本发明属于发酵工程、生物质能源
技术领域：
，具体涉及一种利用青鲜含糖生物质发酵生产乙醇的方法。
背景技术：
：随着科技经济的发展，人类社会对化石能源的依存度与日俱增。化石燃料的使用存在高消耗、高污染等问题。在能源安全和环境保护的双重背景下，开发可持续、可再生、高效、低成本、便捷和安全的能源显得尤为必要。生物质能源可以有效替代传统的化石燃料，实现能源的绿色化和可再生化，是公认的能唯一实现液体燃料替代的方案。生物燃料乙醇可以降低汽油的使用量使汽油燃烧更加充分，进而减少有害气体的排放。以农业废弃物或边际性土地种植的能源作物为原料，生产燃料乙醇已成为许多国家新能源战略的重要发展方向，其产业化对社会的可持续发展有着重要意义。目前，由于发酵技术的局限性，以青鲜生物质原料中的糖分进行乙醇生产时，由于青鲜秸秆固体生物质残渣的利用率低，造成资源浪费，使得乙醇生产不经济。此外，青鲜秸秆资源中的糖分需要浓缩保存，这进一步增加了乙醇原料成本。相比于利用青鲜植物中的糖分直接制备乙醇，以木质纤维植物为原料的纤维乙醇发酵更具难度。由于木质纤维原料中的木质素、半纤维素紧密地包裹着纤维素，形成复杂结构，因此需要对木质纤维素进行预处理来改变纤维素的天然结构，降低纤维素的结晶度和聚合度，从而有利于纤维素酶与底物的结合及水解。同步糖化法发酵实现了纤维水解和乙醇发酵的结合，酶解液中的葡萄糖浓度始终保持在较低范围内，不会对纤维素酶产生反馈抑制，提高了糖化效率，减少了纤维素酶的用量，所需的反应设备也相对减少。但是纤维固体残渣具有吸水性，过高的投料量使得发酵底物粘度增大，发酵体系传质受阻，一般而言，木质纤维固体原料的投料量在批次发酵过程中小于20％，这也造成了发酵产物乙醇浓度较低，因此，很难同时实现高纤维转化率和高乙醇产物浓度。此外，木质纤维素预处理过程中出现的有毒物质，对微生物发酵和纤维素酶活性均会造成不利影响。目前，乙醇生产原料的成本高，发酵产物浓度低及乙醇的低生产效率、高分离成本，使木质纤维素乙醇技术难于进行商业应用。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种利用青鲜含糖生物质发酵生产乙醇的方法，该方法能高效综合利用青鲜植物原料中的生物质生产乙醇，充分利用了生物质原料，降低了生产原料的成本，同时解决了传统同步糖化乙醇发酵过程中乙醇产率低，浓度低和分离成本高的问题。为此，本发明提供了一种利用青鲜含糖生物质发酵生产乙醇的方法，其包括向青鲜含糖生物质源含糖汁液中加入青鲜含糖生物质源木质纤维固含物的降解处理残渣、纤维素酶和产乙醇菌株进行发酵获得富含乙醇的发酵醪液的步骤；其中，青鲜含糖生物质源含糖汁液和青鲜含糖生物质源木质纤维固含物均通过青鲜含糖生物质原料压榨获得。根据本发明，所述青鲜含糖生物质原料含有含糖汁液和木质纤维固含物。在本发明的一些实施例中，所述木质纤维固含物包括纤维素和/或半纤维素。本发明中，所述青鲜含糖生物质原料包括含水量均在40wt％以上的青鲜玉米秸秆、青鲜高粱秸秆、青鲜甘蔗杆和青鲜甜菜块茎中的一种或多种。根据本发明，所述青鲜含糖生物质源木质纤维固含物的降解处理残渣以与青鲜含糖生物质源含糖汁液混合的方式加入，或在青鲜含糖生物质源含糖汁液中的糖被发酵降解完全之前以批次补料或连续补料的方式加入。在本发明的一些优选的实施例中，所述青鲜含糖生物质源木质纤维固含物的降解处理残渣在青鲜含糖生物质源含糖汁液中的糖被发酵降解完全之前以批次补料的方式加入。本发明中，所述产乙醇菌株为能够代谢产生乙醇的细菌、能够代谢产生乙醇的真菌和能够代谢产生乙醇的基因工程菌中的一种或多种；优选所述产乙醇菌株为能够代谢产生乙醇的真菌。本发明中，所述纤维素酶包括内切葡聚糖苷酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶中的一种或多种。本发明中，所述青鲜含糖生物质源含糖汁液中的总糖含量＜300g/L。在本发明的一些实施例中，所述产乙醇菌株以种子液的形式加入，或以活性干菌粉的形式加入；当所述产乙醇菌株以种子液的形式加入时，所述种子液的加入量以青鲜含糖生物质混合物的总体积计为1v％-20v％，优选所述种子液的加入量以青鲜含糖生物质混合物的总体积计为5v％-10v％；当所述产乙醇菌株以活性干菌粉的形式加入时，所述活性干菌粉的加入量以青鲜含糖生物质混合物的总重量计为0.005w％-0.1w％。在本发明的一些实施例中，所述纤维素酶的加入量以青鲜含糖生物质源木质纤维固含物的降解处理残渣的总重量计为1-60FPU/g；优选纤维素酶的加入量以青鲜含糖生物质源木质纤维固含物的降解处理残渣的总重量计为5-40FPU/g，进一步优选纤维素酶的加入量以青鲜含糖生物质源木质纤维固含物的降解处理残渣的总重量计为5-20FPU/g。根据本发明，所述青鲜含糖生物质源木质纤维固含物以粉末的方式进行降解处理。在本发明的一些实施例中，所述粉末的粒径在＞30目；优选所述粉末的粒径>60目。本发明中，降解处理的方法为碱法、酸法、水热法、有机溶剂法、离子液体法、蒸汽爆破法、超声法、球磨法、高压匀浆法和生物法中的一种或多种，优选降解处理的方法为酸法和/或碱法。在本发明的一些实施例中，所述发酵的温度为20-60℃，优选发酵的温度为30-50℃，进一步优选发酵的温度为35-45℃。附图说明下面将结合附图来说明本发明。图1为本发明所述方法的具体操作流程图具体实施方式为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。如前所述，乙醇的生产原料的成本高及传统同步糖化发酵乙醇过程中乙醇的低生产效率，发酵醪液乙醇浓度低，使木质纤维素乙醇生产技术难于进行商业应用。本发明人研究发现，现有工艺中由于发酵技术的局限性而没有同时利用青鲜含糖生物质中的含糖汁液和纤维原料，由此造成原料的利用率低，使得乙醇的原料成本较高，生产效率低，发酵醪液乙醇浓度低。本发明人进一步研究发现，半同步糖化发酵法，即先将木质纤维底物一部分糖化至液相中，再接入发酵菌株继续进行同步糖化发酵，可以兼具游离和同步糖化发酵二者的优点，解决传统同步糖化产乙醇过程中，发酵初期可能存在发酵糖不足的情况，获得更高的乙醇产率。与此相应，通过在发酵初期培养基中预先加入一定的游离糖份，再结合常规的纤维质同步糖化发酵方式，亦可以获得与半同步糖化法类似的发酵效果。本发明人首次以青鲜含糖生物质为原料，进行乙醇的发酵生产。本发明正是基于上述方法作出的。因此，本发明所涉及的利用青鲜含糖生物质发酵生产乙醇的方法可以理解为青鲜含糖生物质在发酵生产乙醇中的应用，所述方法的具体操作流程图如图1所示，其包括向青鲜含糖生物质源含糖汁液中加入青鲜含糖生物质源木质纤维固含物的降解处理残渣、纤维素酶和产乙醇菌株进行发酵获得富含乙醇的发酵醪液的步骤；其中，青鲜含糖生物质源含糖汁液和青鲜含糖生物质源木质纤维固含物均通过青鲜含糖生物质原料压榨获得。在一些实施例中，所述富含乙醇的发酵醪液中乙醇的浓度为68.83-98.1g/L。在一些实施例中，所述发酵的温度为20-60℃，优选发酵的温度为30-50℃，进一步优选发酵的温度为35-45℃。在一些优选实施例中，将青鲜含糖生物质源含糖汁液与青鲜含糖生物质源木质纤维固含物混合后，加入尿素、磷酸二氢钾和无水硫酸镁后再用于乙醇的发酵。根据本发明，所述产乙醇菌株以种子液的形式加入，或以活性干菌粉的形式加入；在本发明的一些实施方式中，所述产乙醇菌株以种子液的形式加入，所述种子液的加入量以青鲜含糖生物质混合物的总体积计为1v％-20v％；在本发明的一些优选的实施方式中，所述种子液的加入量以青鲜含糖生物质混合物的总体积计为5v％-10v％。在本发明的另一些实施方式中，所述产乙醇菌株以活性干菌粉的形式加入时，所述活性干菌粉的加入量以青鲜含糖生物质混合物的总重量计为0.005w％-0.1w％。本发明中，所述产乙醇菌株为能够代谢产生乙醇的细菌、能够代谢产生乙醇的真菌和能够代谢产生乙醇的基因工程菌中的一种或多种。在一些实施例中，所述产乙醇菌株为酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeH5株。在一些实施例中，所述纤维素酶的加入量以青鲜含糖生物质源木质纤维固含物的降解处理残渣的总重量计为1-60FPU/g；优选纤维素酶的加入量以青鲜含糖生物质源木质纤维固含物的降解处理残渣的总重量计为5-40FPU/g，进一步优选纤维素酶的加入量以青鲜含糖生物质源木质纤维固含物的降解处理残渣的总重量计为5-20FPU/g。应该了解的是，所述纤维素酶的添加时间为用于发酵液中的残糖浓度低于5g/L时。本发明中，所述纤维素酶包括内切葡聚糖苷酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶中的一种或多种。本发明中对纤维素酶的来源没有特别的限制，例如，纤维素酶可以为市售或为具有产纤维素酶能力的微生物；优选所述微生物包括里氏木霉、斜卧青霉和经蛋白表面展示技术改造后的酿酒酵母中一种或多种。本发明中，所述青鲜含糖生物质原料含有含糖汁液和木质纤维固含物。在一些实施例中，例如，所述青鲜含糖生物质原料包括含水量均在40wt％以上的青鲜玉米秸秆、青鲜高粱秸秆、青鲜甘蔗杆和青鲜甜菜块茎中的一种或多种。本发明中，所述青鲜含糖生物质源含糖汁液可以直接用于发酵，也可以经稀释或浓缩后，再进行发酵，但用于发酵的青鲜含糖生物质源含糖汁液中的总糖含量＜300g/L。本发明中，所述木质纤维固含物包括纤维素和/或半纤维素。在一些实施例中，所述青鲜含糖生物质源木质纤维固含物的降解处理残渣以与青鲜含糖生物质源含糖汁液混合的方式加入，或在发酵终止前以批次或连续补料的方式加入。优选所述青鲜含糖生物质源木质纤维固含物的降解处理残渣在发酵终止前以批次补料的方式加入。本发明中，所述青鲜含糖生物质源木质纤维固含物以粉末的方式进行降解处理。在一些实施例中，例如，所述粉末的粒径在＞30目；优选所述粉末的粒径>60目。本发明中，降解处理的方法为碱法、酸法、水热法、有机溶剂法、离子液体法、蒸汽爆破法、超声法、球磨法、高压匀浆法和生物法中的一种或多种，优选降解处理的方法为酸法和/或碱法。根据本发明的一些实施方式，所述方法还包括将富含乙醇的发酵醪液进行分离纯化制得乙醇产品的步骤。在本发明的一些实施例中，所述分离纯化的方法包括普通蒸馏、减压精馏、液液萃取、渗透汽化、蒸汽渗透、汽提、真空抽提和吸附法中的一种或多种。根据本发明，所述分离纯化在厌氧发酵终止后进行，或与厌氧发酵过程耦合进行原位分离。在本发明的一些具体实施方式中，所述利用青鲜含糖生物质发酵生产乙醇的方法包括以下步骤：(1)原料压榨：对青鲜含糖生物质原料进行压榨，实现青鲜含糖生物质原料的固液分离，获得青鲜含糖生物质源含糖汁液和青鲜含糖生物质源木质纤维固含物；(2)纤维残渣的处理：将青鲜含糖生物质源木质纤维固含物烘干、粉碎后，再采用预处理方法破坏纤维残渣的结构，获得青鲜含糖生物质源木质纤维固含物的降解处理残渣，以达到有效酶解的目的；(3)种子液的制备：将产乙醇菌株在合成培养基和/或天然培养基中扩增培养，获得用于发酵的种子液；(4)发酵生产乙醇：将青鲜含糖生物质源含糖汁液与青鲜含糖生物质源木质纤维固含物的降解处理残渣混合，加入纤维素酶，接入产乙醇菌株的种子液进行发酵，获得富含乙醇的发酵醪液；在一些优选实施例中，将青鲜含糖生物质源含糖汁液与青鲜含糖生物质源木质纤维固含物混合后，加入尿素、磷酸二氢钾和无水硫酸镁后再用于乙醇的发酵。(5)乙醇分离纯化：将富含乙醇的发酵醪液进行分离纯化制得乙醇产品。所述分离纯化的方法包括普通蒸馏、减压精馏、液液萃取、渗透汽化、蒸汽渗透、汽提、真空抽提和吸附法中的一种或多种。所述分离纯化可以在厌氧发酵终止后进行，或与厌氧发酵过程耦合进行原位分离。本发明所述用语“木质纤维固含物”亦称为“纤维残渣”。本发明的有益效果为：(1)所述方法实现了青鲜含糖植物原料中汁液游离糖分和纤维素糖分的同时利用，提高了生物质原料的利用率，降低了乙醇生产原料的成本。(2)采用所述发酵方式，由于青鲜含糖生物质源含糖汁液在发酵初期的加入，有助于在乙醇发酵初期获得较高的细胞增殖速度和乙醇产率，此外，青鲜含糖生物质源含糖汁液的加入能够有效提高发酵过程中的底物碳源浓度，这样，可以进一步提高发酵产物中乙醇的浓度，解决了传统同步糖化乙醇发酵生产效率低，醪液乙醇浓度低的问题。实施例为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。下述实施例中，主要过程参数及指标的检测方法如下：(1)HPLC法测糖：利用高效液相色谱法(HPLC)使用糖分析柱对其分离继而实现分析。待分析样品经过pH调整后，取1.00g，于8000rpm离心10分钟，上清液稀释100倍，进行液相分析。所使用的糖分析柱为BioRad公司Aminex87P分析柱，液相分析条件是：流速0.6mL/min、柱温65℃、进样量20μL；采用标准品保留时间进行定性分析；采用标准曲线外标法进行定量分析。(2)降解处理纤维残渣的组成分析：首先用乙醇索氏抽提待分析样品，以去除树脂、色素等，然后用72％的浓硫酸和4％的稀硫酸两步水解待分析样品，使木质纤维素中的组分水解成易定量的物质。其中，纤维素、半纤维素水解生成单糖，采用高效液相色谱法进行定量分析，而木质素采用灼烧法进行定量分析。(3)气相色谱法测定乙醇浓度：所使用的分析柱为cbp-20色谱柱。分析条件为：柱温180℃，进样温度90℃，N2为载体，H2为燃烧气，检测器为FID，进样量1.0μL；采用标准品保留时间进行定性分析；采用标准曲线外标法进行定量分析。(4)实施例中所述纤维素酶复配液由山东康地恩生物技术有限公司提供。试纸酶活测定方法如下：取适当稀释酶液，50℃恒温水解whatman1号滤纸60分钟，定义每分钟降解滤纸所产生1ug还原糖的酶量，为一个FPU酶活；其中，还原糖的测定方法采用DNS比色法或HPLC法。实施例1：以青鲜甜高粱秸秆为原料发酵生产乙醇。(1)青鲜甜高粱秸秆的压榨：取1kg大田生长的青鲜甜高粱秸秆，去皮后通过三次反复压榨后获得约654ml含糖汁液和纤维残渣；经HPLC法测定，该含糖汁液中含有约144g/L的游离糖分。此外，通过ICP-MS和凯氏定氮法测得，该含糖汁液中含有的无机离子和氮磷含量如表1所示：表1青鲜甜高粱秸秆源含糖汁液中的无机离子和氮磷含量元素含量(mg/L)K262.76Na17.6Ca143.86Mg263.45Fe2.07Mn0.34P128.69N1480(2)纤维残渣的降解处理：将剩余的约294g纤维残渣于105℃下过夜烘至绝干，得到216g绝干纤维残渣；利用粉碎机将纤维残渣粉碎至50目，之后将绝干纤维残渣以固液比为1:10的比例加入到2％的NaOH溶液中浸泡，于121℃下保温80分钟，之后以减压过滤方式实现固液分离；取滤渣经自来水洗至pH中性，在105℃下过夜烘至绝干，获得经碱法降解处理后的纤维残渣，其主要成分见表2表2碱法降解处理后的青鲜甜高粱秸秆纤维残渣的组成成分百分含量(％)葡萄糖苷54.03木糖苷21.54阿拉伯糖苷0.43半乳糖苷0.13甘露糖苷0.05Klason木质素4.33灰分0.08(3)发酵液的制备：将118.5g经碱法降解处理后的纤维残渣粉碎至60目以下，与步骤(1)中制得的含糖汁液充分混合，置入发酵罐中，在不添加其他外源营养成分的条件下，于121℃下灭菌25分钟，获得发酵液备用。(4)种子液的制备：产乙醇菌株为实验室通过进化工程筛选的耐高温酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeH5。菌株种子合成培养基的组成为(g/L)：蔗糖0.8、葡萄糖20、大豆蛋白胨5、酵母粉3、自来水，并以1mol/LHCl调节pH至5.5。将菌株接种到种子合成培养基中，于35℃、80rpm下摇瓶培养20h，获得种子液。(5)发酵生产乙醇：将种子液以10％的接种量接入到发酵液中，与此同时，加入20FPU/g降解处理纤维残渣的复配纤维素酶液；于转速180rpm、35℃下发酵72h，在发酵结束后，取发酵醪液于10000rpm下离心10分钟；取离心后的上清液以HPLC法测定上清液中的残糖，以气相色谱法测定上清液中乙醇产量，测定结果如表3所示。表3青鲜甜高粱秸秆发酵乙醇结果检测项目发酵结果残糖浓度(g/L)0.3(为果糖、葡萄糖、蔗糖总浓度，不计木糖)乙醇浓度(g/L)88.4乙醇产率(g/Lh)1.23青鲜甜高粱秸杆对乙醇转化率(g/kg)57.5实施例2：以青鲜甜高粱秸秆为原料发酵生产乙醇。步骤(1)、(2)同实施例1。(3)发酵液的制备：将118.5g经碱降解处理后的纤维残渣粉碎至60目，等分为4份，取其中一份与步骤(1)中制得的含糖汁液充分混合，置入发酵罐中；此外，向发酵罐中额外加入1.7g/L尿素、1g/L磷酸二氢钾，2g/L无水硫酸镁，于121℃下灭菌25min，获得发酵液，备用。(4)种子液的制备：产乙醇菌株为实验室通过进化工程筛选到的耐高温酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeH5。菌株种子合成培养基的组成为(g/L)：蔗糖0.8、葡萄糖20、大豆蛋白胨5、酵母粉3、自来水，并以1mol/LHCl调节pH至5.5。将菌株接种到种子合成培养基中，于37℃、200rpm下摇瓶培养20h，获得种子液。(5)发酵生产乙醇：将种子液以5％的接种量接入到发酵液中，与此同时，加入25FPU/g降解处理纤维残渣的复配纤维素酶液；于转速200rpm、37℃下进行乙醇发酵，待发酵至12、24、36h时，依次加入步骤(3)中分装好的其它3等份经碱处理后的纤维残渣，以25FPU/g降解处理纤维残渣的酶添加量，加入相应的复配纤维素酶液，至72h发酵终止，取发酵液于10000rpm下离心10分钟；取离心后的上清液以HPLC法测定液体中的残糖，以气相色谱法测定液体中乙醇产量，测定结果如表4所示：表4青鲜甜高粱秸秆发酵乙醇结果实施例3：以青鲜玉米秸秆为原料发酵生产乙醇。(1)青鲜玉米秸秆的压榨：取1kg大田生长，已收获成熟玉米籽粒的青鲜玉米杆，去皮后通过三次反复压榨后获得约574ml含糖汁液和纤维残渣；经HPLC法测定，该含糖汁液中含有约97g/L的游离糖分。此外，通过ICP-MS和凯氏定氮法测得，该含糖汁液中含有的无机离子和氮磷含量如表5所示：表5青鲜玉米秸秆含糖汁液中的无机离子和氮磷含量元素含量(mg/L)K362.48Na11.04Ca238.68Mg468.10Fe3.30Mn1.14P154.86N1128.20(2)纤维残渣的降解处理：将剩余的约380g纤维残渣于105℃下过夜烘至绝干，获得256g绝干纤维残渣；将绝干纤维残渣粉碎至40目，以固液比为1:10的比例加入到2％的稀硫酸中浸泡，于121℃下保温60分钟，之后以减压过滤方式实现固液分离；取滤渣经自来水洗至pH中性，在105℃下过夜烘至绝干，获得经酸降解处理后的纤维残渣，其主要成分见表6。表6酸降解处理后的青鲜玉米秸秆纤维残渣的组成(3)发酵液的制备：将256g经酸降解处理后的纤维残渣粉碎至80目以下，取其中57.4g按照固液比为1:10的比例与步骤(1)中制得的含糖汁液充分混合，置入发酵罐中；此外，向发酵罐中额外加入2g/L尿素、1.5g/L磷酸二氢钾，1g/L无水硫酸镁，于121℃下灭菌25分钟，获得发酵液备用。(4)种子液的制备：产乙醇菌株为实验室通过进化工程筛选到的耐高温酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeH5。菌株的种子合成培养基的组成为(g/L)：蔗糖0.8、葡萄糖20、大豆蛋白胨5、酵母粉3、自来水，并以1mol/LHCl调节pH至5.5。将菌株接种到种子合成培养基中，于35℃、200rpm下摇瓶培养20h，获得种子液。(5)发酵生产乙醇：将种子液以10％的接种量接入到发酵液中，于转速200rpm、35℃下进行乙醇发酵，发酵过程中对发酵液中的残糖进行实时监控，待发酵液总残糖浓度低于5g/L时，加入15FPU/g降解处理纤维残渣的复配纤维素酶液，继续发酵，至72h发酵终止，取发酵液于10000rpm下离心10分钟；取离心后的上清液以HPLC法测定液体中的残糖，以气相色谱法测定液体中乙醇产量，测定结果如表7所示：表7青鲜玉米秸秆发酵乙醇结果检测项目发酵结果残糖浓度(g/L)0.2(为果糖、葡萄糖、蔗糖总浓度，不计木糖)乙醇浓度(g/L)68.83乙醇产率(g/Lh)0.96应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。当前第1页1 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