一种用于检测D型流感病毒的RT‑LAMP引物及检测方法与流程

本发明涉及分子检测技术领域，具体涉及一种用于检测D型流感病毒的RT-LAMP引物及检测方法。

背景技术：

流行性感冒(简称流感)是由流感病毒感染引起的急性呼吸道传染病，它发病率高、传染性强、潜伏期短，对人群尤其是儿童、老年人及机体免疫力低下的易患人群造成很大的危害。该病症状可累及全身，主要表现为急性高热、全身疼痛、显著乏力和轻度的呼吸道症状，可引起严重的并发症导致死亡。20世纪以来全球至少有4次流感大流行[雷达，等，2009；宋乐，江晓静，2014]。流感属于乙类传染性，其致病因子流感病毒(Influenza virus)属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，是一种带包膜并且分节段的单负链RNA病毒(候文郁，等，2014)。根据流感病毒的NP蛋白和M蛋白的抗原性质不同，可将流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。甲型流感病毒的传染性、致病性和变异性都明显高于其他两种血清型，能引起世界性流感大流行(许沙沙，等，2015)；乙型流感病毒常引起局部暴发，不引起世界性流感大流行；丙型流感病毒主要以散在形式出现，侵袭婴幼儿，一般不引起流行(KAITLIN RL,et a1.2013)。

流感病毒的检测方法包括分离培养法、免疫学检测和分子生物学检测。分离培养法是一种基于细胞病变的检测方法，有TCID₅₀的测定和空斑实验，是流感病毒滴度测定的常规实验方法，TClD₅₀实验测得结果的主观性较强，结果不够精确；空斑实验是病毒学中一种比较准确的定量方法，但实验操作的熟练程度要求较高，以上两种方法比较费时费力，且我国大部分实验室达不到重大传染病病毒分离培养要求，因而实验室通常采用免疫学检测与核酸检测法进行诊断(苏明权，等，2011)。免疫学检测方法包括血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验、免疫荧光(IF)技术和酶联免疫吸附试验(ELISA)。免疫学检测方法具有特异性强，敏感性高，适应面广，方法简便快速，制样简单等特点，但存在操作费时且敏感性较差的问题(Brittain-long R,et a1.2008)。在血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验中，红细胞浓度、稀释液、反应的温度、加抗原与加红细胞之间的时间间隔及结果的判定标准均会影响试验结果，而且HI试验需预处理血清中的非特异性血凝抑制因子，其缺点是存在一定的假阳性。免疫荧光技术的非特异性染色问题也尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。与免疫荧光相似，ELISA检测过程中，同样会出现假阳性。分子生物学检测是业内公认灵敏度和特异度最好的一种检测方法。该方法是在PCR原理的基础上，先后建立了多种PCR相关检测方法，最常用的如逆转录PCR(RT-PCR)、实时荧光PCR以及新型的环介导等温扩增技术(RT-LAMP)技术。环介导等温扩增技术(1oop-mediaed isothermal amplification，LAMP)是日本Notomi等(Notomi T,et a1.2000)在2000年报道的一种新的核酸扩增技术。与传统的扩增技术相比，该技术扩增的特异性更强，反应过程只需在60～65℃的恒温条件下60～90min即可完成，不需要热循环。由于反应过程中不需要开启试管盖，因此大大降低了实验室污染的可能性，并且具有重复性好、特意性强、敏感度高和易于操作等特点，是未来流感病毒检测应用最广泛的技术之一。目前，国内外尚未见以荧光RT-LAMP方法检测D型流感病毒的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于检测D型流感病毒的RT-LAMP引物及检测方法，选取D型流感病毒的非结构蛋白基因序列，针对病毒的高保守区域的6个特异性序列(3’端的F3c、F2c、F1c以及5’端的B1、B2、B3)设计了6条特异性引物，旨在建立一种基于环介导等温核酸扩增技术的D型流感病毒检测方法，该方法在60℃～65℃恒温条件下1h甚至更短的时间即可完成基因扩增。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种用于检测D型流感病毒的RT-LAMP引物，包括正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF和反向环引物LB；所述正向内引物FIP如SEQ NO.1所示，反向内引物BIP如SEQ NO.2所示，正向外引物F3如SEQ NO.3所示，反向外引物B3如SEQ NO.4所示，正向环引物LF如SEQ NO.5所示，反向环引物LB如SEQ NO.6所示。

上述RT-LAMP引物检测D型流感病毒的检测方法，它包括以下步骤：

S1.提取流感病毒样本的总RNA，并以此为模板RNA；

S2.将2μL的模板RNA、12.5μL的反应液RM、40μM的FIP和BIP各1μL、20μM的LF和LB各1μL、5μM的F3和B3各1μL、1μL的Bst DNA聚合酶、0.5μL的逆转录酶、0.5μL荧光染料混合，加水至25mL混匀，加入20μL密封液，密封，混匀离心；

S3.进行RT-LAMP反应程序：63℃30S，1个循环；63℃15s、63℃45s，60个循环；于63℃45s处收集荧光信号。

进一步地，所述密封液为液体石蜡。

本发明的有益效果是：本发明选取D型流感病毒的非结构蛋白基因序列，针对病毒的高保守区域的6个特异性序列(3’端的F3c、F2c、F1c以及5’端的B1、B2、B3)设计了6条特异性引物，旨在建立一种基于环介导等温核酸扩增技术的D型流感病毒检测方法，该方法在60℃～65℃恒温条件下1h甚至更短的时间即可完成基因扩增，实现检测方法简单，检测迅速，便捷的检测。

附图说明

图1为本发明RT-LAMP体系检测结果；

图2为本发明RT-LAMP特异性检测结果；

图3为本发明RT-LAMP灵敏度检测结果(由左向右为10⁹-10¹)。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

试验例

按照引物设计原则，选取D型流感病毒的非结构蛋白基因序列，针对病毒的高保守区域的6个特异性序列(3’端的F3c、F2c、F1c以及5’端的B1、B2、B3)，用LAMP designer1.14软件设计6条引物，分别为正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向环引物(LF)及反向环引物(LB)，引物序列见表1；引物由上海Invitrogen生物科技有限公司合成；合成后的引物用灭菌DEPC水稀释成100pmol/μL溶液，-20℃保存。

表1 D型流感病毒RT-LAMP引物

病毒RNA的提取方法参照OMEGA公司的Mag-Bind Viral DNA/RNA Kit说明书进行，提取流感病毒样本的总RNA，并以总DNA为模板RNA；

配制25μL的RT-LAMP反应体系成分，见表2；同时设立不含模板RNA的阴性对照组；

表2 RT-LAMP反应混合物

将上述体系充分混匀后，加入20μL密封液(液体石蜡)，混匀离心，封口胶封住盖紧的管盖；RT-LAMP反应程序为：63℃30S，1个循环；63℃15s、63℃45s，60个循环；于63℃45s处收集荧光信号，荧光通道选为FAM；检测结果如图1所示。

特异性试验

将提取的7株A型流感病毒RNA、21株B型流感病毒的RNA和重组的C型流感病毒质粒、D型流感病毒质粒，分别进行RT-LAMP扩增，对其扩增结果进行鉴定，以验证所用引物及所建立方法的特异性，结果如图2。

灵敏度试验

将D型流感病毒的合成质粒，用ND-1000微量分光光度计测定质粒浓度，根据阿伏伽德罗常数换算为目的基因的拷贝数，以10倍比稀释至10拷贝/μL，对梯度稀释的阳性对照进行RT-LAMP反应检测，结果如图3。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 一种用于检测D型流感病毒的RT-LAMP引物及检测方法

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