一种检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒及其用途的制作方法

文档序号:12250106阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒,其特征在于,包括扩增引物和特异性荧光探针,所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示:

上游扩增引物PPV-f:5’-GAACAAGAAATATTCAATGTAGTA-3’,其为SEQ ID NO:1序列;

下游扩增引物PPV-r:5’-TGTGTTATTGGTGTCTAGT-3’,其为SEQ ID NO:2序列;

特异性荧光探针PPV-p:FAM-5’-CAGCAACCTCACCACCAACC-3’-TAMRA,其为SEQ ID NO:3序列,其中FAM为荧光报告基团,TAMRA为荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒,其特征在于,所述上游扩增引物PPV-f、所述下游扩增引物PPV-r和所述特异性荧光探针PPV-p的摩尔比为2:2:1。

3.根据权利要求2所述的检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒,其特征在于,所述上游扩增引物PPV-f、所述下游扩增引物PPV-r在所述试剂盒中的终浓度均为0.3~0.6μM,所述特异性荧光探针PPV-p在所述试剂盒中的终浓度为0.15~0.3μM。

4.根据权利要求1所述的检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、荧光PCR反应液(含酶)、病毒裂解液及说明书。

5.根据权利要求4所述的检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒,其特征在于,所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O,所述阳性对照为含有猪细小病毒VP2基因序列的克隆质粒pEASY-VP2,克隆质粒pEASY-VP2的终浓度为1.0×105copies/μL~1.0×107copies/μL;所述病毒裂解液的成分及配比如下:①盐酸胍4-6M;②十二烷基磺酸钠SDS 0.1-0.2%;③吐温201-2%;④乙基苯基聚乙二醇NP40 1-2%。

6.根据权利要求5所述的检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒,其特征在于,所述猪细小病毒VP2基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

7.根据权利要求6所述的检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒,其特征在于,所述克隆质粒pEASY-VP2采用以下方法制备得到:提取猪细小病毒DNA,利用引物PPV-f和PPV-r扩增得到猪细小病毒VP2基因序列,通过TA克隆将该猪细小病毒VP2基因序列连接至pEASY-T1载体,转化后筛选阳性克隆,测序正确的克隆质粒命名为pEASY-VP2。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)使用权利要求1-7任一项所述的实时荧光PCR试剂盒进行扩增时,反应体系以20μL计为:

荧光PCR反应液(含酶):15μL;

10μM SEQ ID NO:1所示的上游扩增引物PPV-f:0.6~1.2μL;

10μM SEQ ID NO:2所示的下游扩增引物PPV-r:0.6~1.2μL;

10μM SEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针PPV-p:0.3~0.6μL;

DNA模板:2~4μL;

ddH2O:补足至20μL;

(2)实时荧光PCR的反应条件为:50℃UNG酶激活2min;95℃预变性5min;95℃变性15Sec,60℃退火30Sec并收集荧光,共40个循环;结束反应;

(3)结果分析:

质量控制:阴性对照FAM通道检测无Ct值;阳性对照FAM通道检测Ct值≤30;上述条件同时满足,检测结果有效;

结果判定:FAM通道检测Ct值≤40,则判定样品为猪细小病毒感染阳性;FAM通道检测无Ct值,则判定样品为猪细小病毒感染阴性。

9.根据权利要求8所述的检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒的使用方法,其特征在于,所述DNA模板采用以下方法制备得到:

(1)脐带血全血使用商品化DNA提纯试剂盒进行提取;或者

(2)脐带血分离血浆或血清使用病毒裂解液进行DNA释放;具体为:微量取脐带血分离血浆或血清1-2μL置PCR反应管中,加入等体积的病毒裂解液,混匀室温静置5min。

10.权利要求1-7任一项所述的试剂盒在制备检测仔猪脐带血中猪细小病毒试剂中的用途。

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