本发明涉及微生物学和医药领域。更具体地说，本发明涉及产生细胞因子的用作治疗剂、特别是抗炎剂的重组细菌。
背景技术：
炎症性肠病(ibd)包括克罗恩病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)，其影响140万美国人，全球流行率为每10万人中有396名患者。世界各地的发病率和流行率都在不断增加，其中包括受影响较小的地区。
由于其症状(腹泻、腹痛、体重减轻)，ibd被认为是一种致残疾病。患者罹患其他炎症或非炎性疾病(如牛皮癣、癌症或关节炎)的风险因子较高。到目前为止，还没有根治这种疾病的疗法。最有效的治疗方法是注射针对tnf-α的重组抗体(英夫利昔单抗)，但是，虽然该疗法在初期对60％的患者有效，但在治疗一年后仍有缓解作用的比例下降到25-40％。ibd的最后一个解决方案是进行手术，以将肠的发炎部分切除。但是，手术可导致严重的并发症(例如短肠综合征)，且复发频繁。以上原因使得ibd成为发达国家的主要健康问题之一，因此，开发新型治疗剂或治疗策略是至关重要的。
已探索过的有助于减轻该疾病症状的方法之一是通过重组乳酸菌(lab)递送抗炎分子。最近有实验表明，喂食表达蛋白酶抑制剂elafin的lab的小鼠被保护免于肠道炎症。lab用于食品保存已有数千年的历史，似乎是一种有前途的用于递送活性分子的载体。世界卫生组织已认定其安全性，某些菌株可具有抗炎特性。
乳酸乳球菌(lactococcuslactis)是发酵乳制品的生产中应用最广泛的乳酸菌(lab)，其被认可为模式lab，因为已开发了许多遗传工具，并且其完整基因组已被完全测序(bolotin,winckeretal.2001,genomeres,11,731-753)。因此，这种食品级革兰氏阳性菌代表了生产和递送治疗性蛋白质到粘膜免疫系统的良好候选者。在过去十年中，已经广泛研究了活重组乳球菌将这种蛋白质递送到粘膜免疫系统的潜力(steidler,robinsonetal.1998,infectimmun,66,3183-3189；bermudez-humaran,cortes-perezetal.2004,jmedmicrobiol,53,427-433；hanniffy,wiedermannetal.2004,advapplmicrobiol,56,1-64；wellsandmercenier2008,natrevmicrobiol,6,349-362；bermudez-humaran,kharratetal.2011,microbcellfact,10suppl1,s4)。与传统的全身注射相比，这种方法提供了几个优点，例如给药方便以及能够同时引发全身和粘膜免疫反应((mielcarek,alonsoetal.2001,advdrugdelivrev,51,55-69；erikssonandholmgren2002,curropinimmunol,14,666-672)。
关于分泌生物活性分子的乳酸乳球菌的用途的初步研究是使用鼠白细胞介素-2(il-2，一种促炎细胞因子)进行的(steidler,robinsonetal.1998,同上)。这一前沿工作中获得的令人鼓舞的数据启发了研究人员进一步研究，是否可以通过与模式抗原破伤风毒素片段c(ttfc)共表达(并分泌)muil-2或muil-6(另一种促炎细胞因子)，来增强粘膜和全身反应(steidler，robinson等，1998，同上)。与用表达ttfc的乳酸乳球菌菌株免疫的小鼠相比，在用表达ttfc的乳酸乳球菌菌株和表达muil-2或muil-6的乳酸乳球菌共免疫的小鼠中，抗ttfc血清反应峰值提高了10-15倍。这是首次证明了可使用lab将生物活性细胞因子输送到粘膜。此后，本实验室报道了一种能在粘膜表面(例如气道或消化道粘膜)上原位递送生物活性muil-12的乳酸乳球菌菌株(ll-muil12)。il-12是一种强力多效细胞因子，其诱导t辅助细胞1(th1)和干扰素-γ(ifn-γ)的产生、促进细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的成熟、增强自然杀伤(nk)细胞的活性、并且在与疫苗抗原共同递送时具有佐剂性质。具体来说，我们在3种模型中成功地使用了ll-muil-12：(1)作为针对人乳头瘤病毒16型(hpv-16)的粘膜疫苗接种的佐剂(bermudz-humaran，langellaetal.2003，infectimmun，71,1887-1896；bermudez-humaran，cortes-perez等人2004，同上；adel-patient，ah-leungetal.2005，cinexpallergy，35,539-546)，(2)在卵白蛋白(ova)诱导的哮喘模型中调节th1/th2平衡(wu，yang等2006，intimmunopharmacol6,610-615)，以及(3)防止对牛奶过敏原β-乳球蛋白(blg)的过敏反应(adel-patient，ah-leung等人，2005，同上；cortes-perez，ah-leung等人，2007，clinvaccineimmunol14,226-233)。
然而，仍然有强烈的需要研发可作为抗炎剂的新的lab。
技术实现要素：
本发明涉及一种使用例如应激诱导受控系统(sice)的表达系统来表达白细胞介素25(il-25)或胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)的重组乳酸乳球菌。本文公开的重组乳酸乳球菌能够有效地表达和分泌所述两种细胞因子的生物活性形式。发明人发现，表达il-25(ll-il-25)或tslp(ll-tslp)的重组乳酸乳球菌能够减轻炎症。
因此，本发明涉及一种重组乳酸乳球菌，其中所述细菌包含表达盒，所述表达盒含有异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列编码选自胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)或白细胞介素-25(il-25)的细胞因子。所述异源核苷酸序列可在乳酸乳球菌的groesl操纵子的启动子的控制下表达。优选地，所述表达盒还包含编码胞外寻址肽的核苷酸序列，特别是乳酸乳球菌的exp4蛋白的肽信号。更优选地，所述tslp或il-25是人类的。
本发明还涉及用作益生菌或抗炎剂的本文公开的重组乳酸乳球菌。
此外，本发明涉及包含本文公开的重组乳酸乳球菌的药物组合物、兽药组合物或益生菌组合物。在一个实施例中，所述组合物包含能够分泌tlsp的重组乳酸乳球菌和/或能够分泌il-25的重组乳酸乳球菌。可选地，所述组合物还可包含其他活性成分，例如诸如抗炎或免疫调节药物的药物。
本发明涉及包含本文公开的重组乳酸乳球菌或其组合的的食物组合物，优选为乳制品。
最后，本发明涉及本文公开的重组乳酸乳球菌或其组合，其用于预防或治疗炎性病症。本发明还涉及本文公开的重组乳酸乳球菌或其组合在制备用于治疗炎性病症的药物中的用途。本发明涉及治疗有需要的个体中的炎性病症的方法，其包括施用治疗有效量的本文公开的重组乳酸乳球菌或其组合。优选地，所述炎性病症是肠炎性病症，例如选自以下组之一：炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、慢性结肠炎、转移性结肠炎、憩室炎、坏死性小肠结肠炎、以及肠易激综合征。优选地，所述重组乳酸乳球菌用于口服给药。在一个优选实施例中，所述重组乳酸乳球菌用于在炎症的早期阶段施用。优选地，所述重组乳酸乳球菌用于在少于一周的时间内，每天施用一次或两次。
附图说明
图1：乳酸乳球菌野生型(nz9000)、乳酸乳球菌pnis-il-25、乳酸乳球菌pnis-il25-his、乳酸乳球菌pnis-tslp以及乳酸乳球菌pnis-tslp-his在补充有0.5％葡萄糖和10μg/ml氯霉素的m17培养基中的细菌生长曲线，上述菌株均含有质粒。
图2：干酪乳杆菌pnis-空白、干酪乳杆菌pnis-il-25以及干酪乳杆菌pnis-tslp在补充有10μg/ml氯霉素的mrs培养基中的细菌生长曲线。
图3：乳酸乳球菌pnis-空白在补充有0.5％葡萄糖、10μg/ml氯霉素和0、0.1、1、5或10ng/ml乳酸链球菌素的m17培养基中的细菌生长曲线。
图4：乳酸乳球菌pnis-il-25在补充有0.5％葡萄糖、10μg/ml氯霉素和0、0.1、1、5或10ng/ml乳酸链球菌素的m17培养基中的细菌生长曲线。
图5：乳酸乳球菌pnis-il-25-his在补充有0.5％葡萄糖、10μg/ml氯霉素和0、0.1、1、5或10ng/ml乳酸链球菌素的m17培养基中的细菌生长曲线。
图6：乳酸乳球菌pnis-tslp在补充有0.5％葡萄糖、10μg/ml氯霉素和0、0.1、1、5或10ng/ml乳酸链球菌素的m17培养基中的细菌生长曲线。
图7：乳酸乳球菌pnis-tslp-his在补充有0.5％葡萄糖、10μg/ml氯霉素和0、0.1、1、5或10ng/ml乳酸链球菌素的m17培养基中的细菌生长曲线。
图8：干酪乳杆菌pnis-空白在补充有10μg/ml氯霉素和0、1、10、15、20或25ng/ml乳酸链球菌素的mrs培养基中的细菌生长曲线。
图9：干酪乳杆菌pnis-il-25在补充有10μg/ml氯霉素和0、1、10、15、20或25ng/ml乳酸链球菌素的mrs培养基中的细菌生长曲线。
图10：干酪乳杆菌pnis-tslp在补充有10μg/ml氯霉素和0、1、10、15、20或25ng/ml乳酸链球菌素的mrs培养基中的细菌生长曲线。
图11：乳酸乳球菌野生型(mg1363)、乳酸乳球菌pgroel-il-25、pgroel-il25-his、pgroel-tslp和pgroel-tslp-his在补充有0.5％葡萄糖和10μg/ml氯霉素的m17培养基中的细菌生长曲线。
图12：乳酸乳球菌pgroel-nuc和乳酸乳球菌pgroel-il-25在补充有0.5％葡萄糖、10μg/ml氯霉素和有或没有2.5％nacl的m17培养基中的细菌生长曲线。
图13：乳酸乳球菌pgroel-il-25在补充有0.5％葡萄糖、10μg/ml氯霉素和0、1、1.5、2、2.5、3或3.5％nacl的m17培养基中的细菌生长曲线。
图14：乳酸乳球菌pgroel-nuc和乳酸乳球菌pgroel-tslp在补充有0.5％葡萄糖、10μg/ml氯霉素和有或没有2.5％nacl的m17培养基中的细菌生长曲线。
图15：乳酸乳球菌pgroel-tslp在补充有0.5％葡萄糖、10μg/ml氯霉素和0、1、1.5、2、2.5、3或3.5％nacl的m17培养基中的细菌生长曲线。
图16：乳酸乳球菌pgroel-nuc、乳酸乳球菌pgroel-il-25和乳酸乳球菌pgroel-il-25-his在补充有0.5％葡萄糖、10μg/ml氯霉素的m17培养基中在30℃、37℃或40℃下的细菌生长曲线。
图17：乳酸乳球菌pgroel-nuc和乳酸乳球菌pgroel-tslp在补充有0.5％葡萄糖、10μg/ml氯霉素的m17培养基中在30℃、37℃、40℃或43℃下的细菌生长曲线。
图18：乳酸乳球菌pgroel-nuc和乳酸乳球菌pgroel-tslp在补充有0.5％葡萄糖、10μg/ml氯霉素的ph7或ph5.2的m17培养基中的细菌生长曲线。
图19：乳酸乳球菌pnis-il-25和乳酸乳球菌pnis-nuc菌株的乳酸链球菌素诱导(0、1或10ng/ml)培养物的上清液部分中il-25的elisa检测。
图20：乳酸乳球菌pnis-il-25-his和乳酸乳球菌pnis-nuc菌株的乳酸链球菌素诱导(0、1或10ng/ml)培养物的细菌细胞裂解物(c)或上清液部分(s)样本中il-25-his的western印迹检测。
图21：乳酸乳球菌pnis-tslp和乳酸乳球菌pnis-nuc菌株的乳酸链球菌素诱导(0、1或10ng/ml)培养物的上清液部分中tslp的elisa检测。
图22：干酪乳杆菌pnis-il-25和干酪乳杆菌pnis-nuc菌株的乳酸链球菌素诱导(0、1或10ng/ml)培养物的上清液部分中il-25的elisa检测。
图23：干酪乳杆菌pnis-tslp和干酪乳杆菌pnis-nuc菌株的乳酸链球菌素诱导(0、1或10ng/ml)培养物的上清液部分中tslp的elisa检测。
图24：乳酸乳球菌pnis-il-25和乳酸乳球菌pnis-nuc培养物的上清液部分中il-25的elisa检测。
图25：乳酸乳球菌pnis-tslp和乳酸乳球菌pnis-nuc培养物的上清液部分中tslp的elisa检测。
图26：乳酸乳球菌pnis-il-25的nacl应激(2.5％)诱导培养物的上清液部分中il-25的elisa(ebioscience)检测。
图27：乳酸乳球菌pgroel-il-25菌株的nacl诱导(0、1、1.5、2、2.5、3或3.5％)培养物的上清液部分中il-25的elisa检测。
图28：乳酸乳球菌pgroel-il-25以及nacl诱导(0、1、1.5、2、2.5、3或3.5％)后的上清液部分中il-25的elisa检测。
图29：乳酸乳球菌pgroel-tslp菌株的nacl诱导(0、1、1.5、2、2.5、3或3.5％)培养物的上清液部分中tslp的elisa检测。
图30：乳酸乳球菌pgroel-il-25和乳酸乳球菌pgroel-il-25-his的热休克诱导(30℃、37℃、40℃或43℃)培养物的上清液部分中il-25的elisa检测。
图31：乳酸乳球菌pgroel-tslp的热休克诱导(30℃、37℃或40℃)培养物的上清液部分中tslp的elisa检测。
图32：干酪乳杆菌pdnak-il-25和干酪乳杆菌pdnak-nuc培养物的上清液部分中tslp的elisa检测。
图33：用商购il-25(0、1、2.5、5、10或20ng/ml)、来自乳酸乳球菌pgroel-il-25的浓缩上清液的il-25(10ng/ml)、或来自乳酸乳球菌pgroel-nuc的浓缩上清液的当量蛋白质(阴性对照)刺激的脾细胞上清液中il-5的elisa检测。
图34：用商购il-25(0、1、2.5、5、10或20ng/ml)、来自乳酸乳球菌pgroel-il-25的浓缩上清液的il-25(10ng/ml)、或来自乳酸乳球菌pgroel-nuc的浓缩上清液的当量蛋白质(阴性对照)刺激的脾细胞上清液中il-13的elisa检测。
图35：用商购tslp(0、5、10、50或100ng/ml)、来自乳酸乳球菌pgroel-tslp的浓缩上清液的tslp(5或10ng/ml)、或来自乳酸乳球菌pgroel-nuc的浓缩上清液的当量蛋白质(阴性对照)刺激的lps-刺激-bmdc上清液中il-12的elisa检测。
图36：口服ll-tslp诱导tgf-β分泌。小鼠连续五天口服ll-tslp或ll-wt，然后处死。在来自mln的抗cd3和抗cd-28活化细胞的上清液中测量tgf-β(a)、il-25(b)、ifn-γ(c)和il-17(d)的浓度。
图37：口服ll-tslp对小鼠急性dss诱发炎症的效果。小鼠在dss治疗前5天口服ll-wt或ll-tslp，直到研究结束。整个dss治疗期间监测体重变化(a)和疾病活动指数(b)。(c)结肠段的组织学评分，(e)结肠洗涤中的ifn-γ，(f)来自mln的活化细胞的上清液中tgf-β的浓度。
图38：口服ll-tslp在小鼠dss恢复结肠炎模型中的效果。小鼠在dss治疗前5天口服ll-wt或ll-tslp，直到研究结束。dss治疗后，使小鼠恢复5天。在dss诱导的结肠炎阶段以及在接下来的5天的恢复期间监测体重变化(a)和dai(b)。
图39：短期和早期ll-tslp给药在dss诱导的结肠炎期间减少炎症。(a)细菌给药方案的示意图。(b)体重变化。(c)用ll-wt、ll-tslp或ll-tslp1期治疗的小鼠的dai。(d)组织学评分。(e)来自mln的抗cd3和抗cd-28活化细胞的上清液中(e)tgf-β和(f)il-17的浓度。
图40：结肠炎4天后ll-tslp的作用。(a)结肠炎方案的示意图。(b)mln的cd4+种群中cd25+foxp3+的百分比，服用llwt或lltslp的小鼠的(c)体重变化和(d)dai。
具体实施方式
在第一个方面，本发明涉及重组或遗传工程化的乳酸乳球菌，其包含编码选自胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)或白细胞介素-25(il-25)的细胞因子的异源核苷酸序列。
乳酸乳球菌是一种食品级细菌，因此其具有良好的安全性，在美国和欧洲共同体分别被认可为gras(普遍认可为安全)和qps(合格推定安全性)。这种细菌可以安全地用于保健或预防疾病的功能性食品或食品添加剂中。
优选地，所述乳酸乳球菌由选自以下组的细菌制备：乳酸乳球菌乳脂亚种(lactococcuslactissubsp.cremoris)(包括a76、ge214、hp、ibb477、kw2、mg1363、hb60、hb61、hb63、nbrc100676、nz9000、sk11、tifn1、tifn3、tifn5、tifn6、tifn7、dsm14797、cncmi-2807、dn030066(cncmi-1631)、dn030087(cncmi-2807)、cncmi-1631、ncc2287(cncmi-4157)或uc509.9)、乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)(包括1aa59、a12、cncmi-1631、cv56、delphy1、il1403、io-1、dpc3901、ld61、tifn2、tifn4、jcm5805alsocallednbrc100933、jcm7638、k214、kf147、klds4.0325、ncdo2118或yf11)、乳酸乳球菌霍氏亚种(lactococcuslactissubsp.hordniae)(例如nbrc100931)或乳酸乳球菌tructae亚种(lactococcuslactissubsp.tructae)。优选地，所述乳酸乳球菌选自乳酸乳球菌乳脂亚种或乳酸乳球菌乳酸亚种，特别是乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种(lactococcuslactissubsp.lactisbv.diacetylactis)。
在一个具体实施例中，所述乳酸乳球菌由乳酸乳球菌乳脂亚种制备，优选为mg1363(genbanknc_009004)。
本发明的重组或遗传工程化乳酸乳球菌能够表达和分泌选自tslp或il-25的细胞因子。因此，所述细菌包含表达盒，所述表达盒含有编码所述细胞因子的核苷酸序列。所述核苷酸序列表达所述细胞因子可在乳酸乳球菌的groesl操纵子的启动子的控制下进行。这种表达系统已在wo2013/175358中详细公开，其公开内容通过引用并入本文。具体来说，所述启动子序列可选自seqidnos1-4中的任一个所公开的序列，优选为seqidno1，或者与所述序列中的任一个具有至少90％、95％或99％的一致性。
“编码细胞因子的异源核苷酸序列”的意思是，所述核苷酸序列不是乳酸乳球菌中天然存在的序列，以及/或者所述序列并非天然地与乳酸乳球菌的groesl操纵子的启动子可操作地连接。
在第一个方面，所述细胞因子是tslp(homologene：81957)。优选地，所述细胞因子是以下参考数据库中公开的人tslp：hgnc：30743；entrezgene：85480；uniprotkb：q969d9；np_149024；nm_033035。人tslp的氨基酸序列示于seqidno5中。可选地，所述编码tslp可以是缺乏其信号肽的tslp。例如，在人tslp中，信号肽位于seqidno5的位置1-29。因此，所述编码tslp可以是从seqidno5的第30位开始直至其末端的氨基酸序列。为了在细菌中表达，所述信号肽可被甲硫氨酸替代。或者，如果用于兽医用途，则使用待治疗的动物的tslp序列。可选地，tslp可包括具有某些修饰的tslp变体，例如1-10个氨基酸的取代、缺失或添加，或者例如截短。wo2002/00724中公开了变体的例子。
在第二个方面，所述细胞因子是il-25(homologene：15429)。优选地，所述细胞因子是以下参考数据库中公开的人il-25：hgnc：13765；entrezgene：64806；uniprotkb：q9h293；np_073626；nm_022789。人il-25的氨基酸序列示于seqidno6中。可选地，所述编码il-25可以是缺乏其信号肽的il-25。例如，在人il-25中，信号肽位于1-32位。因此，事实编码il-25可以是从seqidno6的第33位开始直至其末端的氨基酸序列。另外，所述编码il-25可以是亚型2，其中残基1-18被my取代(如seqidno7所示)。为了在细菌中表达，所述信号肽可被甲硫氨酸取代。或者，如果用于兽医用途，则使用待治疗的动物的il-25序列。可选地，il-25可以包括具有某些修饰的il-25变体，例如1-10个氨基酸的取代、缺失或添加，或者例如截短。
编码细胞因子的核苷酸序列可以使用任何合适的遗传密码，并且可以是天然存在的编码序列。或者，编码序列可以针对乳酸乳球菌进行优化。
此外，所述表达盒优选地还包含编码胞外寻址肽的核苷酸序列。例如，所述胞外寻址肽可以是乳酸乳球菌的exp4蛋白的信号肽，特别是如seqidno8所公开的。编码胞外寻址肽的核苷酸序列与编码细胞因子的序列可操作地连接，从而产生包括胞外寻址肽和细胞因子的蛋白质融合物。可选地，所述胞外寻址肽可以替代所述细胞因子的信号肽，或者可以被加入到所述细胞因子中。
编码细胞因子的表达盒可以整合到乳酸乳球菌的染色体中，或者可以保持游离形式(即在质粒中)。
可选地，所述重组乳酸乳球菌可以包含两个表达盒，一个用于表达tslp，另一个用于表达il-25，或者包含同时表达这两种细胞因子的表达盒。
通过将上述表达盒引入乳酸乳球菌(特别是上述乳酸乳球菌中的一种)中，可获得所述重组乳酸乳球菌。
在一个具体实施例中，所述重组乳酸乳球菌是于2015年4月14日在cncm(法国国立微生物保藏中心collectionnationaledeculturedemiroorganismes)，25ruedudocteurroux，75724paris，cedex15以编号cncmi-4971(il-25)和i-4972(tslp)保藏的两个菌株之一。此外，可以通过用所述细胞因子的人序列取代这些菌株之一中的鼠序列来制备所述重组乳酸乳球菌。
本发明还涉及上述重组乳酸乳球菌作为益生菌的用途。因此，所述重组乳酸乳球菌可用于在健康个体中预防炎症，特别是肠道炎症。本发明涉及一种食物组合物，其包含产生tslp的重组乳酸乳球菌、产生il-25的重组乳酸乳球菌、同时产生tslp和il-25的重组乳酸乳球菌、或者产生tslp的重组乳酸乳球菌和产生il-25的重组乳酸乳球菌的组合。
或者，本发明的重组乳酸乳球菌可以用作药物，特别是作为抗炎剂。
本发明涉及药物或兽药组合物。根据本发明的组合物可包含产生tslp的重组乳酸乳球菌、产生il-25的重组乳酸乳球菌、同时产生tslp和il-25的重组乳酸乳球菌、或者产生tslp的重组乳酸乳球菌和产生il-25的重组乳酸乳球菌的组合。优选地，所述组合物包含有效量的细菌，特别是治疗有效量的细菌。具体来说，治疗有效量是指使得炎症状态被预防或治愈、炎症的进展被减慢或阻断、和/或炎性症状得到缓解的量。例如，所述组合物含有至少1×106个菌落形成单位(cfu)的细菌，优选至少1×107cfu，更优选至少1×108cfu，例如1×108cfu至1×1011cfu。
可选地，所述组合物还可包含其他活性成分。所述其他活性成分可以是另一种细菌。所述其他活性成分也可以是药物，例如抗炎剂、免疫调节剂等。更具体地和非穷尽地，所述其他药物可选自：皮质类固醇、柳氮磺胺吡啶、柳氮磺吡啶衍生物、免疫抑制药物、环孢菌素a、巯嘌呤、硫唑嘌呤、抗生素、细胞因子或细胞因子拮抗剂(例如肿瘤坏死因子-α拮抗剂、il-10、il-27或il-35)。
本发明涉及用于预防或治疗炎性疾病的根据本发明的重组乳酸乳球菌或上述药物组合物。所述炎性疾病可选自以下组：急性炎症(例如败血症)、烧伤、和慢性炎症。所述炎性疾病可以是肠道(例如包括腹腔疾病、憩室炎和阑尾炎)、胃、肝脏、胰腺或腹膜、或胃肠道或消化系统的其他组织的炎性病症。所述其他病症可包括口腔、食道、胰腺、胰管、肝、胆囊、十二指肠、胆管、小肠(回肠)、大肠(结肠)、盲肠、阑尾或直肠的炎性病症。可通过本发明的方法、组合物和试剂盒治疗的影响胃肠系统的具体疾病可包括例如：憩室炎(diverticulitis，一种通常在大肠中发现的常见的消化系统疾病，其源自憩室病(diverticulosis)，涉及在结肠外侧形成发炎袋(憩室))、腹腔疾病(一种小肠自免疫疾病，发生在婴儿中期之后的所有年龄的遗传易感人群中，由针对麸质蛋白的自身免疫反应引起)、阑尾炎(一种以阑尾发炎为特征的疾病)、胃肠炎(胃肠道的炎症，包括胃和小肠，可导致急性腹泻，最常见的原因是某些病毒的感染，较不常见的原因是细菌、其毒素、寄生虫、或对饮食或药物中某些物质的不良反应)、胰腺炎(由于各种原因引起的胰腺慢性或急性炎症)、或消化性溃疡病。
在一个优选实施例中，所述炎性疾病选自：炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、慢性结肠炎、转移性结肠炎、囊泡炎；坏死性小肠结肠炎；肠易激综合征；皮肤炎症，例如紫外线或化学引起的皮肤炎症、湿疹、反应性皮肤；眼睛炎症；过敏、哮喘；肥胖相关炎症；年龄相关的低度炎症；及其组合。所述炎性疾病也可以是炎性肺病、炎性关节疾病和炎性泌尿生殖系疾病的炎性症状。炎性肺病包括囊性纤维化、哮喘和copd(慢性阻塞性肺病)。
本文所用的术语“疗法”或“治疗”包括任何方法、作用、应用等，其中个体(或患者)(包括人)被提供或施用药剂或组合物(或表达本发明的药剂的重组生物)，目的是直接或间接地改善所述个体的状况、或减缓所述个体的疾病或病症的进展、或改善治疗中的疾病或病症的至少一种症状。
本发明的组合物可以是任何种类的组合物。所述组合物可以通过例如口服、肠内、阴道内、直肠内、外用或经眼部给药。例如，其可以是药物组合物、营养保健品、食品添加剂、美容组合物、宠物食品、食品或饮料。
根据本发明的组合物优选地用于口服给药。例如，组合物可以是悬浮液、片剂、丸剂、胶囊或粉剂的形式。可选地，其可以是饮料的形式，例如，乳制品或非乳制品饮料。
或者，根据本发明的组合物用于直肠给药。直肠给药可以栓剂、灌肠剂或泡沫剂的形式进行。
待治疗的个体优选为哺乳动物，特别是人。其可以是婴儿、儿童、成人或老年人。
本发明的组合物可以每天施用一次、两次、三次或四次。优选地，每天施用一次或两次，更优选一次。此外，可以每天、每两天、或每三天施用一次，或者每周施用一次或两次。治疗期可以为短期或长期。短期是指不超过一周，例如3、4、5或6天。长期是指多于一周的时间，例如2、3或4周。在一个优选实施例中，所述组合物在少于一周的时间内每天施用一次或两次。所述组合物可以在几个时间段内施用，优选在两个治疗周期之间有休息期。
所述组合物可以作为预防性治疗施用，即在炎症发生之前施用。或者，其可以在炎症的早期阶段施用，例如在出现第一症状时施用。此外，其也可以在炎症的急性期中施用。最后，其可以在炎症后的恢复阶段施用。其也可以在上述阶段的组合期间施用。在一个优选实施例中，其可以在炎症的早期阶段每天施用一次或两次，持续少于一周。
上述公开内容总体上描述了本发明。通过参考以下具体实施例可获得更完整的理解，这些具体实施例仅是为了说明的目的而提供，而并不限制本发明的范围。
实施例
概述
il-25和tslp是两种主要由上皮细胞分泌的涉及th2辅助反应的细胞因子。为了测试这两种细胞因子在化学诱导的鼠结肠炎模型中的效果，构建了几种重组乳酸菌(lab)。
发明人使用两种不同的表达系统(乳酸链球菌素诱导可控系统(nice)和应激诱导可控系统(sice))构建了表达白细胞介素25(il-25)或胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)的乳酸乳球菌和干酪乳杆菌(两种熟知的lab菌株)的不同重组菌株。此外，还构建了表达这两种细胞因子的his-标签形式的重组lab菌株。
在确认重组lab的正常生长之后，发明人通过蛋白质印迹和elisa测试了两种不同的表达系统在相应的应激下产生和分泌il-25和tslp的情况。结果表明，重组lab能够使用所述两种表达系统(即nice和sice)表达上述两种细胞因子，但在测试条件下nice系统未观察到分泌。对sice系统而言，则仅在重组乳酸乳球菌中观察到良好的分泌。此外，结果显示，在盐水或热休克应激后，这些菌株的细胞因子分泌增加。此外，由重组乳酸乳球菌分泌的这些细胞因子具有生物活性。
然后，发明人评估了表达il-25和/或tslp的重组lab菌株在体内的免疫调节和预防作用。发明人选择了两种具有较高的细胞因子分泌水平的以sice表达系统表达il-25或tslp的重组乳酸乳球菌。
发明人的实验室测试了不同的化学诱导鼠结肠炎模型，以确定所述菌株的预防和免疫调节作用。首先，发明人证明了ll-tslp能够减轻肠道炎症，从而保护小鼠免受dss诱发的急性结肠炎。每日强制服用ll-tslp在结肠炎开始时延迟临床症状(粪便软化和出血)。更重要的是，由于组织学分数的降低，ll-tslp保护肠上皮免受化学治疗引起的损伤。此外，由重组乳酸乳球菌分泌的tslp能够减少促炎细胞因子(ifn-γ)的产生，并减少促炎th17反应，显示分泌的tslp可调节炎症。
发明人还测试了dss诱导结肠炎并随后进行5天的恢复的模型。在该模型中，发明人观察到在ll-tslp处理之后，结肠组织中的几种炎症标志物有所减少，例如mpo活性降低(反映粒细胞募集减少)、结肠壁增厚减小、促炎细胞因子il-12减少。此外，结果表明ll-tslp能够减少dss引起的促炎th17反应，并增强重要的炎症调节途径：treg反应。这些结果似乎表明ll-tslp具有抗炎作用。
另一方面，发明人证实，分泌il-25的乳酸乳球菌能够在dss诱导的急性结肠炎中驱动th2应答，但是该反应不足以保护小鼠免受炎症。同时，发明人使用了dnbs诱导的急性结肠炎，其已知会引起th1炎症。发明人观察到了il-25的保护作用：小鼠死亡率降低、体重减轻降低、以及结肠组织增厚减小，这表明分泌il-25的乳酸乳球菌对肠道炎症的缓解有重要作用。
实施例1
表达muil-25和mutslp的重组lab的构建
胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)和il-25是由上皮细胞产生的两种细胞因子。这两种细胞因子都引发th2型免疫反应，包括由嗜碱性粒细胞和th2细胞分泌il-4和il-13(两种抗炎细胞因子)。
发明人预计，通过激活抗炎il-4和il-13细胞因子的产生并抑制促炎il-12的产生，重组lab在粘膜水平递送tslp和/或il-25可将免疫反应调节为具有抗炎免疫特征。在构建和表征表达il-25或tslp的重组lab后，该假说已被证实。
发明人成功构建了表达il-25或tslp细胞因子的16种重组乳酸乳球菌和干酪乳杆菌菌株。使用了两种诱导表达系统(乳酸链球菌素诱导可控系统：nice，以及应激诱导可控系统：sice(benbouziane，ribelles等，jbiotechnol，168,120-129)来实现il-25和tslp的表达，并产生了每种蛋白质的两种不同形式：天然和his标签形式。在确认重组lab(即乳酸乳球菌和干酪乳杆菌bl23)的正常生长之后，发明人通过蛋白质印迹和elisa测试了两种不同的表达系统在相应的诱导(对nice系统来说是乳酸链球菌素，对sice系统来说是应激)下产生和分泌il-25和tslp的情况。结果显示，重组lab能够使用所述两个表达系统表达所述两种细胞因子，但在测试条件下，nice系统未观察到细胞因子分泌。而对sice系统而言，仅在重组乳酸乳球菌中观察到良好的分泌。
材料和方法
细菌菌株及生长条件
本发明中使用的细菌菌株和质粒列于表1中。乳酸乳球菌菌株在30℃下不加搅拌地在补充有1％葡萄糖的m17培养基(difco)中生长。干酪乳杆菌菌株在37℃下不加搅拌地在mrs培养基(difco)中生长。大肠杆菌菌株在37℃和180rpm下在luria-bertani(difco)中生长。通过添加以下抗生素来选择质粒(浓度为毫克每毫升)：乳酸乳球菌：氯霉素(10)；大肠杆菌：氨苄青霉素(100)及氯霉素(10)。
获取了两种不同的细菌生长曲线。
·分泌细胞因子的lab菌株的过夜培养物稀释至600nm处的光密度(od600nm)＝0.1。然后诱导应激，并将100μl的每种细菌培养物接种到无菌96孔板中。将这些板在微孔板光谱仪(tecan)中在30℃(乳酸乳球菌)或37℃(干酪乳杆菌)下孵育20小时。每隔15分钟，轨道振荡15秒并测量od600nm。
·在应激诱导分泌测定期间，在不同时间点测量不同细菌菌株的od600nm(参见材料和方法部分：应激诱导的lab细胞因子分泌)。
重组lab菌株的构建
质粒dna分离和dna操作的一般程序遵循使用的商购试剂盒(qiagen，promega)的使用步骤。
nice系统
·乳酸乳球菌pnis-细胞因子
含有鼠il-25、his标记的鼠il-25(c末端带有6个his残基)、鼠tslp或his标记的鼠tslp(c末端带有6个his残基)的质粒由geneart(invitrogen)合成。这些质粒含有氨苄青霉素抗性基因。在spei和nsii消化后，将含有目的基因(小鼠il-25、il-25-his、tslp或tslp-his)的片段整合到spei/nsii消化的pnis质粒中。在2.4kv、200ω、25μf下电穿孔到乳酸乳球菌nz9000菌株中以建立构建体。然后在30℃下在含有1％葡萄糖和氯霉素(10μg/ml)的m17琼脂上选择转化体。从重组转化体中提取质粒，通过消化和测序验证，并命名为pnis-il-25、pnis-il-25-his、pnis-tslp和pnis-tslp-his。
·干酪乳杆菌pnis-细胞因子
从乳酸乳球菌中提取pnis-il-25、pnis-il-25-his、pnis-tslp和pnis-tslp-his质粒，并在1.5kv、400ω、25μf下电穿孔到干酪乳杆菌中。在37℃下在含有氯霉素(10μg/ml)的mrs琼脂上选择转化体。从重组转化体中提取质粒，并通过消化和测序验证。
sice系统
·乳酸乳球菌pgroel-细胞因子
用bamhi和spei消化pnis-il-25、pnis-il-25-his、pnis-tslp和pnis-tslp-his。消化后，将含有目的基因(小鼠il-25、il-25-his、tslp或tslp-his)的片段整合到bamhi/spei消化的pgroel质粒中。在1.5kv、400ω、25μf下电穿孔到干酪乳杆菌bl23中以建立构建体。在37℃下在含有氯霉素(10μg/ml)的mrs琼脂上选择转化体。从转化体中提取质粒，通过消化和测序验证，并命名为pgroel-il-25、pgroel-il-25-his、pgroel-tslp和pgroel-tslp-his。
·干酪乳杆菌pdnak-细胞因子
用bglii和nsii消化pma-pdnak-spp40质粒(由geneart，invitrogen合成)。消化后，含有来自dnak基因的启动子和p40蛋白的肽信号(干酪乳杆菌bl23中良好分泌的蛋白质)的片段被整合到bglii/nsii消化的pnis-il-25、pnis-il-25-his、pnis-tslp、pnis-tslp-his或pnis-nuc质粒中。在2,400v、200ω、25μf下电穿孔到乳酸乳球菌mg1363中以建立构建体。在30℃下在含有1％葡萄糖和氯霉素(10μg/ml)的m17琼脂上选择转化体。从转化体中提取质粒，通过消化和测序验证，并命名为pdnak-il-25、pdnak-il-25-his、pdnak-tslp、pdnak-tslp-his和pdnak-nuc。
乳酸链球菌素诱导lab分泌细胞因子
·乳酸乳球菌pnis-细胞因子
将分泌细胞因子的乳酸乳球菌菌株的过夜培养物在补充有1％葡萄糖和10μg/ml氯霉素的m17培养基中稀释至0.1od600nm，并在30℃下不搅拌孵育直至0.4-0.6od600nm。然后添加不同浓度的乳酸链球菌素(sigma)：0、1和10ng/ml，并在30℃下不搅拌孵育。在不同时间(t30min、t5h和t24h)，收集1ml细菌培养物，并在4℃和10000rpm离心10分钟。将2μm过滤上清液保存在-20℃，以通过elisa进行细胞因子定量。
·干酪乳杆菌pnis-细胞因子
所使用的方案与乳酸乳球菌使用的方案相同，但使用干酪乳杆菌的特定生长条件。
应激诱导lab分泌细胞因子
将分泌细胞因子的乳酸乳球菌菌株的过夜培养物在补充有1％葡萄糖和10μg/ml氯霉素的m17培养基中稀释至0.1od600nm，并在30℃下不搅拌孵育直至0.4-0.6od600nm。以如下方式施加不同应激。
·盐应激
将不同体积的nacl5m溶液加入到培养物中以获得0、1、1.5、2、2.5、3和3.5％nacl终浓度(对应于t0)，并在30℃下不搅拌孵育。在不同时间(t30min、t4h或t5h及t24h)，收集1ml细菌培养物，并在4℃和10000rpm离心10分钟。将2μm过滤上清液保存在-20℃，以通过elisa进行细胞因子定量。
·热休克
将细菌培养物在室温和4700rpm离心15分钟。将沉淀物在30℃、37℃、40℃或43℃(对应于t0)的预热培养基中重新悬浮，并在上述不同温度下不搅拌孵育。在不同时间(t30min、t4h和t24h)，收集1ml细菌培养物，并在4℃和10000rpm离心10分钟。将2μm过滤上清液保存在-20℃，以通过elisa进行细胞因子定量。
·酸性ph应激
将细菌培养物在室温和4700rpm离心15分钟。将沉淀物在ph7或ph5.4(对应于t0)的培养基中重新悬浮，并在上述不同ph以及30℃下不搅拌孵育。在不同时间(t30min、t4h和t24h)，收集1ml细菌培养物，并在4℃和10000rpm离心10分钟。将2μm过滤上清液保存在-20℃，以通过elisa进行细胞因子定量。
蛋白质印迹分析
为了量化il-25-his，从2ml诱导或非诱导培养物制备蛋白质样品。离心(10分钟、10000rpm和4℃)后，分别处理细胞沉淀物和上清液。上清液在4℃下用200μl的100％三氯乙酸(sigma)处理2小时，以沉淀蛋白质。在4℃下以13000rpm离心20分钟后，将所述蛋白质从沉淀物中回收。通过5个循环的10秒超音波进行细胞破碎以获得细胞组分。使用含有相同数量的细菌的样品进行蛋白质印迹，以his标记的蛋白作为阳性对照，并使用兔抗his-tag(sigma)和山羊抗兔(p.a.r.i.s.anticorps)。
细胞因子的浓缩
从88毫升乳酸乳球菌pgroel-tslp过夜培养物和80毫升乳酸乳球菌pgroel-il-25过夜培养物进行细胞因子的浓缩，两者均用2.5％nacl诱导，并使用centriconplus-70离心过滤器(10000nmwl)。通过elisa定量浓缩溶液：il-25的浓度为1.58μg/ml(使用ebiosciences试剂盒)或22μg/ml(使用r&d系统试剂盒)，tslp的浓度为0.4485μg/ml。对于每种浓度，使用含有编码非相关蛋白质核酸酶nuc的质粒的乳酸乳球菌菌株(乳酸乳球菌pgroel-nuc)制备细菌培养基的阴性对照。
骨髓源性树突状细胞的分离及培养
无菌收集来自balb/c小鼠的骨髓细胞，并将其接种在载补充有10％去补体fbs、青霉素/链霉素、β-巯基乙醇5mm和20ng/mlgm-csf(peprotech)的rpmi1640(lifetechnologies)的培养皿中。在第3天加入15ml培养基，在第5天完全更换培养基；在第7天收集细胞。然后以5×105个细胞/孔(96孔/板)的密度接种骨髓树突状细胞(bmdc)，并在37℃下在10％co2加湿培养箱中在补充有10％去补体胎牛血清(fbs)和青霉素/链霉素的rpmi1640中培养。
tslp活性测试：lps刺激bmdc测定
用lps(未刺激或5ng/ml)和不同浓度的浓缩rtslp刺激bmdc。以0、5、10、50和100ng/ml(biolegend)的浓度添加商购tslp，以5和10ng/ml的浓度添加浓缩rtslp。使用培养基的阴性对照(乳酸乳球菌pgroel-nuc的过滤上清液)，并加入与浓缩rtslp的浓度相对应的当量的蛋白质。在刺激后的24小时，收集细胞上清液，以通过elisa进行il-12定量。
脾细胞的分离及培养
从balb/c小鼠中无菌取出脾脏，并在rpmi1640(lifetechnologies)中研磨以产生单细胞悬浮液。用红细胞裂解缓冲液(sigma)裂解红细胞。在37℃下在10％co2加湿培养箱中在补充有10％去补体fbs和青霉素/链霉素的rpmi1640中培养脾细胞。
il-25活性测试：脾细胞测定
用商购il-25(未刺激、1、2.5、5、10及20ng/ml)和10ng/ml的浓缩ril-25刺激脾细胞。使用培养基的阴性对照(乳酸乳球菌pgroel-nuc的过滤上清液)，并加入与浓缩ril-25的浓度相对应的当量的蛋白质。在刺激后的72小时，收集细胞上清液，以通过elisa进行il-5或il-13定量。
细胞因子(il-25、tslp、il-5、il-13和il-12)的检测
使用不同eliza试剂盒来定量细胞因子：il-12(mabtech)，il-13(ebiosciences)，il-5(mabtech)，tslp(ebiosciences)以及il-25(ebiosciences和r&d系统)。
统计分析
结果表示为3-6个样品的平均值+/-sd。进行学生t检验，以确定感兴趣条件和条件a、b或c(如图所示)之间的统计学显著性(*、**和***分别表示p<0.05、p<0.01和p<0.001)。
结果
增长曲线
1)nice系统–正常条件
乳酸乳球菌pnis-细胞因子
质粒pnis也称为psec(bermúdez-humarán等，femsmicrobiol，224,307-3013)，是广谱质粒pwv01(kok，vandervossen等，1984，applenvironmicrobiol，48,726-731)的衍生物，其含有乳酸链球菌素诱导型启动子和usp45蛋白的信号肽(主要乳酸乳球菌分泌蛋白)(deruyter，kuipers等，1996，applenvironmicrobiol，62,3662-3667)。该质粒含有repa和repc复制起点，从而可以在革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌中复制。
构建pnis-细胞因子质粒并在乳酸乳球菌中转化。在测序验证后，菌株表征的第一步是确定细菌在标准实验室富集培养基m17中的生长。在96孔板上获取含有质粒的菌株在补充有1％葡萄糖和10ng/ml氯霉素的m17中的细菌生长曲线(图1)。野生型乳酸乳球菌nz9000无质粒菌株用作阴性对照。重组菌株细菌生长的轻微延迟可能是由于培养基中存在氯霉素抗生素。携带编码il-25、il-25-his、tslp或tslp-his的pnis质粒的乳酸乳球菌菌株的生长未见受损。
干酪乳杆菌pnis-细胞因子
构建pnis-细胞因子质粒并在干酪乳杆菌中转化。使用96孔板测定这些菌株在补充有10ng/ml氯霉素的mrs中的细菌生长(图2)。由于存在pnis质粒，干酪乳杆菌pnis-空白在补充有氯霉素的复合培养基中的生长与其他菌株类似，因此选择干酪乳杆菌pnis-空白作为参照菌株。携带编码il-25或tslp的pnis质粒的干酪乳杆菌的细菌生长未见受损。
2)nice系统–应激条件
乳酸乳球菌pnis-细胞因子
由于pnis质粒中的基因表达由乳酸链球菌素作为诱导剂控制，因此发明人分析了在此细菌素存在下的细菌生长。在乳酸链球菌素存在下(至少在测试浓度下)pnis-空白菌株的细菌生长未见受损(图3)。因此，发明人得出结论，乳酸链球菌素对本发明中的重组菌株没有毒性。但是，1ng/ml或更高浓度的乳酸链球菌素使乳酸乳球菌pnis-il25和pnis-il25-his菌株的细菌生长短暂延迟(图4和图5)。当将乳酸链球菌素加入到乳酸乳球菌pnis-tslp和pnis-tslp-his的培养物中时，这种生长受损要严重得多(图6和图7)。结果显示，0.1ng/ml的乳酸链球菌素的存在对细菌生长没有影响，细菌生长与不含乳酸链球菌素时类似。当乳酸链球菌素的浓度为5ng/ml时观察到较严重的生长延迟。乳酸链球菌素的浓度为10ng/ml时的细菌生长曲线与5ng/ml时非常相似。当加入1ng/ml乳酸链球菌素时，可获得中间生长表型。向培养基中添加乳酸链球菌素减缓了细菌生长。这种减缓可能是由于所产生的重组细胞因子的毒性，这种现象在其他重组菌株中经常有所报道。
干酪乳杆菌pnis-细胞因子
发明人在乳酸链球菌素存在下对干酪乳杆菌pnis-细胞因子菌株进行了相同的实验。结果显示，在测试浓度的乳酸链球菌素存在下，pnis-空白菌株的细菌生长受损(图8)，表明乳酸链球菌素对干酪乳杆菌的生长有害。此外，1ng/ml以上的乳酸链球菌素对干酪乳杆菌pnis-il25和干酪乳杆菌pnis-tslp菌株的延迟作用显著增强(图9和图10)。
3)sice系统–正常条件
pgroel质粒(wo2013/175358)是广谱质粒pwv01(kok，vandervossen等人，1984，同上)的衍生物，其含有来自groel蛋白的启动子，groel蛋白是一种在应激条件下、以及最重要的是在小鼠的胃肠道中诱导的乳酸乳球菌mg1363蛋白，所述应激条件例如酸性ph、高温和胆汁盐(kilstrup，jacobsen等1997，applenvironmicrobiol，63,1826-1837；roy，meyrand等，2008，proteomics8,1661-1676)。其还含有exp4蛋白的肽信号(exp4蛋白是一种在乳酸乳球菌中良好分泌的蛋白质(poquet，ehrlich等人，1998，jbacteriol，180,1994-1912))以及repa和repc复制起点，因此可以在革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌中复制。由于groel启动子的特异性，该质粒仅在乳酸乳球菌中起作用。
构建pgroel-细胞因子质粒并在乳酸乳球菌中转化。与pnis-细胞因子质粒一样，在测序验证后，发明人进一步测定了细菌生长。在96孔板上获取含有质粒的菌株在补充有1％葡萄糖和10ng/ml氯霉素的m17中的细菌生长曲线(图11)。野生型乳酸乳球菌mg1363无质粒菌株用作阴性对照。重组菌株细菌生长的轻微延迟可能是由于培养基中存在氯霉素抗生素。携带编码il-25、il-25-his、tslp或tslp-his的pgroel质粒的乳酸乳球菌菌株的生长未见受损。
4)sice系统–应激条件
由于pgroel-细胞因子质粒中的基因表达受应激条件控制，发明人接着分析了应激存在时的细菌生长。进行应激测定的目的是分析细胞因子的产生和分泌以及细菌生长。
盐应激
乳酸乳球菌pgroel-nuc、乳酸乳球菌pgroel-il-25和乳酸乳球菌pgroel-tslp具有相似的生长曲线，并且同样地在2.5％nacl存在下显示细菌生长受损(图12和图14)。nacl的浓度在1％以上时可观察到这种生长延迟，并且nacl浓度越高，细菌生长受损越严重(图13和图15)。
热休克
乳酸乳球菌pgroel-il-25、乳酸乳球菌pgroel-il-25-his、乳酸乳球菌pgroel-tslp和乳酸乳球菌pgroel-nuc菌株在不同温度条件下具有相似的生长曲线(图16和图17)。在30℃、37℃和40℃下，这些菌株有相同的指数期，但在37℃下，菌株的固定期达到较高的od600nm值。在43℃下，乳酸乳球菌pgroel-il-25、乳酸乳球菌pgroel-il-25-his和乳酸乳球菌pgroel-nuc的生长受损情况相同(图16)。
酸性ph应激
在酸性ph下，乳酸乳球菌pgroel-nuc和乳酸乳球菌pgroel-tslp具有相似的生长曲线，并且细菌生长受损情况相同(图18)。
使用nice系统的细胞因子分泌
发明人使用不同的乳酸链球菌素浓度进行了几次测试，以测定重组lab产生和分泌细胞因子的情况。在乳酸链球菌素诱导后30min、5h和24h收集样品(上清液部分：s，细菌裂解物：c)，通过elisa测定s和c样品中的细胞因子浓度。
c样品中未显著检测到il-25或tslp细胞因子的产生。elisa检测失败可能是由于在细菌细胞(即c样品)中的非分泌蛋白形式中存在信号肽，导致细胞因子的构象形式不同。因此，发明人将其实验集中在s样品上。但也进行了一些蛋白质印迹实验，以测定重组乳酸乳球菌产生il-25-his的情况。
·乳酸乳球菌分泌il-25：如图19所示，在不同的测试时间点和不同的乳酸链球菌素浓度下，乳酸乳球菌pnis-il-25和乳酸乳球菌pnis-nuc菌株的诱导培养物的s样品中的il-25水平均没有显著差异。因此，发明人可以得出结论，乳酸乳球菌pnis-il-25在这些条件下不分泌il-25。
·乳酸乳球菌产生il-25-his：发明人接着通过蛋白质印迹分析了乳酸乳球菌pnis-il-25-his产生和分泌il-25-his的情况。如图20所示，在来自乳酸乳球菌pnis-il-25-his菌株的诱导培养物的c样品中检测到了il-25-his，但在s样品中未检测到il-25-his。用3种不同剂量的乳酸链球菌素(即1、5和10ng/ml)诱导后，在c样品中检测到相似量的il-25-his。在没有乳酸链球菌素的情况下，未检测到il-25-his信号，证实该系统受到严格的调节。总之，elisa和蛋白质印迹实验证实，重组乳酸乳球菌不分泌il-25。这种现象在以前的乳酸乳球菌产生的其他异源蛋白质中也曾经观察到过，可能是由于il-25-his重组细胞因子的前体形式的加工和分泌较弱。
·乳酸乳球菌分泌tslp：在没有乳酸链球菌素时，乳酸乳球菌pnis-tslp培养物的s样品中未显著检测到tslp的产生，因为观察到的信号与来自非诱导或乳酸链球菌素(10ng/ml)诱导的阴性对照菌株：乳酸乳球菌pnis-nuc的s样品相同(图21)。引人注目的是，乳酸乳球菌pnis-tslp诱导培养物的s样品清楚显示了tslp的产生和分泌(图21)。用乳酸链球菌素孵育1小时的结果显示，两种测试剂量(1和10ng/ml)的乳酸链球菌素诱导的tslp分泌之间没有显著差异。但时间过程实验表明，当乳酸链球菌素的浓度为1ng/ml时，tslp在培养基中累积约5小时，达到约1000pg/ml的最大浓度。
·干酪乳杆菌分泌细胞因子：在不同的测试时间点和不同的乳酸链球菌素浓度下，乳酸链球菌素诱导的干酪乳杆菌pnis-il-25、干酪乳杆菌pnis-tslp和干酪乳杆菌pnis-nuc培养物的s样品中检测到的il-25(图22)或tslp(图23)的水平均没有显著差异。在这些条件下，重组干酪乳杆菌不分泌il-25和tslp细胞因子。
使用sice系统的细胞因子分泌
发明人使用不同的应激(例如盐应激、热休克和酸性ph)进行了几次测试，以测定使用sice系统的重组lab产生和分泌细胞因子的情况。在应激诱导之后的30min、4h、5h和24h收集s和c样品，并通过elisa测定s和c样品中细胞因子的浓度。
与nice系统相同，在c样品中未显著检测到il-25或tslp细胞因子的产生，因此发明人仅提供通过elisa分析s样品的实验结果。
·阴性对照：乳酸乳球菌pgroel-nuc：与乳酸乳球菌pnis-il-25(图24)或乳酸乳球菌pnis-tslp(图25)菌株的s样品相比，在乳酸乳球菌pnis-nuc菌株的s样品中观察到信号很弱，证明没有由于乳球菌蛋白质引起的背景。
·盐应激-乳酸乳球菌分泌il-25：乳酸乳球菌pgroel-il-25分泌细胞因子，表明启动子能够发挥功能(图26)。此外，在存在2.5％nacl时，检测到的il-25的水平显著增加：在30min时增加3倍，在4h时增加7倍，在24h时增加12倍。该应激导致乳酸乳球菌pgroel-il-25分泌的il-25显著增加。但是，发明人在使用购自ebioscience的elisa试剂盒时遇到了一些问题，因此测试了购自r&dsystems的另一种elisa试剂盒。使用r&d系统和ebioscience的elisa测定相同样品的浓度有20倍(或以上)的差异。以下结果使用r&d系统试剂盒测定。检测到的il-25的水平与以前的结果有相同的趋势：分泌/细菌随时间减少，但浓度值增加20-30倍(图27和图26)。发明人观察到，在30min时，除了2.5％之外，在nacl存在下il-25的分泌显著增强。在4h、24h以及3％30min时，样品稀释度不足。测得的数值高于标准，因此被低估。但从逻辑上来说，这些值高于图中所示的值，表明盐应激后乳酸乳球菌pgroel-il-25的il-25分泌增加。再一次，发明人没有充分地稀释样品(图28)。但仍可见，盐应激导致乳酸乳球菌pgroel-il-25-his的il-25-his分泌显著增加(2/4倍)。
·盐应激-乳酸乳球菌分泌tslp：乳酸乳球菌pgroel-tslp能够分泌tslp，表明其启动子的开放(图29)。当存在nacl时，通过elisa检测到的tslp水平与未刺激的乳酸乳球菌pgroel-tslp的分泌相比，有微弱的增加(1.5倍)。
·热休克-乳酸乳球菌分泌il-25和il-25-his：发明人接着测试了热休克诱导的分泌。首先，在30℃下，在30min和4h时，检测到的il-25和il-25-his的量相同，显示乳酸乳球菌分泌il-25和il-25-his的情况相似(图30)。发明人还观察到，在37℃和43℃下热休克后30min的分泌增加。但热休克后4h未观察到这种增加。
·热休克-乳酸乳球菌分泌tslp：发明人接着测试了热休克后tslp的分泌。结果显示，在37℃和40℃热休克后30min和4h，tslp的分泌略有增加(图31)。
·热休克-干酪乳杆菌分泌il-25：质粒pdnak是广谱质粒pwv01(kok，vandervossen等，1984，同上)的衍生物，其含有来自dnak的启动子，dnak是一种干酪乳杆菌bl23蛋白，其由诸如酸性ph和胆汁盐的应激条件诱导。该质粒还含有p40蛋白(干酪乳杆菌分泌的一种蛋白)的肽信号，以及repa和repc复制起点，因此可以在革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌中复制。由于dnak启动子的特异性，该质粒仅在干酪乳杆菌中起作用。发明人在干酪乳杆菌pdnak-nuc(阴性对照)的上清液中检测到了大量的il-25。由于该实验的高背景，无法测定il-25的分泌，表明这种细胞因子在干酪乳杆菌的sice系统中的产生或分泌是有问题的。接着，发明人证实，在盐(1％nacl)或热休克(37和42℃)应激之后，这些菌株中细胞因子的产生和分泌有所增加。引人注目的是，结果显示，由重组乳酸乳球菌产生和分泌的细胞因子具有生物活性。
细胞因子活性测试
下一个并且是最重要的步骤是，通过验证乳酸乳球菌分泌的细胞因子的生物活性来验证重组菌株。
·il-25活性测试：rickel等报道过，脾细胞受il-25刺激时会分泌il-5和il-13(rickel，siegel等，2008，jimmunol，181,4299-4310)。基于该报道，发明人用商购il-25或重组浓缩il-25来刺激脾细胞。刺激后72小时，回收细胞上清液，测定这些样品中il-5和il-13的浓度。如图33和34所示，如预期的那样，与未刺激条件相比，在用乳酸乳球菌pgroel-nuc(阴性对照)的浓缩上清液刺激的细胞中没有观察到il-5和il-13的显著分泌。但发明人检测到，用商购il-25刺激后il-5和il-13的分泌增加，并且该增加是剂量依赖性的(图33和34)。结果还显示，用本发明的重组il-25刺激后il-5和il-13的分泌增加，表明重组乳酸乳球菌产生的il-25具有生物活性。
·tslp活性测试：taylor等报道过，在tslp刺激后，lps-刺激的bmdc的il-12分泌减少(taylor，zaph等，2009，jexpmed，206,655-667)。基于这些结果，发明人使用商购tslp和本发明的由乳酸乳球菌生产的重组浓缩tslp对lps刺激的bmdcs进行了测定。在刺激后24小时，回收细胞上清液，测定样品中il-12的浓度。发明人观察到，与未刺激条件相比，用乳酸乳球菌pgroel-nuc(阴性对照)的浓缩上清液刺激的细胞显著分泌il-12(图35)。发明人还检测到，用商购tslp刺激后il-12的分泌减少，并且这种减少是剂量依赖性的。结果显示，本发明的重组tslp显著降低了il-12的分泌，证明了tslp的生物活性。因此，验证了乳酸乳球菌pgroel-tslp菌株的有效性。
乳酸乳球菌分泌的这些细胞因子具有生物活性。乳酸乳球菌分泌的il-25能够刺激脾细胞。实际上，在用本发明的重组il-25或“商购”il-25刺激后72小时，脾细胞分泌il-5和il-13。此外，乳酸乳球菌分泌的tslp诱导了lps刺激的bmdcs的il-12分泌减少，表明本发明的重组tslp具有生物活性，因为其能够与bmdc相互作用。基于这些实验，发明人验证了上述重组菌株的有效性。
这些有前景的结果代表了朝着表达il-25和tslp的重组乳酸乳球菌菌株的免疫调节和预防作用的体内评估前进了一步。
在两种化学诱导的结肠炎小鼠模型中评估表达muil-25和mutslp的重组乳酸乳球菌的免疫调节和预防性能
发明人的实验室目前使用不同的化学诱导的结肠炎小鼠模型(例如tnbs、dnbs、dss、il-10ko等)来确定候选细菌或分子的有益效果。发明人决定使用由硫酸葡聚糖钠(dss)或二硝基苯磺酸(dnbs)化学诱导的两种结肠炎小鼠模型。
实际上，dss诱导以血性腹泻、溃疡和粒细胞浸润为特征的结肠炎。已知该分子直接影响肠上皮细胞的基底隐窝，因此影响粘膜屏障的完整性。dss结肠炎模型特别有助于研究和鉴定结肠炎先天免疫机制的贡献。相比之下，dnbs诱导的结肠炎模型用于破译t辅助细胞依赖性粘膜免疫应答。dnbs在乙醇中制备(乙醇干扰粘膜屏障)，而dnbs会使结肠自体或微生物蛋白半抗原化，使其对宿主免疫系统具有免疫原性，导致炎症。
这两种模型是由不同途径驱动的，因此有助于破译本发明的重组菌株的作用机制。
实施例2：表达tslp的重组乳酸乳球菌菌株的免疫调节和预防性能的体内评估。
概述
为了了解tslp在炎性过程中的作用，发明人构建了产生tslp的乳酸乳球菌菌株(ll-tslp)，并研究了其对小鼠结肠炎模型的施用效果。用ll-tslp治疗增加了健康小鼠t细胞分泌的tgf-β的量。在急性结肠炎中，ll-tslp延缓了疾病活动指数，降低了组织学评分和inf-γ的产生。在dss恢复模型中，只有在结肠炎开始时施用ll-tslp菌株才能产生保护作用。在结肠炎的第4天，观察到了ll-tslp诱导的treg。tslp在结肠炎中显示出抗炎保护作用。发明人已经证明，ll-tslp的短期和早期施用比长期治疗更有效。因此，ll-tslp的口服治疗可能是缓解ibd症状的有希望的策略。
材料和方法
小鼠实验
在驯化至少7天后，在整个实验中，每天用pbs或109～5×109菌落形成单位的ll-wt或ll-tslp喂养6周龄的c57bl/6小鼠。在d0时，通过连续4天(dss短期)或7天(dss急性及dss恢复)将2.5％(w/v)的分子量为36,000-50,000的硫酸葡聚糖钠(dss)(mpbio)加入到饮用水中来诱导结肠炎。在dss诱导后，于d4(dss短期)、d7(dss急性)或d12(dss恢复)处死小鼠。在dss恢复中，dss诱导结肠炎之后用正常饮用水恢复5天。以喂食12天且未经dss诱导的小鼠作为对照。每天监测小鼠的体重减轻、粪便一致性和粪便潜血(hemoccult，beckmancoulter)。根据cooper等1993年制定的方案计算疾病活动指数(dai)(labinvestig，69,238-249)。通过颈椎脱位处死小鼠，并收集肠系膜淋巴结(mln)以及结肠。
诱导淋巴细胞产生白介素
将从小鼠分离的mln捣碎并过滤(70μm，bdbiosciences)。通过流式细胞术(accuric6)计数滤液中的淋巴细胞，并以25×106细胞/ml重悬于具有100个单位链霉素青霉素(paa实验室)和10％胎牛血清(fcs)(lonza)的培养基(rpmi，lonza)中。将细胞溶液加入到24孔板(costar)中，所述24孔板用含有0.5％fcs的pbs中的抗cd3和抗cd28抗体(每种抗体4μg/ml)(ebioscience)预孵育4小时。将板在37℃及5％的co2下孵育48小时，并通过elisa(mabtech)评估细胞因子水平。
组织学评估
为进行组织学评估，将炎症最严重的的区域中的结肠样品固定在4％多聚甲醛酸(sigma)中，并用石蜡包埋。四微米切片用苏木精/伊红染色，并根据ameho标准进行盲检。
调节性t细胞(treg)计数
从捣碎的mln滤液中取出106个细胞。使用小鼠调节性t细胞染色试剂盒1(ebioscience)对treg细胞上的cd4、cd32和foxp3染色。细胞样品流经流式细胞仪(bdaccuri)，对cd4阳性细胞中的cd32和foxp3双阳性细胞计数。
统计
所有统计数据和图表在prism-
结果
口服ll-tslp诱导健康小鼠肠系膜淋巴结中的活化细胞分泌tgf-β
为了评估tslp肠粘膜给药对小鼠的基础作用，两组(n＝8)健康动物通过口服途径接受ll-wt或ll-tslp。每日监测体重及进行dai评分。发明人未观察到这些评分上的差异，显示小鼠未发生生理学变化(数据未显示)。治疗14天后，取出肠系膜淋巴结(mln)，用抗cd3和抗cd-28抗体活化细胞。发明人检测到，与口服ll-wt的小鼠相比，接受ll-tslp的小鼠显著地分泌较多的tgf-β(p<0.05)(图36-a)。未观察到细胞上清液中il-5、ifn-γ或il-17的浓度有显著变化(图36-b、c和d)。il-10也未见差异(数据未显示)。在肠腔内通过重组乳酸乳球菌递送tslp能够引发tgf-β分泌。
ll-tslp缓解急性炎症
为了确定局部给药对肠道炎症的效果，发明人首先在急性dss诱导结肠炎小鼠模型上进行了实验，在诱导结肠炎前7天及诱导结肠炎期间口服ll-tslp或ll-wt。两组小鼠的体重减轻未见差异(图37-a)。口服ll-tslp显著降低了d4的dai，表明分泌tslp的乳酸乳球菌延迟了结肠炎的临床症状(图37-b)，特别是粪便软化和出血。炎症7天后，取出结肠组织，分析几个炎症标志物。tslp降低了组织学分数(图37-c和d)，表明口服ll-tslp具有肠上皮保护作用。口服ll-tslp还降低了结肠洗液中促炎细胞因子ifn-γ的浓度(图37-e)。结肠洗液中促炎il-12和抗炎il-10浓度未见差异(数据未显示)。mln的活化细胞的上清液中的tgf-β有所增加但不显著(p＝0.053)。在上述两种条件下，mln的活化细胞的上清液中的ifn-γ、il-5、il-17或il-22的浓度未见差异(数据未显示)。
tslp在炎症开始时降低dai，但对恢复期无效
为了测试tslp在愈合过程中的作用，进行了急性炎症实验并随后进行5天的饮用水的恢复期。两组小鼠在结肠炎前7天、炎症期间以及恢复期施用ll-wt或ll-tslp。口服tslp给药未改变两组小鼠之间的重量损失(约为20％)(图38-a)，但与上述结果一致，ll-tslp显著降低了炎症早期(d4)的dai(p<0.01)(图38-b)，表明tslp对晚期炎症和恢复期没有作用。
在炎症早期递送tslp降低体重减轻和dai
为了验证tslp对结肠炎早期的作用，发明人进行了急性炎症实验并随后进入恢复期，对两组小鼠分别施用ll-wt和ll-tslp，第三组小鼠(命名为ll-tslp1期)从d-7到d4口服ll-tslp，然后从d5到d12口服ll-wt(图39-a)。与上述结果一致，ll-tslp和ll-wt条件下的体重减轻差异不显著。接受早期tslp递送的小鼠的体重减轻降低，与ll-wt条件相比，在d11和d12有显著差异(分别为p<0.01和p<0.001)(图39-b)。此外，ll-tslp1期组的dai的增加有所减少，与ll-wt的dai相比，在d5和d7的差异显著(p<0.05)(图39-c)。与ll-wt组相比，ll-tslp1期组的组织学分数显著降低，但ll-tslp组未见显著差异(图39-d)。在d12，活化mln细胞，但三组的细胞上清液中的tgf-β分泌未见任何差异(图39-e)。但与ll-wt或ll-tslp1期相比，施用ll-tslp的il-17分泌显著降低(p<0.01)(图39-f)。这些结果表明，在炎症早期递送tslp可减轻/改善某些结肠炎症状。
tslp在结肠炎早期诱导treg增殖
为了了解tslp对结肠炎早期的作用，发明人分析了结肠炎第4天和第12天mln中treg的比例。在第4天，与对照ll-wt相比，喂食ll-tslp的小鼠中的cd4+种群中cd25+foxp3treg的百分比显著较高(图40-a)。该差异与施用ll-tslp和ll-wt的小鼠在d4时的dai分数之间的差异一致(数据未显示)。在第12天，三组的cd4+种群中cd25+foxp3treg的百分比之间未见差异(图40-b)。
讨论
在本研究中，使用重组乳酸乳球菌菌株ll-tslp研究了肠粘膜施用tslp治疗结肠炎的效果。为了进一步了解tslp对炎症的潜在保护作用，发明人研发了一种通过口服施用产生可溶性功能性tslp的乳酸菌(lab)，将tslp递送至肠粘膜水平的策略。发明人构建并表征了产生tslp的乳酸乳球菌菌株ll-tslp。健康小鼠口服ll-tslp两周后，来自肠系膜淋巴结的抗cd3/抗cd28刺激的细胞产生的tgf-β有所增加。在急性dss诱导炎症模型中，dss7天后，用ll-tslp治疗的小鼠的dai在炎症发作的7天内趋于降低，尽管体重减轻没有变化。d4的分数显著降低，表明ll-tslp在结肠炎开始时能够延迟临床症状，特别是粪便软化和出血。此外，通过组织学评分测量的结肠组织完整性在tslp治疗的小鼠中较少受损。口服ll-tslp减少促炎细胞因子ifn-γ的分泌，表明lab分泌的tslp保护肠上皮免受化学治疗诱导的损伤并调节炎症。
为了评估ll-tslp在恢复期的作用，发明人进行了急性结肠炎模型实验并随后进行5天的恢复。在整个实验过程中(炎症+恢复期)通过ll-tslp递送tslp。在饮用水5天后，体重减轻和组织学分数未见差异，但证实了在炎症早期(d4)dai降低。恢复期是一个复杂的过程，添加tslp似乎不足以加速炎症标志物的减少或肠上皮的修复。
接着，发明人推测早期施用ll-tslp足以减少炎症标记物。一组小鼠从诱导结肠炎之前七天至诱导之后四天接受ll-tslp，然后施用ll-wt直到实验结束。与ll-wt相比，在肠腔内早期递送tslp(到d4为止)降低了体重减轻，并显著增加了d11和d12的体重增加。此外，dai延迟并降低(d5和d7尤为显著)，并且组织学分数降低。因此，发明人得出结论，短期和早期的tslp治疗比长期治疗能更好地防止结肠炎，体现在疾病的严重性减轻以及延迟。
为了破译在炎症早期添加tslp导致结肠保护的机制，发明人在d4处死了小鼠。结果显示，在这个时间点，用ll-tslp治疗的小鼠中cd4+cd25+foxp3+细胞的百分比较高，这表明treg细胞在延缓疾病的发生中起作用。在人体中，tslp成熟的dc能够诱导cd4+cd25+foxp3+细胞的扩增和分化。
发明人推测，向肠腔添加tslp使得treg细胞数量增加，导致肠道稳态增加，并导致疾病的延迟。tslp的释放可直接或间接作用于treg的分化。事实上，tslp能够通过增加几种紧密连接蛋白和闭合蛋白来增强肺上皮细胞的紧密连接。以这种方式，tslp可以保护肠上皮的完整性，并促进上皮细胞释放视黄酸和tgf-β以及促进treg的扩增。
最后，在克罗恩病患者的结肠组织中tslp表达减少，并且与这些患者的肠道无法促进耐受性dc相关。肠上皮细胞的tslp分泌依赖于共生和益生菌并由其调节。克罗恩病的一种新型疗法是粪便移植。将来可望发展出能够恢复tslp表达的粪便移植，或者使用能够增加上皮细胞的tslp分泌的益生菌的完整实际疗法，以促进肠内平衡并延长缓解期。
实施例3：表达il-25的重组乳酸乳球菌菌株的免疫调节和预防作用的体内评估。
为了测试ll-il-25菌株在为ll-tslp菌株建立的不同小鼠模型以及另一个模型：dnbs模型中的效果，发明人同步进行了相同的实验(参见实施例2的材料和方法部分)。
在急性dss诱导结肠炎中，ll-il-25也能够在结肠炎开始时延迟发炎小鼠的临床症状。发明人观察到ll-il-25强烈诱导th2应答。如同本项目开始时所预测的，发明人推测，th2反应可能会减少小鼠中th1或th17诱导的结肠炎。但结果显示，分泌th2诱导细胞因子(il-25)的乳酸乳球菌菌株能够驱动这种反应，但不足以保护小鼠免受炎症。
dss模型经常用于表征先天免疫反应。因此，发明人决定测试另一种炎症模型：dnbs诱导的结肠炎，其已知会引起th1炎症。通过直肠注射dnbs在小鼠中诱导炎症。由于炎症太严重，数只小鼠死亡。喂食il-25分泌株的组中未见死亡，这表明与喂食ll-wt的组相比，ll-il-25具有保护作用。此外，强制喂食ll-il-25降低了d1的体重减轻，并减小了结肠组织增厚，表明ll-il-25在炎症的减缓中具有重要作用。
总之，这些初步结果显示了良好的前景。
表1：本研究中使用的细菌菌株和质粒
序列表
<110>阿雷斯贸易股份有限公司
<120>产生tslp或il-25的乳酸乳球菌及其作为益生菌和治疗剂的用途
<130>p15/052
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