本申请要求2015年10月7日提交的美国临时申请第62/238,531号的优先权，将其全部内容并入以供参考。
资助信息
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)和国立神经疾病与中风研究所(National Institute of Neurological Disorders and Stroke)授予的基金号为NS052671的政府资助下进行的。政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本发明涉及使用人神经肌肉接头的体外模型来鉴定神经肌肉和/或肌肉活动的调节剂的方法。
背景技术：
神经肌肉疾病是由于运动神经元或肌肉细胞损失、运动神经元或肌肉细胞功能减少或中枢(CNS)或外周(PNS)神经系统运动通路的退行性改变而导致运动神经元和/或肌肉功能受损的疾病。这种疾病与其它神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病不同，后者是由运动神经元以外的神经元的破坏引起的。通常，神经肌肉疾病是发育性或进行性退行性疾病。症状可以包括吞咽困难、四肢无力、言语不清、步态受损、面神经无力和肌肉痉挛。呼吸可能在这些疾病的后期受到影响，往往会导致死亡。大多数神经肌肉疾病的原因尚不清楚，但环境、毒性、病毒或遗传因素都是可疑的。
脊髓运动神经元和骨骼肌之间的联系是控制自主运动的人类锥体运动系统的关键最终通路(Barker等，1985)。它在许多创伤性、退行性和炎症性疾病中受到严重影响，传统上认为这主要影响神经元(Kuwabara和Yuki，2013；Sendtner，2014；Silva等，2014；Titulaer等，2011)、或神经肌肉接头的肌肉侧(Mercuri和Muntoni，2013；Plomp等，2015)。很明显，肌肉去神经支配和再神经支配显著改变肌肉生理学(Cisterna等，2014；Daube和Rubin，2009)。反之亦然，越来越多的证据表明，肌肉依赖性营养、细胞粘附和轴突导向信号在神经肌肉接头的形成和维持中发挥重要作用。生理活动比如运动或病理状态比如肌萎缩侧索硬化(ALS)和其它神经肌肉疾病极大地影响神经肌肉接头的强度和功能(Moloney等，2014)。与动物模型相似，研究神经肌肉发育和疾病的人类系统应该包括神经肌肉接头的主要部件，包括脊髓运动神经元和骨骼肌，并且可对功能测试和操作进行修正。
多能干细胞(PSC)-衍生的神经元在再生医学和疾病建模中的应用理论上需要它们整合到复杂的功能性人类网络或组织中。对于几种CNS细胞类型，这种需求已经通过开发更多一体化组织工程化方法来解决，其中将多能细胞用于生成人体器官的微型三维模型版本(Lancaster和Knoblich，2014)。然而，神经元的最重要的特性之一，即它们形成功能性突触并将信息传递给合适的下游靶标的能力，在人的类器官和其它基于PSC的模型系统中大部分仍未探索。
尽管在从人PSC产生脊髓运动神经元的方面取得了进展(Amoroso等，2013；Calder等，2015；Chan等，2007；Davis-Dusenbery等，2014；Maury等，2015；Patani等，2011)，它们在功能上连接并控制人骨骼肌功能的能力尚未评估。因此，存在对于由多能干细胞制备的神经肌肉接头的体外人类模型的需要，其可用于评估神经元连接性以及调节化合物对这种连接性的影响。
技术实现要素：
本发明涉及通过培养人运动神经元和人肌肉细胞制备的培养的人神经肌肉接头(NMJ)，例如其中所述运动神经元和任选地所述肌肉细胞是体外分化的产物。
在某些非限制性实施方式中，本发明涉及人神经肌肉接头(NMJ)的体外模型，其中模型通过将人运动神经元与人肌肉细胞(例如肌细胞)或肌肉组织共培养来制备。
在某些非限制性实施方式中，人运动神经元是人多能干细胞(PSC)-衍生的神经元。在某些非限制性实施方式中，人肌肉细胞是人成肌细胞-衍生的骨骼肌细胞。在某些非限制性实施方式中，人肌肉细胞是PSC-衍生的肌肉细胞。
在某些实施方式中，人PSC-衍生的脊髓运动神经元通过使人PSC与有效量的至少一种Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)抑制剂、至少一种腹面发育(ventralization)因子和至少一种尾端化(caudalization)因子接触而分化。
在某些非限制性实施方式中，至少一种SMAD抑制剂是转化生长因子β(TGFβ)/激活素-Nodal信号传导抑制剂、骨形态生成蛋白(BMP)信号传导抑制剂、或其组合。
在某些非限制性实施方式中，至少一种腹面发育因子包含刺猬因子(hedgehog)通路的激活剂，例如，音猬因子(SHH)，purmorphamine、或其组合。
在某些非限制性实施方式中，至少一种尾端化因子选自视黄酸(RA)、无翅(Wnt)活化因子、及其组合。
在某些非限制性实施方式中，人肌肉细胞从受试者获得。在某些非限制性实施方式中，将肌肉细胞去分化为肌肉细胞前体，例如成肌细胞，并与PSC-衍生的运动神经元一起培养。
在某些非限制性实施方式中，NMJ模型通过将人运动神经元与从受试者获得的人肌肉组织共培养来制备。
在一个非限制性实施方式中，体外模型的运动神经元处于光遗传控制下，其中运动神经元与肌肉细胞或组织的共培养物可以在光刺激下激活以诱导肌肉运动。
在某些非限制性实施方式中，PSC-衍生的运动神经元和/或肌肉细胞或组织由获自患有神经肌肉疾病例如肌萎缩侧索硬化(ALS)、重症肌无力和/或恶病质的受试者的PSC制备。
本发明还涉及通过使用人NMJ的体外模型用于鉴定调节NMJ活动的化合物的方法。在某些非限制性实施方式中，可以通过使用体外NMJ模型鉴定候选化合物作为NMJ激动剂，其中NMJ暴露于有效量的候选化合物增加NMJ活动。
在某些非限制性实施方式中，可以通过使用体外NMJ模型鉴定候选化合物作为NMJ拮抗剂，其中NMJ暴露于有效浓度的候选化合物减少NMJ活动。
在某些非限制性实施方式中，鉴定NMJ活动调节剂的试验测量体外模型中肌肉收缩的振幅和/或频率和/或持续时间作为NMJ激活的测量，其中肌肉收缩的振幅和/或频率和/或持续时间的增加表明NMJ活动的增加，并且肌肉收缩的振幅和/或频率和/或持续时间的减少表明NMJ活动的减少。
在某些非限制性实施方式中，该试验测量NMJ的动作电位。在某些实施方式中，动作电位在运动神经元中测量。在某些实施方式中，动作电位在肌肉中测量。在一个非限制性实施方式中，动作电位的振幅和/或频率和/或持续时间的增加表明NMJ活动的增加，并且动作电位的振幅和/或频率和/或持续时间的减少表明NMJ活动的减少。
在某些非限制性实施方式中，该试验测量NMJ的运动神经元释放的、或存在于NMJ的运动神经元和肌肉组织之间的突触中的神经递质的浓度或水平，其中神经递质的浓度或水平的增加表明NMJ活动的增加，并且神经递质的浓度或水平的减少表明NMJ活动的减少。
在某些非限制性实施方式中，该试验测量NMJ模型中肌肉和/或运动神经元中的钙电流，其中钙电流的振幅和/或频率和/或持续时间的增加表明NMJ活动的增加，并且钙电流的振幅和/或频率和/或持续时间的减少表示NMJ活动的减少。
在某些非限制性实施方式中，本发明提供一种用于鉴定神经肌肉接头活动的激动剂的方法，其包括：(a)在候选化合物存在下刺激本文所述的体外神经肌肉接头的运动神经元，并测定体外神经肌肉接头的活动；(b)在不存在候选化合物的情况下刺激本文所述的体外神经肌肉接头的运动神经元，并测定体外神经肌肉接头的活动；(c)比较(a)和(b)中的活动；和(d)当(a)中的活动水平大于(b)中的活动水平时，选择候选化合物作为激动剂。
在某些非限制性实施方式中，本发明提供一种用于鉴定神经肌肉接头活动的拮抗剂的方法，其包括：(a)在候选化合物存在下刺激本文所述的体外神经肌肉接头的运动神经元，并测定体外神经肌肉接头的活动；(b)在不存在候选化合物的情况下刺激本文所述的体外神经肌肉接头的运动神经元，并测定体外神经肌肉接头的活动；(c)比较(a)和(b)中的活动；和(d)当(a)中的活动水平小于(b)中的活动水平时，选择候选化合物作为拮抗剂。
本发明还涉及通过使用人NMJ的体外模型来鉴定调节NMJ活动的基因的方法。在某些非限制性实施方式中，当NMJ例如健康的野生型NMJ的运动神经元和/或肌肉中表达的一种或多种基因的表达水平减少时，可以测定NMJ的活动。在某些非限制性实施方式中，当NMJ例如健康的野生型NMJ的运动神经元和/或肌肉中表达的一种或多种基因的表达水平增加时，可以测定NMJ的活动。在某些非限制性实施方式中，当NMJ例如健康的野生型NMJ的运动神经元和/或肌肉中非正常表达的一种或多种基因的表达水平在运动神经元或肌肉中表达时，可以测定NMJ的活动。当基因表达水平的增加或减少调节NMJ活动时，可以选择这种基因作为NMJ调节基因。
本发明还提供包含PSC或PSC-衍生的运动神经元和骨骼肌、或其共培养物的试剂盒。在某些实施方式中，PSC或PSC-衍生的神经元是人的。在某些实施方式中，骨骼肌是人成肌细胞-衍生的骨骼肌。在某些实施方式中，骨骼肌是PSC-衍生的肌肉。在某些实施方式中，骨骼肌由受试者获得。
附图说明
图1A-R.hPSC衍生的脊髓运动神经元(MN)中的光遗传控制。(A)显示携带针对OCT4(POU5F1)和DAPI转基因染色的hSyn-ChR2-EYFP的克隆hESC系。(B)显示在第20天(D20)，当在明视场(BF)下检查时，MN簇表达ChR2-EYFP。(C)显示通过沉淀纯化神经元簇后，MN簇富集。(D)显示纯化后，通过QRT-PCR测量，脊髓运动神经元(sMN)标志物上调。(E)显示纯化后，通过QRT-PCR测量，非神经元标志物下调。(F)显示在培养的第30天，脊髓MN表达ChR2-EYFP并使HB9和ISL1染色。(G)显示在培养的第30天，脊髓MN共染色ChAT和SMI32。(H)显示通过替代方案(Maury等，2015)产生表达ChR2-EYFP+MN的MN的MN分化。(I)显示在培养的第30天，(通过替代方案(Maury等，2015)分化的)脊髓MN表达ChR2-EYFP、HB9和ISL1。(J)显示在培养的第60天，(通过替代方案(Maury等，2015)分化的)脊髓MN表达ChR2-EYFP、ChAT和SMI32。(K)显示明视场中的神经元和选择用于电生理学的EYFP通道。(L)显示在培养的第60天(D60+)之外，hESC-衍生的MN响应于去极化电流注射而激发动作电位。(M，N)显示成熟的ChR2+hESC-衍生的MN响应于光遗传刺激而忠实地激发动作电位。(O)显示携带针对OCT4和DAP I转基因染色的hSyn-EYFP的克隆hESC系。(P)显示在培养的第30天，纯化的脊髓hESC-衍生的MN表达EYFP、HB9和ISL1。(Q)显示成熟的EYFP+hESC-衍生的MN响应于电流注射而激发动作电位。(R)显示成熟的EYFP+hESC-衍生的MN对光刺激不响应。比例尺100μM。误差棒代表SEM。
图2A-C.生成功能性人肌纤维。(A)衍生自成人供体(hMA，上图)和胎儿供体(hMF，下图)的人成肌细胞。(B)分化第17天的人肌纤维。(C)第35天的人肌纤维中的钙成像。乙酰胆碱(ACh)诱导强烈的钙瞬变。每条痕迹都类似于不同的纤维。比例尺100μM。
图3A-R.神经肌肉共培养物的表征。(A，E)起始后1周(1W)，脊髓hESC-衍生的MN与成人(hMA)和胎儿(hMF)衍生的肌纤维的共培养物，EYFP和明视场通道。(B，F)起始后6-8周，脊髓hESC-衍生的MN与成人(hMA)和胎儿(hMF)衍生的肌纤维的共培养物。(C，G)响应于光遗传刺激50s(上图)和500s(下图)的共培养物中肌肉抽搐的定量。每条痕迹都类似于不同的纤维。(D，H)维库溴铵(2μM)阻断成人(D)和胎儿(H)肌纤维的光诱发收缩。(I)EYFP和(J)中所示的钙成像实验的明视场照片。(J)响应于光遗传刺激2min(上图)和40min(下图)肌纤维中钙瞬变的比率分析。每条痕迹都类似于不同的纤维。(K)从单一肌纤维记录的尖锐电极。响应于0.2和2Hz的光遗传刺激的维库溴铵敏感的动作电位的产生。(L)神经肌肉连接性的长期稳定性。在第5天、第15天和第25天对单独区域的运动进行定量，并且归一化至第0天的运动。(M)共培养物包含密集的波形蛋白+和GFAP+基质的层。(N)共培养物显示密集的EYFP+轴突和结蛋白+肌纤维的网络。(O)与收缩区的EYFP+神经元过程紧密接触的多核和条纹肌纤维。(P)与EYFP+神经元过程和突触素标记密切相关的成簇乙酰胆碱受体(BTX)的高功率共焦成像。(Q，R)比较收缩区(左)和非收缩区(右)的AChR簇。BTX+点的定量显示在收缩/神经支配区域显著增加。*p<0.05。在C、D、G和H中，一个像素对应于0.5μm。比例尺100μm，除I、K为50μm以及P、Q为25μm外。
图4A-Q.重症肌无力疾病建模。(A，D)在添加重症肌无力(MG)IgG(患者H)和补体(A)或对照IgG和补体(D)之前，脊髓MN与成人肌纤维(hMA)的成熟的、收缩的共培养物的动态图(Kinetogram)。(B，E)在添加重症肌无力(MG)IgG和补体(B)或对照IgG和补体(E)后第3天，与A和D中相同的共培养物。(C，F)在第3天加入吡啶斯的明(PYR，10μM)后，与B和E中相同的共培养物。(G)在第3天用MG IgG(1号和2号患者)和补体或对照IgG和补体处理的培养物中运动的定量作为第0天的％。(H)在第3天加入吡啶斯的明之前和之后，用MG IgG(合并1号和2号患者)和补体处理的培养物中运动的定量。(I)在第3天洗除MG IgG(合并1号和2号患者)和补体后第4天和第6天恢复运动。(J)在用MG IgG(1号患者)、对照IgG处理的培养物和未处理的培养物中运动的定量，全部没有补体。(K，L)在48小时，在选择用于钙成像的区域中，用MG IgG(1号患者)和补体或对照IgG和补体处理的与成人肌肉(hMA)的功能性MN共培养物的明视场和EYFP图像。(M)在MG和对照培养物中以及加入PYR后，响应于光遗传刺激的钙增加的定量。(N)在MG和对照培养物中以及加入PYR后，响应于光遗传刺激的反应性纤维的百分比。(O，P，Q)对于加入MG IgG(1号患者)或对照IgG和补体后24小时的人补体C3c沉积到EYFP和BTX共标记的神经肌肉接头上的免疫细胞化学(O，P)和定量(Q)。带虚线的小方框中的区域在实线方框中放大。比例尺在K、L中为100μm；在O、P中为10μm。在A-F中，一个像素对应于0.5μm。n.s.＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。所有误差棒代表SEM。
具体实施方式
本发明涉及人神经肌肉接头(NMJ)的体外模型的产生，其中NMJ通过将人多能干细胞(PSC)-衍生的脊髓运动神经元与人成肌细胞衍生的骨骼肌、或PSC-衍生的肌肉细胞共培养来制备。在某些实施方式中，神经元处于光遗传控制下，其中神经元的激活可通过用光刺激来实现。如本文所述，体外模型可用于鉴定NMJ活动的调节剂，并由此用于鉴定调节运动神经元和/或肌肉活动的化合物。在某些实施方式中，体外模型由来自患有神经肌肉疾病的受试者的PSC制备，使得可以鉴定可以调节患病状态下NMJ活动的化合物，其中所鉴定的化合物可以在治疗神经肌肉疾病中治疗有效。
为了公开清楚的目的而不是限制，本发明的详细描述分成以下分部：
(i)培养的神经肌肉接头(NMJ)；和
(ii)鉴定NMJ调节剂的方法。
本说明书中使用的术语在本发明的上下文中以及在使用每个术语的具体上下文中通常具有其在本领域中的普通含义。以下或在说明书的其它地方讨论某些术语，以在描述本发明的组合物和方法以及如何制造和使用它们方面向从业者提供额外的指导。
如本文所用，当在权利要求书和/或说明书中与术语“包括”结合使用时，使用词“一”或“一个”可以指“一个”，但是它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。另外，术语“具有”、“包含(including/containing/comprising)”是可互换的，并且本领域技术人员应认识到这些术语是开放式的术语。
如本文所用，术语“约”或“大约”指在如由本领域的普通技术人员测定的特定值的可接受的误差范围内，其将部分取决于如何测量或测定该值，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以指在3或多于3个标准偏差之内。或者，“约”可以指给定值的至多20％，优选至多10％，更优选至多5％，并且还更优选至多1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可以指在数值的数量级内，优选在5倍内，并且更优选在2倍内。
如本文所用，术语“调节”或“修饰”是指运动神经元和/或其上运动神经元形成突触的肌肉的特定活动的量、质量或效果的增加或减少。如本文所用，“调节剂”是指使用体外和/或体内试验鉴定的任何抑制性或激活性化合物，例如激动剂、拮抗剂、变构调节剂及其同系物，包括片段、变体和模拟物。
如本文所用，“抑制剂”或“拮抗剂”是指减少、降低、阻断、防止、延迟激活、失活、脱敏或下调运动神经元和/或其上运动神经元形成突触的肌肉的生物学活动的调节化合物。术语“拮抗剂”包括全部、部分和中性拮抗剂以及反向激动剂。
如本文所用，“诱导剂”、“激活剂”或“激动剂”是指增加、诱导、刺激、激活、促进、增强激活、敏化或上调运动神经元和/或其上运动神经元形成突触的肌肉的生物学活动的调节化合物。术语“激动剂”包括全部和部分激动剂。
本文中的“个体”或“受试者”是脊椎动物，比如人或非人动物，例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、灵长类动物、农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。非人动物受试者的非限制性实例包括啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；兔；狗；猫；绵羊；猪；山羊；牛；马；和非人灵长类动物如猿和猴。
本文使用的术语物质的“有效量”是指足以实现有益或期望结果包括临床结果的量，因此“有效量”取决于其应用的上下文。在施用组合物以调节NMJ活动的上下文中，组合物的有效量是足以增加或减少NMJ活动的量。例如，增加或减少可以是NMJ活动1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％的增加或减少。有效量可以在一次或多次给药中施用。
如本文所用，并且如本领域所公知的，“肌肉”或“肌肉组织”是包含肌细胞的组织，其中肌细胞组织为包含肌丝蛋白的肌细胞纤维(即肌纤维)以形成肌肉组织。
如本文所用，术语“疾病”是指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何病症或疾病。
5.1培养的神经肌肉接头(NMJ)
本发明涉及通过培养人运动神经元和人肌肉细胞制备的培养的人神经肌肉接头(NMJ)，例如其中所述运动神经元和任选的所述肌肉细胞是体外分化的产物。
在某些非限制性实施方式中，本发明提供一种可用于评估推定化合物调节NMJ活动的能力的人神经肌肉接头(NMJ)系统的体外模型。所述模型系统可用于测试本发明化合物对肌肉活动例如收缩性的作用。
在某些非限制性实施方式中，通过将人多能干细胞(PSC)-衍生的脊髓运动神经元与人肌肉细胞(例如肌细胞)或PSC-衍生的的肌肉细胞、或肌肉组织例如人成肌细胞-或PSC-衍生的骨骼肌共培养来制备体外模型。在某些实施方式中，细胞是非人细胞，例如来自非人哺乳动物的PSC和肌肉细胞。
在一个非限制性实施方式中，PSC是胚胎干细胞(ESC)。在某些非限制性实施方式中，PSC是诱导的PSC(iPSC)。PSC分化为脊髓运动神经元可以通过使PSC与以下接触来实现：至少一种SMAD抑制剂，并且在某些非限制性实施方式中，至少两种SMAD抑制剂(例如，如Chambers等，2009所述，将其全部内容并入本文以供参考)，至少一种腹面发育因子，例如刺猬因子通路(HH)的激活剂(例如通过施用音猬因子(SHH)或purmorphamine)，和至少一种尾端化因子，例如视黄酸(RA)和/或无翅(Wnt)激活因子(例如，如Calder等,J Neurosci.2015Aug 19；35(33):11462-81所述，将其全部内容并入本文以供参考)。
在某些非限制性实施方式中，SMAD抑制剂包含转化生长因子β(TGFβ)/激活素-Nodal信号传导的抑制剂。在某些实施方式中，TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂中和了包括TGFβ、骨形态生成蛋白(BMP)、Nodal和激活素的配体，或通过阻断受体和下游效应子来阻断它们的信号通路。TGFβ/激活素-Nodal信号传导抑制剂的非限制性实例公开于WO/2010/096496、WO/2011/149762、WO/2013/067362、WO/2014/176606、WO/2015/077648、和Chambers等,Nat Biotechnol.2009Mar；27(3):275-80；Kriks等,Nature.2011Nov 6；480(7378):547-51；和Chambers等,Nat Biotechnol.2012Jul 1；30(7):715-20(2012)，为了所有目的将其全部内容并入本文以供参考。在某些实施方式中，TGFβ/活化素-Nodal信号传导的一种或多种抑制剂是选自SB431542、其衍生物、及其混合物的小分子。“SB431542”是指CAS号为301836-41-9的分子，分子式为C22H18N4O3，并且名称为4-[4-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲酰胺，例如参见以下结构：
在某些非限制性实施方式中，SMAD抑制剂包含BMP信号传导的抑制剂。SMAD信号传导抑制剂的非限制性实例公开于WO2011/149762，Chambers等,Nat Biotechnol.2009Mar；27(3):275-80；Kriks等,Nature.2011Nov 6；480(7378):547-51；和Chambers等,Nat Biotechnol.2012Jul 1；30(7):715-20，将其全部内容并入本文以供参考。在某些实施方式中，BMP/SMAD信号传导的一种或多种抑制剂是选自LDN193189、其衍生物、及其混合物的小分子。“LDN193189”是指小分子DM-3189，IUPAC名称为4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉，化学式为C25H22N6，具有下式。
LDN193189能够用作SMAD信号传导抑制剂。LDN193189也是ALK2、ALK3、和ALK6、蛋白酪氨酸激酶(PTK)的高效力小分子抑制剂，抑制I型TGFβ受体的ALK1和ALK3家族成员的信号传导，导致抑制多种生物信号的传递，包括骨形态生成蛋白(BMP)BMP2、BMP4、BMP6、BMP7和激活素细胞因子信号、和随后的Smad1、Smad5和Smad8的SMAD磷酸化(Yu等(2008)Nat Med 14:1363-1369；Cuny等(2008)Bioorg.Med.Chem.Lett.18:4388-4392，并入本文以供参考)。
目前公开的分化方法还包括使人干细胞与一种或多种Wnt信号传导激活剂接触。如本文所用，关于配体的术语“WNT”或“无翅”是指能够与WNT受体比如Frizzled和LRPDerailed/RYK受体家族中的受体相互作用的一组分泌性蛋白质(即人中的Int1(integration 1))。如本文所用，关于信号传导通路的术语“WNT”或“无翅”是指由Wnt家族配体和Wnt家族受体组成的信号传导通路，比如Frizzled和LRPDerailed/RYK受体，其用或不用β-连环蛋白介导。为了本文所述的目的，优选的WNT信号传导通路包括β-连环蛋白例如WNT/-连环蛋白的介导。
在某些实施方式中，Wnt信号传导的一种或多种激活剂减少GSK3β以激活Wnt信号传导。因此，Wnt信号传导的激活剂可以是GSK3β抑制剂。GSK3P抑制剂能够激活WNT信号传导通路，参见例如Cadigan,等,J Cell Sci.2006；119:395-402；Kikuchi,等,Cell Signaling.2007；19:659-671，将其全部内容并入本文以供参考。如本文所用，术语“糖原合成酶激酶3β抑制剂”是指抑制糖原合成酶激酶3β酶的化合物，例如参见Doble,等,J Cell Sci.2003；116:1175-1186，将其全部内容并入本文以供参考。
Wnt信号传导激活剂或GSK3β抑制剂的非限制性实例公开于WO2011/149762，WO13/067362，Chambers等,Nat Biotechnol.2012Jul1；30(7):715-20；Kriks等,Nature.2011Nov 6；480(7378):547-51；和Calder等,J Neurosci.2015Aug 19；35(33):11462-81，将其全部内容并入本文以供参考。在某些实施方式中，Wnt信号传导的一种或多种激活剂是选自CHIR99021、其衍生物、及其混合物的小分子。“CHIR99021”(也称为“氨基嘧啶”或“3-[3-(2-羧乙基)-4-甲基吡咯-2-亚甲基]-2-吲哚酮”)是指具有下式的IUPAC名称6-(2-(4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基)乙基氨基)烟腈。
CHIR99021具有高度选择性，显示对一组相关和不相关激酶近千倍的选择性，对人GSK3β的IC50＝6.7nM，对啮齿动物GSK3β同系物的IC50值为纳摩尔。
目前公开的分化方法还包括使人干细胞与刺猬因子通路(HH)的一种或多种激活剂(例如通过施用音猬因子(SHH))接触。如本文所用，术语“音猬因子”、“SHH”或“Shh”是指在称为刺猬因子的哺乳动物信号传导通路家族中至少三种蛋白质之一的蛋白质，另一种是沙漠刺猬因子(DHH)，第三种是印度刺猬因子(IHH)。Shh通过与跨膜分子Patched(PTC)和Smoothened(SMO)相互作用，与至少两种跨膜蛋白相互作用。Shh通常结合到PTC，然后允许激活SMO作为信号转导子。在不存在SHH的情况下，PTC通常抑制SMO，转而激活转录阻遏因子，从而不会发生某些基因的转录。当Shh存在并与PTC结合时，PTC不会干扰SMO的功能。在SMO不受抑制的情况下，某些蛋白质能够进入细胞核并充当允许激活某些基因的转录因子(参见Gilbert,2000Developmental Biology(Sunderland,Mass.,Sinauer Associates,Inc.,Publishers)。在某些实施方式中，音猬因子(SHH)信号传导的激活剂是指任何激活SHH信号传导通路的分子或化合物，包括结合PTC的分子或化合物或Smoothened激动剂等。Wnt信号传导的激活剂或GSK3β抑制剂的非限制性实例公开于WO10/096496，WO13/067362，Chambers等,Nat Biotechnol.2009Mar；27(3):275-80；和Kriks等,Nature.2011Nov 6；480(7378):547-51。这种化合物的实例是重组SHH、纯化的SHH，蛋白音猬因子(SHH)C25II(即，能够结合SHH受体以激活SHH的全长鼠音猬因子蛋白的重组N-末端片段，例如，R和D系统目录号：464-5H-025/CF)和小分子Smoothened激动剂，比如purmorphamine。
在某些实施方式中，在细胞已经与至少一种SMAD抑制剂接触后，从第1-15天起，使腹面发育和尾端化因子以有效量与细胞接触。在一个非限制性实施方式中，在细胞已经与至少一种SMAD抑制剂接触后，从从第1-20、1-19、1-18、1-17、1-16、1-14、1-13、1-12、1-11、或1-10天、及其中间值起，使腹面发育和尾端化因子与细胞接触。在某些非限制性实施方式中，在细胞已经与至少一种SMAD抑制剂接触后，从至少第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天开始，使腹面发育和尾端化因子与细胞接触，并与细胞一起培养，直到收集和纯化细胞。在一个非限制性实施方式中，使腹面发育和尾端化因子与细胞接触至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天。也可以使用本领域已知的其它运动神经元分化方法，例如，如Maury等，Nat Biotechnol.2015Jan；33(1):89-96(Epub 2014Nov 10)所述，其全部内容并入本文以供参考。
在某些非限制性实施方式中，可根据美国专利第8,642,334号；国际公开号WO/2011/149762、WO/2013/067362、WO/2014/176606、和WO/2015/077648；以及2016年6月1日提交的国际申请第PCT/US16/035312号所述的方法分化PSC，将其每一篇全部内容并入以供参考。
在某些非限制性实施方式中，运动神经元是表达一种或多种能够使运动神经元光遗传控制的蛋白质的重组细胞，例如，如Boyden等,2005；Zhang等,2011；Bryson等,2014；Cunningham等,2014；Steinbeck等,2015所述，其每一篇的全部内容并入本文以供参考。例如，用光刺激表达一种或多种这样蛋白质的运动神经元激活运动神经元(例如通过使细胞去极化)，使得细胞可以激活其在NMJ中突触到的肌肉组织。在某些非限制性实施方式中，该一种或多种蛋白质可以包含光敏蛋白、其衍生物、及其组合，例如光门控离子通道如亚视黄基蛋白(例如视紫红质)，例如视紫红质通道蛋白如视紫红质通道蛋白-1或视紫红质通道蛋白-2。光敏蛋白的其它实例包括但不限于盐细菌视紫红质、古紫质、细菌视紫红质和变形菌视紫质。
在某些非限制性实施方式中，光敏蛋白可操作地连接至神经元特异性启动子，例如突触蛋白启动子。
在某些非限制性实施方式中，重组运动神经元可以进一步表达可检测标志物，比如但不限于荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(EBFP，EBFP2，Azurite，mKalama1)、青色荧光蛋白(ECFP，Cerulean，CyPet，mTurquoise2)和黄色荧光蛋白衍生物(YFP，Citrine，Venus，YPet，EYFP)；β-半乳糖苷酶(LacZ)；氯霉素乙酰转移酶(cat)；新霉素磷酸转移酶(neo)；酶如氧化酶和过氧化物酶；和/或抗原性分子。在某些实施方式中，可检测标志物可以表达为与光敏蛋白的融合蛋白，例如视紫红质通道蛋白-2-EYFP。
在一个非限制性实施方式中，将PSC-衍生的运动神经元在培养中分化约10至15、20、25、30、35、40、45、50或更多天之间、以及其间的值之后；或至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多天之后纯化。在某些实施方式中，细胞通过解离培养物(例如第20天)和沉降神经元簇来纯化，而上清液含有非神经元细胞。
在某些非限制性实施方式中，PSC-衍生的运动神经元表达可检测水平的同源框基因9(HB9)、神经丝标志物SMI32、胰岛因子1(ISL1)、同源框转录因子NKX6.1、少突胶质细胞转录因子2(OLIG2)、胆碱乙酰基转移酶(ChAT)、乙酰胆碱酯酶(ACHE)和/或集聚蛋白(AG)。
在一个非限制性实施方式中，本文所述的PSC和/或成肌细胞衍生自不患有神经肌肉疾病的受试者。在某些非限制性实施方式中，本文所述的PSC和/或成肌细胞获自患有神经肌肉疾病或处于患有神经肌肉疾病例如ALS、重症肌无力或恶病质的风险的受试者。在某些非限制性实施方式中，神经肌肉疾病是原发性侧索硬化(PLS)、进行性肌萎缩症、进行性延髓麻痹、假性延髓麻痹、脊髓性肌萎缩(SMA)、小儿麻痹症后期综合征(PPS)、脊髓延髓肌肉萎缩症(SBMA)、进行性神经性肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease)(CMT)、格林-巴利(Guillain–Barré)综合征(GBS)、或本领域已知的任何其它运动神经元疾病。
在某些非限制性实施方式中，体外NMJ用于模拟重症肌无力。在一个非限制性实施方式中，NMJ的运动神经元和肌肉组分在来自重症肌无力患者的免疫球蛋白(例如IgG)的存在下共培养，其中免疫球蛋白包含针对患者的神经肌肉接头中蛋白质(例如乙酰胆碱受体，AChR)的自身抗体。在某些实施方式中，运动神经元和肌肉进一步与活性补体系统组分共培养。在某些非限制性实施方式中，致病性抗体与AChR的结合激活补体级联，导致NMJ的破坏。在某些实施方式中，运动神经元和肌肉在来自诊断患有重症肌无力或处于患有重症肌无力风险的受试者的血液、血清和/或血浆的存在下共培养。在某些非限制性实施方式中，重症肌无力的体外NMJ模型用在筛选调节NMJ活动的化合物的方法中，例如，以鉴定增加NMJ活动的化合物，如本文所述。
在某些非限制性实施方式中，体外NMJ用于模拟恶病质。在一个非限制性实施方式中，NMJ的运动神经元和肌肉组分在来自癌细胞培养物的条件培养基存在下共培养。在一个非限制性实施方式中，NMJ的运动神经元和肌肉组分在来自诊断患有恶病质或处于患有恶病质风险的受试者的血液、血清和/或血浆的存在下共培养。在一个非限制性实施方式中，NMJ的运动神经元和肌肉组分在蛋白水解因子、和/或炎性细胞因子，例如但不限于肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ和白细胞介素-6的存在下共培养。在某些非限制性实施方式中，恶病质的体外NMJ模型用在筛选调节NMJ活动的化合物的方法中，如本文所述，例如以鉴定增加NMJ活动的化合物。
在某些非限制性实施方式中，体外NMJ模型的肌肉组分由人原代成肌细胞制备，或衍生自PSC。在某些非限制性实施方式中，体外NMJ模型的肌肉组分由去分化为肌肉细胞前体的人肌肉细胞、例如成肌细胞制备，并与PSC-衍生的运动神经元一起培养。在某些非限制性实施方式中，体外NMJ模型的肌肉组分由从人受试者获得的人肌肉组织制备。任何前述细胞或组织可以例如来自成人(hMA)和/或胎儿(hMF)供体受试者。
在某些非限制性实施方式中，在分化之前，可以培养人原代成肌细胞、PSC和/或去分化为肌肉细胞前体的人肌肉细胞，直到达到至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多的汇合水平。
在某些实施方式中，在约4至5、6、7、8、9、10、15、17、20、25、30、35或40天之间、以及其间的值，或至少约4、5、6、7、8、9、10、15、17、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或更多天诱导人原代成肌细胞、PSC和/或去分化为肌肉细胞前体的人肌肉细胞以分化成多核肌管，然后分化成肌纤维。在某些非限制性实施方式中，在分化后，肌肉组织响应于乙酰胆碱(ACh)的刺激(例如收缩)。在某些实施方式中，分化的肌肉组织表达可检测水平的ACh受体(AChR)亚基，例如由CHRNG基因编码的胎儿γ亚基。在某些实施方式中，分化的肌肉组织表达可检测水平的肌肉特异性激酶(MuSK)、结蛋白和/或肌球蛋白。
在一个非限制性实施方式中，当它们达到70％汇合时，诱导人原代成肌细胞、PSC和/或去分化为肌肉细胞前体的人肌肉细胞以进行分化，其中细胞在分化开始后约4-7天内分化为多核肌管，并在约10-17天形成肌纤维，其中用乙酰胆碱(ACh，例如50μM)刺激可引起肌纤维收缩。
在某些非限制性实施方式中，体外NMJ模型由PSC-衍生的肌肉细胞制备。
在某些非限制性实施方式中，将PSC-衍生的运动神经元与本文所述的肌肉细胞或组织共培养，例如通过使用本领域已知的方法将运动神经元培养到肌肉细胞或组织上。
在某些实施方式中，用于共培养的运动神经元已经分化约10至30天、约10至25天、约15至20天、或约20至25天、或至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多天，或至多10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多天。
在某些实施方式中，用于共培养的肌肉细胞已经分化约4至25天、约5至20天、约5至15天、约5至10天、约10至17天、或约4至7天，或至少约4、5、6、7、8、9、10、15、17、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或更多天，或至多4、5、6、7、8、9、10、15、17、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或更多天。
在一个非限制性实施方式中，用于共培养的运动神经元已经分化约20至25天，并且共培养中使用的肌肉细胞已经分化约5至10天。
为了建立神经肌肉共培养物，可将PSC-衍生的运动神经元接种于肌肉细胞或组织上，例如成肌细胞-或PSC-衍生的肌肉组织，然后在足以使运动神经元和肌肉组织形成功能性神经肌肉接头的条件下培养。在某些非限制性实施方式中，将运动神经元和肌肉细胞或组织共培养足够时间以生长非神经元细胞层，例如将收缩肌保持在适当位置的非神经元细胞。在一个非限制性实施方式中，非神经元细胞形成结缔组织，例如表达波形蛋白和/或GFAP(胶质细胞原纤维酸性蛋白)的基质细胞。
例如，运动神经元和肌肉组织可以共培养至少4、5、6、7、8、9或10周或更长时间以建立功能性神经肌肉接头。例如，在这种共培养后，肌肉组织表现出对ACh刺激的收缩响应。在运动神经元表达光敏蛋白(即受光遗传控制)的实施方式中，当运动神经元受到光(例如，对于激活由运动神经元表达的光敏蛋白的特定的光的波长，比如对于激发视紫红质通道蛋白-2(ChR2)为470nm)刺激时，所述肌肉组织表现出收缩反应。
5.2鉴定NMJ调节剂的方法
本发明提供用于鉴定调节运动神经元和/或运动神经元在其上形成突触连接的肌肉的活动(即调节NMJ活动)的化合物的方法。候选化合物调节神经肌肉接头活动的能力可以通过试验候选化合物调节体外NMJ模型活动的能力来确定，如本文所述。因此，本文描述的方法提供一种用于鉴定候选化合物是否调节本领域已知的NMJ活动的任何指标，例如神经递质释放或稳定性的增加或减少；对离子比如例如钙、钠或钾的渗透性；和/或运动神经元和肌肉之间的连接性。在一个非限制性实施方式中，候选化合物可以通过增加或减少运动神经元与肌肉之间的神经连接性来调节NMJ活动。
在某些非限制性实施方式中，本发明提供一种鉴定通过增加体外NMJ模型的运动神经元和/或肌肉的活动来调节NMJ活动的候选化合物的方法，其中与不存在候选化合物时运动神经元和/或肌肉的活动相比，候选化合物使所述活动增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、或更多。可以选择通过增加NMJ活动来调节NMJ活动的候选化合物作为NMJ激动剂。
在某些非限制性实施方式中，本发明提供一种鉴定通过减少体外NMJ模型的运动神经元和/或肌肉的活动来减少NMJ活动的候选化合物的方法，其中与不存在候选化合物时运动神经元和/或肌肉的活动相比，候选化合物使所述活动减少至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、或更多。可以选择通过减少NMJ活动来调节NMJ活动的候选化合物作为NMJ拮抗剂。
在某些非限制性实施方式中，通过减少NMJ活动来调节NMJ活动的化合物可以用作麻醉剂和/或肌肉松弛剂，例如作为治疗的疗法的一部分。
在一个特定的非限制性实施方式中，NMJ的活动可以使用光遗传学技术来确定。例如，NMJ的运动神经元可以表达光门控离子通道，比如亚视黄基蛋白(例如视紫红质)，例如视紫红质通道蛋白，其在受光刺激时使运动神经元去极化，从而启动动作电位。在某些实施方式中，运动神经元表达视紫红质通道蛋白-2。在一个实施方式中，视紫红质通道蛋白-2可操作地连接至突触蛋白启动子。在某些非限制性实施方式中，表达光门控离子通道的运动神经元可以用聚焦在运动神经元上的光以激活光门控离子通道的波长进行刺激，其中运动神经元和/或其上具有NMJ中的神经元突触的肌肉的运动可以在候选化合物存在下确定。
在某些非限制性实施方式中，运动神经元可以通过使用本领域已知的技术将电流(例如去极化电流)注入细胞来刺激。在某些非限制性实施方式中，运动神经元可以通过使用本领域已知的技术使细胞的膜电位去极化来刺激。在某些非限制性实施方式中，肌肉可以通过例如使肌肉与神经递质接触来刺激。在刺激运动神经元和/或肌肉时，可以在存在和不存在候选化合物的情况下确定NMJ的活动。
在一个非限制性实施方式中，NMJ的活动可以通过测量NMJ的动作电位的振幅和/或频率和/或持续时间来确定。在某些实施方式中，动作电位在运动神经元中测量。在某些实施方式中，动作电位在肌肉中测量。例如，动作电位的振幅和/或频率和/或持续时间可以在用特定波长的光刺激运动神经元之后(例如，在光遗传控制下时)、或者当通过将电流例如去极化电流注入运动神经元的刺激之后、或者例如通过使肌肉与神经递质接触而直接刺激肌肉时进行测量。在一个非限制性实施方式中，动作电位的振幅和/或频率和/或持续时间的增加表明NMJ活动的增加，并且动作电位的振幅和/或频率和/或持续时间的减少表明NMJ活动的减少。
在某些非限制性实施方式中，NMJ的活动可以通过测量刺激时NMJ运动神经元释放的神经递质例如ACh的水平或浓度来确定，其中由运动神经元释放的或存在于NMJ的肌肉突触中的神经递质的浓度或水平的增加，表明NMJ活动增加，并且由运动神经元释放的或存在于NMJ肌肉突触中的神经递质浓度或水平减少表明NMJ活动减少。
在某些非限制性实施方式中，NMJ的活动可以通过测量在例如刺激突触到肌肉上的运动神经元时、或在例如通过使肌肉与神经递质接触而直接刺激肌肉时，NMJ的肌肉和/或运动神经元中的钙电流的振幅和/或频率和/或持续时间来确定。在一个实施方式中，肌肉和/或运动神经元中钙电流的振幅和/或频率和/或持续时间的增加表明NMJ活动增加，并且肌肉和/或运动神经元中的钙电流的振幅和/或频率和/或持续时间的减少表明NMJ活动减少。
在某些非限制性实施方式中，NMJ的活动可以通过测量在刺激在肌肉上突触的运动神经元时、或在例如通过使肌肉与神经递质接触而直接刺激肌肉时，NMJ的肌肉的运动来确定。在一个实施方式中，肌肉运动的振幅和/或频率和/或持续时间的增加表明NMJ活动的增加，并且肌肉运动的振幅和/或频率和/或持续时间的减少表明NMJ活动的减少。
在某些实施方式中，可以通过使用本文所述的体外NMJ模型将候选化合物鉴定为NMJ激动剂，其中例如与不与候选化合物接触的NMJ相比，将NMJ暴露于有效量的候选化合物增加NMJ活动。
在某些实施方式中，可以通过使用本文所述的体外NMJ模型将候选化合物鉴定为NMJ拮抗剂，其中例如与不与候选化合物接触的NMJ相比，将NMJ暴露于有效量的候选化合物减少NMJ活动。
在某些非限制性实施方式中，NMJ包含表达光门控离子通道、例如视紫红质通道蛋白-2的运动神经元，并且光诱导的肌肉收缩可以在与来自具有升高的AChR抗体滴度的重症肌无力患者的IgG级分(例如，200nM总IgG)孵育之前和之后，在运动神经元与成人衍生的(或胎儿衍生的)成肌细胞的功能性共培养物中测量。可以将活性补体与IgG一起加入(例如以血清形式加入)。可以在使培养物与IgG和补体接触之前测试NMJ培养物的区域的NMJ活动，并且在IgG和补体暴露后(例如在IgG和补体暴露后至少三天后)再次测试。
在某些非限制性实施方式中，本发明还提供通过使用人NMJ的体外模型来鉴定调节NMJ活动的基因的方法。在某些非限制性实施方式中，NMJ的活动可以在NMJ例如健康的野生型NMJ的运动神经元和/或肌肉中表达的一种或多种基因的表达水平减少时测定。一种或多种基因的表达水平可以通过以下方式而减少：使运动神经元和/或肌肉与例如，靶向一种或多种基因的mRNA的反义RNA、siRNA或RNAi分子；通过特异性结合由该一种或多种基因表达的蛋白质的抗体或其活性片段接触而减少；通过向一个或多个基因中引入突变来减少来自基因的功能性蛋白的表达；或本领域已知的用于减少基因表达的任何其它方法。
在某些非限制性实施方式中，NMJ的活动可以在NMJ例如健康的野生型NMJ的运动神经元和/或肌肉中表达的一种或多种基因的表达水平增加时测定。在某些非限制性实施方式中，NMJ的活动可以在NMJ例如健康的野生型NMJ的运动神经元和/或肌肉中非正常表达的一种或多种基因的表达水平在运动神经元和/或肌肉中表达时测定。在某些非限制性实施方式中，基因的表达水平可以通过将包含该基因的表达载体重组地引入运动神经元和/或肌肉中来增加。在某些实施方式中，由该基因表达的蛋白质可以在体外制备，然后直接与运动神经元和/或肌肉接触。
当基因表达水平的增加或减少调节NMJ活动时，可以选择这种基因作为NMJ调节基因。
6.实施例
参照以下实施例将更好地理解本发明公开的主题，这些实施例作为本发明的示例提供，而不作为限制。
6.1实施例1：在光遗传控制下使用体外神经肌肉接头对人神经肌肉疾病建模
总结
捕获人多能干细胞(PSC)-衍生的神经元在疾病建模和再生医学中的全部潜力需要它们在复杂的功能系统中的审查。在此，我们展示了在人PSC-衍生的脊髓运动神经元中建立光遗传控制。这些运动神经元与人成肌细胞-衍生的骨骼肌的共培养物可以在光刺激时触发以抽搐。使用生理学和成像方法来表征新建立的全人神经肌肉接头。为了模拟神经肌肉疾病，我们将这些共培养物与来自重症肌无力患者的IgG和活性补体孵育。重症肌无力是一种选择性靶向神经肌肉接头的自身免疫性疾病。我们观察到代表肌肉力量特征性丧失的替代指标的肌肉收缩振幅的可逆减少。重演疾病关键方面及其对症治疗的能力表明，我们的新型神经肌肉接头测定对于神经肌肉疾病的建模和再生将具有广泛的意义。
结果
为了在人脊髓MN群体中建立光遗传学控制，我们用慢病毒载体转导未分化的H9hESC以在人突触蛋白启动子控制下表达视紫红质通道蛋白2-EYFP或单独的EYFP。选择突触蛋白启动子是因为其在人PSC-衍生的神经元中的忠实和稳健的表达。通过PCR扩增并验证克隆hESC系，用于转基因的基因组整合(数据未显示)以及维持多能性标志物表达(图1A，O)。只选择在各种神经元分化范例(Steinbeck等,2015)中具有稳健的转基因表达的ESC克隆用于进一步的实验。通过将双SMAD抑制(Chambers等人，2009)与激活刺猬因子通路组合以用于腹面发育和暴露于视黄酸用于尾端化(Calder等，2015)，实现向脊髓运动神经元的分化。在分化的第20天，ChR2-EYFP转基因在那些培养条件下出现的神经元簇中强烈表达(图1B)。我们开发了一个简单的纯化程序，包括在第20天解离培养物并沉降神经元簇，同时弃去含有非神经元细胞的上清液。该策略允许hESC-衍生的MN的显著纯化(图1C)。对连续5次MN分化的QRT-PCR分析证实纯化MN培养物中真正的脊髓运动神经元(sMN)标志物ISL1、NKX6.1和OLIG2的3倍富集(图1D)，而对于非神经元污染物的标志物(FOXA2、PDX1)在纯化的MN培养物中大约消耗10倍(图1E)。在第40天对纯化的MN进行的另外的QRT-PCR实验中，我们发现生理学上相关的MN标志物胆碱乙酰基转移酶(ChAT)、乙酰胆碱酯酶(ACHE)和集聚蛋白(AG)得到表达(CHAT 60.3±29.6％的HPRT，ACHE 273.6±59.3％的HPRT，AG 79.3±32.1％的HPRT)。通过免疫细胞化学，我们证实纯化的MN表达与ChR2-EYFP(图1F)以及ChAT和成熟神经丝标志物SMI32(图1G)组合的HB9和ISL1。MN诱导的另一种方案(Maury等，2015)产生了类似的结果(图1H-J)。光遗传控制在电生理学实验中得到验证。在成熟的脊髓运动神经元(超过60天)中，其在明视场和绿色荧光光学(图1K)下鉴定，强直动作电位(AP)发放(firing)通过注射去极化电流步骤(图1L)由保持在-70±2mV的膜电位引发。静息膜电位为-62.4±4.8mV。此外，4个表达ChR2的神经元中的4个在0.2-10Hz的宽频率范围内发放光诱导的AP(图1M，N)。峰保真度从0.2到2Hz为100％，5Hz时为93.3±5.7％，10Hz时为65.5±23.3％。来自EYFP hESC系的纯化的神经元也表达HB9和ISL1(图1O，P)，并且可以通过电流注射诱导以发放AP(图1Q)。静息膜电位为-58.4±2.6mV。正如预期，2个测试的EYFP+神经元中的2个对任何光刺激都没有响应(图1R)。
为了获得体外功能性骨骼肌，我们使用来自成人(hMA)和胎儿供体(hMF)的人原代成肌细胞。当它们达到70％汇合时，对这两种类型的成肌细胞(图2A)进行诱导以分化。两种成肌细胞培养物在分化开始后4-7天内融合形成多核肌管。从第10天到第17天，用乙酰胆碱(ACh，50μM)刺激导致成年和胎儿肌纤维收缩的可靠性增加(图2B)。在钙成像实验中进一步评估肌肉功能性。在分化的第35天，将铺在玻璃盖玻片上的肌肉培养物与钙染料Fura2一起孵育。用ACh刺激后，纤维产生明显的钙瞬变(图2C)。通过QRT-PCR定量AChR亚基显示，第30天肌肉培养物表达胎儿γ亚基(CHRNG，hMA培养物中32.2±8.6％的HPRT，和hMF培养物中97.1±33.4％的HPRT)，而成人ε亚基几乎检测不到(对于两种肌肉类型，CHRNE<hMA和hMF培养物中0.2％的HPRT表达，CHRNG：CHRNE比>100)。人成肌细胞培养物也表达肌肉特异性激酶(MuSK，hMA培养物中44.8±18.5％的HPRT，和hMF培养物中73.8±15.8％的HPRT)。免疫细胞化学分析证实，多核肌管表达肌球蛋白，而间充质基质表达中间丝波形蛋白。结构完整的肌管可以在培养中至少保持到90天，但在这些条件下不会形成典型的骨骼肌条纹。
为了建立神经肌肉共培养物，我们使用纯化的表达ChR2的脊髓运动神经元(第20-25天)并将它们铺在预分化的骨骼肌纤维(第5-10天)上。铺完后，hESC-衍生的脊髓MN细胞体大部分保留在神经元簇内，但延伸的轴突穿过成人和胎儿肌肉(第一周内达到2mm，图3A，E)。以每周的间隔测试共培养物神经肌肉连接性的建立。为此目的，在明视场照明下观察培养物，并用蓝光脉冲间歇性地刺激。在共培养开始后六到八周，伸长的圆柱形成肌细胞-衍生的肌纤维保持形态完整，并响应光遗传刺激(470nm，0.2Hz，300ms脉冲宽度)开始收缩。图3B、F显示与两种肌肉类型的成熟共培养物。图3C、G显示来自这些培养物的单个纤维的肌肉抽搐的定量。下图显示8.5分钟内的长期实验(图3C在0.2Hz下，图3G在0.1Hz下)。630nm的光未引起任何肌肉收缩，表明肌肉抽搐是ChR2激活的结果。烟碱型乙酰胆碱受体(AChR)拮抗剂维库溴铵(2μM)的加入完全阻断了所有测试培养物中光诱导的肌肉抽搐(图3D，H)。这些数据表明连接性确实通过功能性神经肌肉胆碱能突触建立，而不是细胞融合的结果(即，ChR2转移到可导致直接肌肉激活的肌肉膜中)。当通过替代方案(Maury等，2015)将产生的ChR2+MN铺到hMA-或hMF-衍生的肌肉上时，获得了类似的结果(数据未显示)。大多数只有MN的培养物未显示任何光诱导抽搐。然而，约20％的长期只有MN的分化产生了非神经过度生长，其有时表现出光诱导的维库溴铵敏感性抽搐。这些数据表明，具有次佳纯化的MN培养物可能含有PSC-衍生的肌原细胞。最近报道了能够产生脊髓运动神经元和近轴中胚层结构(包括骨骼肌)的前体的衍生物(Gouti等，2014)。然而，此类PSC-衍生的肌肉样细胞从未显示对原代成肌细胞衍生纤维而言典型的分离的伸长形态。
我们接下来表征功能性神经肌肉培养物中的关键生理参数。将成熟的共培养物与钙染料Fura2一起孵育并装入成像室以连续灌注。在先前鉴定为响应光刺激而显示肌肉收缩的区域中(图3I)，470nm光遗传刺激在肌纤维中产生钙峰，其可由维库溴铵阻断(6/6培养物，图3J)。图3J的下图证实45分钟的钙成像实验中神经肌肉兴奋性的长期稳定性。在另一项研究中，选择了通过在相差显微镜下其圆柱形和条纹外观的以及通过它们经历光诱导性抽搐的能力鉴定的骨骼肌管(n＝5)用于细胞内记录(图3K)。光响应性肌管用锋利的电极刺穿，并且以0.2-2Hz的频率、在447nm光遗传刺激期间记录肌肉AP。峰保真度在0.2Hz时为100％，在0.5Hz时为93.3±6.7％，在1Hz时为75±15.0％，在2Hz时为80±10.0％。维库溴铵(2μM)以可逆方式完全阻断肌纤维中光诱导的AP。为了解决几天和几周进程内神经肌肉连接性的稳定性，每5天评估收缩区域(n＝7)。定量分析显示，与第0天相比，所有7个区域对光遗传刺激均保持响应性并且直到第25天收缩增加至137.3±50.7％(图3L)。
共培养物的形态学表征揭示存在一层非神经元细胞，其可能对将收缩肌肉保持在适当位置是必要的。大多数这些基质细胞表达波形蛋白和少数GFAP(图1M)。在大多数收缩区域发现密集的神经元突起网络与肌间线蛋白(图3N)或肌球蛋白(数据未显示)染色的肌管紧密接触。发现神经元EYFP+结(bouton)与条纹、多核肌纤维紧密接触(图3O)。肌纤维上的乙酰胆碱受体用银环蛇毒素(BTX)标记。高功率共焦成像(图3P)揭示肌细胞膜上乙酰胆碱受体与MN突触末端紧密并置的斑块状聚集(Marques等，2000)。与非收缩区域相比，肌纤维上BTX+点的定量显示收缩和强神经支配区域显著增加(图3Q，R；双尾不成对t检验，p＝0.016，t＝2.60)。通过QRT-PCR定量AChR亚基显示6周成熟共培养物表达胎儿γ亚基(CHRNG，hMA共培养物中17.3±7.5％的HPRT，和hMF共培养物中27.4±9.0％的HPRT)，而成人ε亚基几乎检测不到(CHRNE<hMA和hMF共培养物中0.1％的HPRT表达，两种肌肉类型的CHRNG：CHRNE比>100)。因此，与人脊髓运动神经元共培养直到这个时间点才诱导成人ε亚基的表达。神经肌肉共培养物还表达肌肉特异性激酶(MuSK，hMA共培养物中7.9±1.9％的HPRT，hMF共培养物中27.7±10.3％的HPRT)。
接下来，我们试图解决功能性神经肌肉共培养物是否适合模拟典型的人神经肌肉疾病。重症肌无力(MG)(Toyka等，1977；Verschuuren等，2013)是由针对神经肌肉接头中蛋白质(例如乙酰胆碱受体，AChR)的自身抗体的出现引起的。致病性抗体与AChR的结合激活补体级联反应，导致神经肌肉终板的破坏(Sahashi等，1980)，这最终导致患者的进行性肌无力。因此，我们定量了在与来自两名具有明显升高的AChR抗体滴度的MG患者(1号和2号)的IgG部分(200nM总IgG)一起孵育之前(图4A，D)和之后，MN与成人-衍生的成肌细胞(hMA)的功能性共培养物中的光诱导肌肉收缩。免疫球蛋白冻干粉(Sandoglobulin)(SG)多价IgG作为对照。含有活性补体的2％新鲜人血清与所有IgG一起加入。当在IgG和补体暴露后三天再次测试完全相同的培养区域时，我们发现在用MG IgG和补体孵育的培养物中响应于光刺激的肌肉抽搐减少(图4B)，但用对照IgG和补体孵育的对照培养物中不减少(图4E)。仔细定量收缩培养物中的肌肉抽搐显示，与添加IgG和补体之前的初始运动(第0天，100％)相比，在第3天对照培养物(n＝14)显示肌肉收缩增加至125％。相比之下，用来自任一MG患者的IgG孵育的培养物在收缩性方面显示显著减少(1号，n＝14，68％，2号，n＝11，60％)(图4G，单因素ANOVA，p＝0.0046，F(2,36)＝6.25)。Dunnett的多重比较检验揭示对照组和任一MG组之间的显著差异(CTRL相比1号，p<0.05，q＝2.93，CTRL相比2号，p<0.01，q＝3.13)，表明已经引入肌无力表型。为了测试是否可以模拟治疗响应，我们将MG培养物(图4C，F，n＝8)和对照(图4F，n＝4)与ACh酯酶抑制剂吡啶斯的明(PYR，10μM)孵育。我们发现PYR在MG培养中的应用诱导了显著的治疗效果(图4C和4H，+22％，双尾配对t检验，p＝0.002，t＝4.69)。接下来，我们评估了模拟血浆置换治疗洗除MG IgG和补体后肌无力表型是否可逆(Gold等，2008)。在第0天向培养基中加入MG IgG和补体，并在第3天洗除后1天和3天(分别在第4天和第6天)再次测试相同的培养区域(n＝4)。定量分析显示，在4个培养物的4个中，洗除MG IgG和补体导致肌无力表型逆转(图4I，D3相比D6，双尾配对t检验，p＝0.0098，t＝10.09)。我们还测试了在7天进程中对照和不添加补体的MG#1IgG的效果。未处理的培养物(n＝5)和用CTRL IgG处理的培养物(n＝6)收缩性随时间增加，而第5天和第7天用MG#1IgG处理的培养物(n＝7)在收缩性方面显示延迟但显著减少至约70％(第7天的CTRL相比MG，Dunnett的多重比较测试，p<0.05，q＝3.10)。
为了进一步表征肌无力表型，我们进行了钙成像实验。MG#1IgG的急性应用并未减少由肌纤维记录的光诱导钙信号(0.2至5μM，至多60min，数据未显示)。因此培养物用对照和MG#1IgG和人补体预处理2天。钙成像在具有相似数量的肌纤维和密集神经支配的区域中进行(图4K，L)。当在视野中可识别的所有纤维中定量时，与对照相比，光诱导的钙峰在用MG#1IgG和补体处理的培养物(n＝11)中显著较弱(图4M，CTRL相比MG，双尾不配对t检验，p＝0.012，t＝2.83)。应用PYR后，我们检测到光诱导钙峰的小但显著的增加(n＝8，图4M，MG相比MG+PYR，双尾配对t检验，p＝0.046，t＝2.42)。此外，与对照相比，用MG#1IgG和补体处理的培养物中反应性纤维的百分比减少(图4N，CTRL 78％相比MG 32％，双尾不配对t检验，p<0.001，t＝4.79)。在应用PYR后，我们发现朝向反应性纤维百分比更高的趋势，没有达到显著性(图4N，MG相比MG+PYR，双尾配对t检验，p＝0.065，t＝2.19)。最后，我们试图确认神经肌肉接头上的补体攻击。为此目的，用MG#1IgG和人补体处理的培养物以及用CTRL IgG和人补体处理24小时的培养物用识别人补体片段C3c的抗体进行染色。用BTX和EYFP共同标记显示所靶向的补体在MG中沉积到肌肉膜上、特别是神经肌肉接头处，而在CTRL培养物中不是。(图4O，P)。定量显示，与对照相比，在MG培养物中神经肌肉接头处的补体显著沉积(图4Q，双尾不配对t检验，p＝0.008，t＝3.89)。当与增加量的MG和对照IgG和补体一起孵育时，仅MN培养物没有显示毒性指征。
讨论
人脊髓运动神经元在再生医学中的最期望的应用(Davis-Dusenbery等，2014；Steinbeck和Studer，2015)取决于它们通过神经肌肉接头功能性地与骨骼肌连接的能力。然而，由于技术限制和缺乏合适的体外试验，通常神经元移植物对宿主连接性的前景仍未得到充分证实。使用光遗传学，我们首次证明具有巨大治疗潜力的人PSC-衍生的神经元群体功能性地连接其真正的人靶标组织。在一项研究中，光遗传学控制下的小鼠胚胎干细胞-衍生的运动神经元植入成年小鼠的坐骨神经的部分失神经分支中，可使下后肢肌肉神经恢复支配(Bryson等，2014)。然而，本研究描述了由PSC-衍生的运动神经元和成肌细胞-衍生的肌肉制备的完全人体外神经肌肉接头，其中运动神经元能够在体外与肌肉形成功能性突触。这种体外方法允许对神经肌肉连接性进行深入的功能性表征，并且在功能性实验中明确排除细胞融合。不受任何特定理论的束缚，在我们的系统中，神经肌肉突触可能涉及通过MN末端分泌集聚蛋白，其通过MuSK和缔合蛋白发信号以诱导神经肌肉接头的组装(Sanes和Lichtman，2001；Wu等，2010)。斑块样AChR聚集(Marques等，2000)以及刺激诱导的收缩性增强(图4J)表明形成功能完善但尚未成熟的神经肌肉突触。
除了对人类再生医学的影响之外，我们的新型培养系统还能够在所有人类系统中对神经肌肉疾病进行建模。我们显示经典神经肌肉疾病重症肌无力的特定功能和结构表型及其治疗(Gold等，2008；Verschuuren等，2013)可以通过简单加入肌无力患者IgG和补体而在神经肌肉共培养物中重演。我们的研究结果表明神经肌肉疾病的退行性和再生性方面都可以在这种人功能性神经肌肉共培养物中进行研究。因此，我们提出该新型系统可以使用患者特异性iPSC衍生的神经元(Kiskinis等，2014)或肌肉(Darabi等，2012；Skoglund等，2014)，能够剖析源于神经肌肉接头任一方的疾病过程。
方法
突触蛋白-hChR2-EYFP hESC系
用慢病毒颗粒(pLenti-Syn-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE)转导H9人ES细胞并以克隆密度铺板。通过PCR筛选出新的菌落用于转基因整合并分化以确保在所有神经元子代中的稳定的长期表达。
脊髓运动神经元的生成
ES细胞以汇合的单层铺板，并通过双重SMAD抑制启动神经化。为了腹面发育和尾端化，从第1-15天开始加入purmorphamine和视黄酸(Calder等，2015)。第20天出现的MN簇通过沉积纯化。
人原代成肌细胞培养
人原代成肌细胞购自Life Technologies(成人供体)和Lonza(胎儿供体)。两种成肌细胞群均在骨骼肌生长培养基(SkGM-2，Lonza)中生长。通过暴露于含有2％马血清的培养基，成肌细胞达到70％汇合时诱导分化。
神经肌肉共培养物的启动
在成肌细胞分化开始后五到十天，纯化的MN簇重悬于铺在成肌细胞培养基顶部中心的基质胶中。将培养物保存在具有2％马血清的MN分化培养基中。
共培养物测试
在10x明视场照明下观察到成熟的共培养物，同时间歇地打开荧光灯(470nm，2mW/mm2，约300ms脉冲)的快门。在室温下的标准台氏液(Tyrode’s solution)中持续明视场照明(40ms曝光时间，每500ms，100帧)下对稳定收缩区域成像。以指定的频率应用光遗传刺激(470或630nm，2mW/mm2，约300ms脉冲)。为了定量运动，自动追踪多个有代表性的高对比度区域(MetaMorph软件)。
钙成像
将玻璃盖玻片上的肌管或共培养物与按比例计的钙染料Fura-2孵育并在标准台氏液中连续灌注下成像。肌管受乙酰胆碱刺激。共培养物每5s以470nm(4mW/mm2)的光遗传刺激照射10ms。
电生理学
在成熟的EYFP+MN上，在室温下进行全细胞电流钳记录。使用447nm二极管激光器(OEM激光器)以约1mW/mm2的5ms光脉冲激发光引发的AP。响应于光刺激而收缩的肌管用锋利的电极刺穿以进行细胞内记录。
用人血清和含有抗烟碱型乙酰胆碱受体抗体的重症肌无力IgG治疗
合并来自5个健康供体的血清(含有补体)并加入到指定的培养基(2％v/v)中。从2个严重受影响的MG患者获得IgG部分，将免疫球蛋白冻干粉(Sandoglobulin)多价IgG用作对照(全部为200nM的总IgG，1号患者AChR抗体滴度576nmol/l，2号患者AChR抗体滴度17nmol/l)。患者已经书面同意使用他们的材料进行研究，并得到了维尔茨堡大学医学院伦理委员会(Würzburg University Medical School Ethics Committee)的批准。
免疫细胞化学和成像
将细胞或培养物固定在PFA中并用5％FBS/0.3％Triton封闭。根据制造商建议书孵育第一抗体，然后孵育适当的Alexa Flour-结合的第二抗体。使用倒置荧光显微镜对染色进行成像，或者在配备有白色激光技术的倒置Leica SP8显微镜上使用40/63x油浸物镜进行共焦成像，随后在指定的地方进行后续的数据去卷积。
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