其它宿主细小病毒无交叉。

(4)阳性对照为克隆有猪细小病毒VP2基因片段的重组质粒pEASY-VP2，由本实验室构建，质粒在紫外分光光度计OD260nm测定质量浓度，按公式6.02×10²³×(X ng/μL×10^-9)/DNA length×660换算为拷贝数，配制浓度为1.0×10⁵copies/μL～1.0×10⁷copies/μL；

其中，克隆质粒pEASY-VP2的构建方法如下：①按照商业试剂盒操作说明书提取猪细小病毒核酸；以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作为特异性引物扩增VP2基因中123bp目的片段，反应条件为：95℃预变性1min；95℃变性10Sec，60℃退火30Sec，72℃延伸30s，共30个循环；72℃再延伸10min，4℃保温5min。PCR产物于2％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定；②PCR产物的纯化、克隆及序列分析：PCR产物用AXYGEN公司的AxyPrep DNA GelExcraction Kit胶回收试剂盒回收，通过TA克隆将猪细小病毒VP2基因中123bp目的片段克隆至pEASY-T1载体，然后转化Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培养基平板上，37℃培养12h-18h。经蓝白斑筛选后，用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit 1质粒提取试剂盒提取质粒，然后用引物进行扩增和测序，测序后比对成功的克隆质粒命名pEASY-VP2。

猪细小病毒VP2基因123bp目的片段的核苷酸序列如下所示：

GAACAAGAAATATTCAATGTAGTACTTAAAACAATTACAGAATCAGCAACCTCACCACCAACCAAAATATATAATAATGATCTAACTGCAAGCTTAATGGTCGCACTAGACACCAATAACACA(SEQ ID NO:4)。

(5)阴性对照为无DNAase的ddH₂O；

(6)病毒裂解液

病毒裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS，其在裂解液中的质量分数为0.1-0.2％；③吐温20，其在裂解液中的质量分数为1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的质量分数为1-2％。

本发明DNA模板根据不同的样本情况，采用以下两种不同的方法制备得到：

(1)脐带血全血、病料组织可使用商品化DNA提纯试剂盒进行提取，方法参照所使用试剂盒说明书；或者

(2)脐带血分离血浆或血清使用本发明试剂盒中所提供的病毒裂解液进行DNA释放；具体为：微量取血浆或血清1-2μL置PCR反应管中，加入等体积的病毒裂解液，混匀室温静置5min，加入荧光PCR反应体系进行扩增；

本发明在核酸提取环节中，直接使用盐酸胍、SDS、吐温20、NP40对微量样本中的病毒进行高效裂解，DNA经释放后可稳定存在，直接用于后续PCR反应。为避免溶血对PCR的影响，建议溶血严重样本使用商品化DNA提纯试剂盒进行提取。

(7)使用说明书。

实施例2检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒的使用方法

本发明试剂盒使用方法具体包括以下步骤：(1)样品采集；(2)样品处理；(3)DNA提取；(4)实时荧光PCR：利用本发明设计的特异性引物和探针进行实时荧光PCR检测；(5)判定结果。

1.样品采集

(1)脐带血样品采集

a.取干净的青霉素瓶和瓶塞，清洗干净，煮沸灭菌30分钟，烘干后收集备用；

b.当仔猪出生时，将每头母猪分娩的所有仔猪的“脐带血”都挤到一个干净的青霉素瓶中，每头仔猪3-5滴即可，将其“脐带血”挤到青霉素瓶，密封；

注意事项：①必须要采集同窝母猪产的所有的仔猪，避免同窝母猪所产仔猪的个体差异造成漏检；②可以双人操作，也可以单独操作，若仔猪脐带血不便挤出，可以将脐带剪成几段再操作即可；③若母猪分娩出现木乃伊，死胎时，同窝仔猪脐带血重点检测；④弱仔的脐带血可以另外单独再收集一份，重点检测；

c.脐带血收集完后盖好瓶塞，用标签纸或者医用白胶布在青霉素瓶做好标记，注明采集时间、母猪耳号、胎次等信息；

d.将收集的脐带血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷冻保存，送至实验室检测，并附上采集脐带血样品的数量、母猪耳号、需要检测项目的清单。

(2)病料样品(扁桃体、肾脏、肺脏和淋巴结等)

A、剖解取内脏：将患病猪剖解，取出完整的上述内脏，放置在同一个干净塑料袋内。

B、记录：将装有内脏的塑料袋密封，贴标签并记录发病猪的日龄、体重、品种、临床症状等信息。

C、将采集的病料样品集中送至实验室，并附上所记录的信息。

2.DNA提取

(1)使用商业试剂盒进行DNA提纯(按商业试剂盒说明书操作)。

(2)脐带血分离血浆或血清使用本发明试剂盒中提供的病毒裂解液进行DNA释放。微量取血浆或血清1-2μL置PCR反应管中，加入等体积的病毒裂解液，混匀室温静置5min，加入反应体系进行扩增。

所述病毒裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS，其在裂解液中的质量分数为0.1-0.2％；③吐温20，其在裂解液中的质量分数为1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的质量分数为1-2％；

本发明在核酸提取环节中，直接使用盐酸胍、SDS、吐温20、NP40对微量样本中的病毒进行高效裂解，DNA经释放后可稳定存在，直接用于后续PCR反应。为避免溶血对PCR的影响，建议溶血严重样本使用商品化DNA提纯试剂盒进行提取。

为监测提取过程中的污染，建议在提取样本的同时提取一管水作为阴性对照。

3.荧光PCR反应

对实时荧光PCR反应体系和反应条件进行优化，优化原则为：通过优化使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值。经过优化，实时荧光PCR反应体系和反应条件如下所示：

(1)实时荧光PCR反应体系以20μL计为：10μM SEQ ID NO:1所示的上游扩增引物PPV-f：0.6～1.2μL；10μM SEQ ID NO:2所示的下游扩增引物PPV-r：0.6～1.2μL；10μM SEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针PPV-p：0.3～0.6μL；荧光PCR反应液(含酶)：15μL；DNA模板：2～4μL；ddH₂O：补足至20μL。

同时设有阳性对照和阴性对照，阳性对照克隆质粒pEASY-VP2：2～4μL，其余组分相同；阴性对照无DNA酶的ddH₂O：2～4μL，其余组分相同。

(2)实时荧光PCR的反应条件为：50℃UNG酶激活2min；95℃预变性5min；95℃变性15Sec，60℃退火30Sec并收集荧光，共40个循环；结束反应。

(3)结果分析：

质量控制：阴性对照FAM通道检测无Ct值；阳性对照FAM通道检测Ct值≤30；上述条件同时满足，检测结果有效；

结果判定：FAM通道检测Ct值≤40，则判定样品为猪细小病毒感染阳性；FAM通道检测无Ct值，则判定样品为猪细小病毒感染阴性。

实施例3检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒的验证

1.试剂盒扩增效率验证

对阳性对照克隆质粒pEASY-VP2进行10倍梯度稀释，使其拷贝数为：10⁸-10¹copies/μL，每个梯度重复三次进行猪细小病毒实时荧光PCR，根据扩增结果制作标准曲线。

图1为本发明阳性对照10倍稀释的梯度扩增标准曲线(FAM通道)，其中该标准曲线的参数如下：斜率：-3.60，截距：43.10，相关系数：1.00，扩增效率：0.90。

综上，说明该试剂盒检测猪细小病毒核酸的扩增效率均达到90％以上。

2.灵敏度试验

以10倍梯度稀释的阳性对照克隆质粒pEASY-VP2作为模板，进行本发明试剂盒的灵敏度检测，检测范围为10⁸-10¹copies/μL。结果表明，该方法的检测范围为10⁸-10²copies/μL，在此范围的病毒含量可以得到可靠的结果，即该方法的灵敏度可以检测到最低100拷贝数的病毒含量的样品，检测结果见图2。

3.特异性试验

为了检测本发明试剂盒的特异性，利用本发明的试剂盒检测猪蓝耳经典株，猪圆环病毒，猪轮状病毒，猪传染性胃肠炎病毒，猪伪狂犬病毒，猪流行性腹泻病毒，乙型脑炎病毒，猪瘟病毒，犬细小病毒等9种病毒的提取核酸。

检测结果表明：本发明的试剂盒仅对PPV进行扩增，表明本发明试剂盒能特异性扩增PPV，而不与其它核酸发生交叉反应，检测结果见图3。

4.重复性试验

选用阳性对照pEASY-VP2克隆质粒10⁶、10⁵、10⁴copies/μL，对每个浓度的样本做3个重复，结果不同核酸浓度的检测变异系数(CV)均小于2％，具有较好的重复性。检测结果见表1和图4。

表1实时荧光PCR检测猪细小病毒的重复性试验

5.准确性临床验证

采用本发明的试剂盒以及普通PCR方法对67份脐带血样品以及5份健康的脐带血样品进行了PPV检测，结果表明，对于临床样品的检测，该试剂盒方法检测PPV阳性6/67，常规PCR方法检测PPV阳性5/67，且后者检测的5份样品使用该试剂盒方法检测均为阳性，说明该试剂盒方法更敏感，准确性高；对于PPV阴性临床样品的检测，该试剂盒方法检测结果同常规PCR方法一致。检测结果见表2。

表2采用本发明试剂盒以及普通PCR对临床样品进行检测结果的比较

综上可见，本发明设计的一对特异性引物和一条特异性荧光探针以及构成的实时荧光PCR试剂盒可以快速鉴定仔猪脐带血中的猪细小病毒，而且该检测方法简单、快速、特异性好、灵敏度高、可重复性好，检测结果真实可靠。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>湖南新南方养殖服务有限公司

<120>一种检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒及其用途

<130> FI160696-ND

<160> 4

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

gaacaagaaatattcaatgtagta 24

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

tgtgttattggtgtctagt 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

cagcaacctcaccaccaacc 20

<210> 4

<211> 123

<212> DNA

<213> PPV VP2基因序列

<400> 4

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accaaaatatataataatgatctaactgcaagcttaatggtcgcactagacaccaataac 120

aca 123