21种食源性致病微生物多重PCR检测试剂盒的制作方法

本实用新型属于分子生物学检测领域，涉及一种21种食源性致病微生物多重PCR检测试剂盒，特别涉及(结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、出血性大肠杆菌、单核增生性李斯特菌、沙门氏菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、霍乱弧菌CTX型、霍乱弧菌OMPW型、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌-yst型、小肠结肠炎耶尔森菌-ail型、轮状病毒和诺瓦克病毒)的多重PCR检测试剂盒。

背景技术：

食源性致病微生物是引起食物中毒的重要生物学因素。随着国家对食品安全工作的重视，快速筛查食物中毒原因成为当务之急。食源性微生物性疾病的病原菌种类繁多，通过临床症状难以区分病原菌种类，因此在以往的食源性疾病诊断中，明确的大便培养结果非常重要，但大便培养耗时长，一般需要3-4天，因此临床医生往往在无病原学诊断结果的前期就经验性使用抗生素治疗食源性腹泻，从而导致抗生素滥用及病原菌耐药。有关专家提出只有正确的细菌病原学诊断，是抗生素合理应用的基础。因此快速的病原学检查是解决这一问题的关键。食源性致病微生物中的病原菌主要是副溶血性弧菌、沙门菌、变形杆菌和致泻性大肠埃希菌等。其他如志贺菌属、霍乱弧菌、葡萄球菌、弯曲菌等病原菌都是常见的致病菌。

多重PCR技术因具有较高的灵敏度和特异性，缩短了检测时间，提高检测效率和通量，是一种快速检测病原体的方法，可弥补粪便培养及其他PCR检测的不足，是现在食源性疾病病原学检测技术的一种重要补充。多重PCR能避免费时费力的大海捞针式的排查,根据症状,选择合适的靶序列组合,即对可能的病原体在一次反应获得结果。为处理“微生物性”食物中毒导致的“群体性腹泻、呕吐”等突发事件提供科学依据,争取宝贵时间。

然而，传统的多重PCR检测试剂盒只能对几种特定的病原菌进行检测。发生食品安全突发事件的时候，如果检测人员需要前往现场进行检测，同时携带多个试剂盒，不但携带不方便，而且试剂盒的固定就成为一个问题，若固定不稳，试剂瓶会相互碰撞并产生破裂或者泄露。

技术实现要素：

本实用新型针对现有技术的缺点，提供了食源性致病微生物多重PCR检测试剂盒，能够很好的固定在试剂盒中方便携带，并且含有食源性疾病中常见的(结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、出血性大肠杆菌、单核增生性李斯特菌、沙门氏菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、霍乱弧菌CTX型、霍乱弧菌OMPW型、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌-yst型、小肠结肠炎耶尔森菌-ail型、轮状病毒和诺瓦克病毒)等21种致病微生物的所有检测试剂，能够快速、有效、准确的筛查检测出结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、出血性大肠杆菌、单核增生性李斯特菌、沙门氏菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、霍乱弧菌CTX型、霍乱弧菌OMPW型、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌-yst型、小肠结肠炎耶尔森菌-ail型、轮状病毒和诺瓦克病毒的目的。

为实现上述目的，本实用新型可采取下述技术方案：

21种食源性致病微生物多重PCR检测试剂盒，包括盒体，盒盖和位于盒体内的卡板，所述卡板上设有七个限位孔，每个限位孔中设有一个试剂管；

其中七个试剂管分别为1个多重PCR引物组反应液管，1个多重RT-PCR引物组反应液管，2个酶反应混合液管，1个阴性对照品管和2个阳性对照品管；

所述七个限位孔分为四排，左起第一排设有两个限位孔；左起第二排设有两个限位孔；左起第三排设有一个限位孔；左起第四排设有两个限位孔；

所述盒体下部还设有固定底座；

所述固定底座上设有与七个试剂管位置一致的凹槽。

进一步，于本发明的实施例中，所述两个阳性对照品管中分别包括了19种致病细菌的核酸模板，和2种致病病毒的核酸模板。

进一步，于本发明的实施例中，阴性对照品管内含无菌去离子水。

进一步，于本发明的实施例中，所述卡板设置在盒体上部。

进一步，于本发明的实施例中，所述盒体下部还设有固定底座。

进一步，于本发明的实施例中，所述固定底座上设有与七个试剂管位置一致的凹槽。

进一步，于本发明的实施例中，所述凹槽形状为半球形，其形状与试剂管的底部结构形状一致。

进一步，于本发明的实施例中，所述试剂管为1.5mL的离心管。

进一步，于本发明的实施例中，所述七个限位孔分为四排，左起第一排设有两个限位孔，限位孔内分别设有1个装有检测19种致病细菌的特异基因位点的多重PCR引物组反应液管，1个装有检测2种致病病毒的特异基因位点的多重RT-PCR引物组反应液管；左起第二排设有两个限位孔，限位孔内分别为酶反应混合液管；左起第三排设有一个限位孔，限位孔内为阴性对照品管；左起第四排设有两个限位孔，限位孔内分别为装有19种致病细菌的核酸模板的阳性对照品管，和装有2种致病病毒的核酸模板的阳性对照品管。

本实用新型具有以下的显著技术效果：

本实用新型使用特殊设计的引物，扩增提取到的21种食源性致病微生物的致病基因片段，能够实现快速检测相关致病微生物的特征基因片段，从而就可以筛查出样本中是否含有上述致病微生物。从结构上来说，本实用新型所述的试剂盒优点在于：首先在同一反应体系中分别进行19种细菌和2种病毒的2个多重反应，多重PCR方法操作简单快速，能同时检测21种常见致病微生物；而普通的单一PCR分子生物学检测技术在检测时效性、操作简便性和成本控制方面均差强人意。其次，本试剂盒中的阳性对照包含待测21种微生物的核酸模版，能监控多重体系中每对引物的工作情况是否正常，避免实验出现假阴性结果。

进一步的，本发明的试剂盒中还设置了固定底座，并且在固定底座上设置凹槽，与试剂管的底部相匹配，通过该固定底座的设置可以更好的实现试剂管的稳固放置。

进一步的，本发明的试剂盒通过将试剂管分为四排，根据功能分区，更清晰明了，操作简单，不容易产生混淆。

附图说明

图1为21种食源性致病微生物多重PCR检测试剂盒的结构示意图。

图2为图1中固定底座的结构示意图。

图3为图1中固定底座和盒体相结合的结构示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本实用新型作进一步的详细描述。

实施例1

一种21种食源性致病微生物多重PCR检测试剂盒，如图1、2和3所示，包括盒体1，盒盖2，卡板3。

其中盒体1和盒盖2一侧相连，盒盖2可以实现密封盒体1。

卡板3设置在盒体1的上部，设有七个限位孔，每个限位孔内均设有试剂管。

其中左起第一排分别为装有检测19种致病细菌的特异基因位点的多重PCR引物组反应液管4和装有检测2种致病病毒的特异基因位点的多重RT-PCR引物组反应液管5。

其中19种致病细菌分别为结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、出血性大肠杆菌、单核增生性李斯特菌、沙门氏菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、霍乱弧菌CTX型、霍乱弧菌OMPW型、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌-yst型、小肠结肠炎耶尔森菌-ail型；2种致病病毒为轮状病毒和诺瓦克病毒。

左起第二排分别为第一酶反应混合液管6和第二酶反应混合液管7。

左起第三排为阴性对照品管8，阴性对照品管8内含无菌去离子水。

左起第四排为第一阳性对照品管9和第二阳性对照品管10，其中第一阳性对照品管9中包括了19种致病细菌的核酸模板，第二阳性对照品管10包括了2种致病病毒的核酸模板。

本发明一个实施例中，所述盒体1下部还设有固定底座11，所述固定底座11上设有与七个试剂管位置一致的凹槽12。

固定底座11材料为泡沫塑料，可将反应液管和对照品管做很好的固定；不仅适用于分子生物学实验室检测，也适用于检测人员前往现场进行检测。

进一步，于本发明的实施例中，所述凹槽12形状为半球形，其形状与试剂管的底部结构形状一致。通过设置凹槽12，与试剂管的底部相匹配，可以更好的实现试剂管的稳固放置。

本实用新型中试剂管为1.5mL的离心管。该规格的试管可以大规模便捷地应用于分子生物学检测领域。

优选的，本实用新型的多重PCR引物组反应液管中包含21组特殊设计的引物对，可实现扩增提取到的(结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、出血性大肠杆菌、单核增生性李斯特菌、沙门氏菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、霍乱弧菌CTX型、霍乱弧菌OMPW型、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌-yst型、小肠结肠炎耶尔森菌-ail型、轮状病毒和诺瓦克病毒)21种食源性致病微生物的致病基因片段，能够实现快速检测相关致病微生物的特征基因片段，从而就可以筛查出样本中是否含有上述21种致病微生物。

其中检测空肠弯曲菌的引物(说明：以下引物对的核酸序列均为5端到3端的核酸序列)为：

上游引物：AATACTAGACTTACAAGGCGAAT

下游引物：AATCCTCACTTGCCATTAAAG

检测结肠弯曲菌的引物为：

上游引物：CMTTTAGGAAGATCTTATGG

下游引物：TAAGCTGCCAAGCTCTTG

检测阪崎肠杆菌的引物为：

上游引物：CAGAACGCCTTCTGGAAC

下游引物：CTTCGCCGATGATCCAGT

检测大肠杆菌的引物为：

上游引物：TTGTTTGCCTCCCTGCTGC

下游引物：AAGCGTGGTGATGCTGC

检测肠侵袭性大肠杆菌的引物为:

上游引物：

TCAAGGTTGTTGCACTAACACATGTTTGGTTACTATCTGAGTAT

下游引物：GACTCTAGTTGTTGTTAATATCTCTAGCAGTACTATTAGCGC

检测肠出血性大肠杆菌(EHEC)的引物为：

上游引物：CCCGTTCGGCACAAGCATAAGA

下游引物：CCCGGARCCGRCRCGCCAGRARRCG

检测肠致病性大肠杆菌(EPEC)的引物为：

上游引物：GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC

下游引物：GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC

检测肠产毒性大肠杆菌(ETEC)的引物为：

上游引物：CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG

下游引物：CACCAGACAATGTAACCTCTG

检测出血性大肠杆菌(O157)的引物为：

上游引物：ACAGGTGAAGGTGGAATG

下游引物：CGCAGATATTTGTCATCCTA

检测单核增生性李斯特菌的引物为：

上游引物：AGCATCTCCGCCTGCAAG

下游引物：AGTAACAGCTTTGCCGAAA

检测沙门氏菌的引物为：

上游引物：CCGGKGAAATTATACCAT

下游引物：CTTTACCGGGCATACCAT

检测志贺菌的引物为：

上游引物：TCACATGGAACAATCTCCG

下游引物：GTTTCTCTGCGAGCATGG

检测金黄色葡萄球菌的引物为：

上游引物：CCTGAAGCAAGTGCATTTAC

下游引物：AGCATAAATATACGCTAAGC

检测蜡样芽孢杆菌的引物为：

上游引物：GTTGCGGATTTAAAAGTCATTG

下游引物：GCWGTTAAACCTTCACGA

检测霍乱弧菌CTX型的引物为：

上游引物：CTGTAAAGATGCCAATATCTC

下游引物：CGATGCGTTAAACACRAAG

检测霍乱弧菌OMPW型的引物为：

上游引物：CTGTAAAGATGCCAATATCTC

下游引物：CGATGCGTTAAACACRAAG

检测副溶血弧菌的引物为：

上游引物：GCCCGCTTTCTTCAGACTCA

下游引物：TCATACGAGTGGTTGCTG

检测小肠结肠炎耶尔森菌-yst型的引物为：

上游引物：ACCGCATAACGTCTTCGG

下游引物：GTAACGTCAATCACAAAGGT

检测小肠结肠炎耶尔森菌-ail型的引物为：

上游引物：ACCGCATAACGTCTTCGG

下游引物：GTAACGTCAATCACAAAGGT

检测轮状病毒的引物为：

上游引物：CTTTAAAAGAGAGATTTCCGTCTGG

下游引物：TCACATCATACAATTCTAATCTAAG

检测诺瓦克病毒的引物为：

上游引物：CCYAGACAAGAGCCAATGTTC

下游引物：GACGYCATCTTCATTCACAAAK

实施例1

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

按照下列方式制备含病原菌DNA的待测样品：

病原菌核酸提取和PCR体系构建

从平板上挑取适量菌落，加入含有200μL的无菌去离子水的灭菌离心管中，震荡混匀，菌悬液肉眼可见混浊即可。菌液煮沸10min，冷却至室温后，在13,000rpm下离心2min。将上清液移至新离心管中，即得到可用于本试剂盒检测的细菌DNA模版。目前，也可以使用市售试剂盒(如北京天根生化或德国qigen品牌)提取病原菌DNA。按照比例制备20μL的PCR反应体系，其中无菌去离子水4μL、2×Master Mix10μL、Primer Mix4μL、病原菌DNA2μL。

PCR反应

在96孔梯度热循环仪(杭州朗基)中进行，具体的参数条件如下：

94℃预变性6min；94℃变性30sec，59℃复性30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸7min。

PCR扩增产物的鉴定

用1×TAE缓冲液配置成2％的琼脂糖凝胶溶液，微波炉加热使琼脂糖完全溶解，加入1/20000体积的Dye Gene Green核酸染料(天根生化科技(北京)有限公司)，倒胶后取适量PCR产物(15μL)与6×LoadingBuffer混匀后，上样分析。90V电压下电泳30min后，在紫外凝胶成像系统下观察结果并拍照记录，对照核酸产物的条带大小来鉴定PCR扩增产物。

实施例2

按照实施例1的要求进行病原菌核酸提取和PCR体系构建，PCR反应；然后利用DW-800A多重食源性致病菌核酸检测系统的QSEP全自动毛细管电泳模块进行全自动的凝胶分离、成像及自动化条带分析。

实施例3

按照实施例1的要求进行病原菌核酸提取，并按照本实用新型技术方案的介绍在美国ICUBATE4000平台上构建专用的多重PCR检测卡盒，利用ICUBATE卡盒的多重、全自动、全封闭PCR反应和检测能力来进行多重PCR体系自动构建、扩增和多重PCR产物检测。

总之，以上所述仅为本实用新型的较佳实施例，凡依本实用新型申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本实用新型专利的涵盖范围。