一种生物乳化剂及其应用的制作方法

本发明属于生物活性分子制备技术领域，具体涉及一种生物乳化剂及其应用。

背景技术：

生物乳化剂是一种具有乳化活性的双亲生物大分子化合物，一般由糖、脂、蛋白质聚合而成，分子中均含有亲水基团和疏水基团，且其种类较多，功能特殊、结构复杂，是一种在生命过程中表现出重要生理和代谢活性的生物大分子化合物，有研究表明，乳化活性与乳化剂的分子结构有密切联系特别是蛋白质结构变化对乳化活性都有极大的影响，亲水基团和疏水基团是乳化活性的基础，其中的亲水基团一般都是多糖结构，含有极性羟基、羧基和酰胺基，表现出良好的亲水性；而疏水基团一般都是蛋白/脂质化合物，结构中含有非极性的烷基链(碳氢)，表现出良好的疏水性。蛋白质通过酯键、酰胺键或糖苷键一端连接糖结构，另一端连接脂质，从而形成稳定的大分子化合物，并且可以降低界面张力，将液体以液滴形式分散在另一不相混溶的液体中形成均匀稳定的分散体系，蛋白质在这过程中发挥了重要的作用。

油泥也叫含油污泥，是在石油生产、运输、加工过程中产生的最严重的环境污染源之一，包括多种有毒有害、难生物降解的物质；固体物中含有多种金属、催化剂粉末、土和泥沙等；另外，石油行业年产污泥1500万吨，这对生态环境造成了严重的危害。所以，1998年原国家环保总局将含油污泥列入《国家危险废物名录》，2011年国家环保部提出的“关于进一步加强危险废物和医疗废物监管工作的意见”又明确要求到2015年，危险废物产生单位的规范化管理抽查合格率达到90％；同时，2015年新修订的《环境保护法》对其做出了最严厉的要求，这给尚未完善相关治理技术和措施的石油开采和加工企业的发展带来前所未有的压力。

在现有的修复技术和石油回收工艺中，物理、化学修复存在着一定的局限性，很难达完全达到修复要求，而回收工艺又具有效率慢，二次污染严重等问题。与化学、物理修复相比，生物方法绿色环保，投入产出比高，对人和环境造成的影响很小，且具有成本低廉、不会造成二次污染和操作简便等优势。因此，利用生物乳化剂能形成均匀稳定的分散体系的特性，特别是乳化剂中蛋白质组分的纯化及其结构研究，对在油水分离、含油污泥脱油等领域的应用具有巨大的指导意义。因此，获得乳化效果突出的乳化剂一直是本领域的研究热点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种生物乳化剂及其应用，以弥补现有技术的不足。

本发明所提供的生物乳化剂，是从地衣芽孢杆菌属XS2-450菌株(Geobacillus pallidus)，该菌株的保藏号为CGMCC No.9430，于2014年07月09日保藏位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明所提供的生物乳化剂，其制备方法如下：

1)粗提物的制备

将菌株接到发酵培养基中进行培养，培养温度为60℃，180rpm振荡培养；接种量10％(v/v)；然后添加棕榈油至终浓度为0.1％作为诱导剂进行发酵，发酵液除去菌体得到的上清液为乳化剂的粗提物；

2)盐析处理

将步骤1)制备的乳化剂粗提物用40％浓度的(NH₄)₂SO₄进行盐析，盐析结束后除去沉淀得到上清液；

3)热处理

将步骤2)获得的上清液在80℃处理30min，在4℃，10000rpm的条件下离心30min除去沉淀，获得的上清液为含有生物乳化剂的溶液。

作为实施例的优选，所述的发酵培养基的配比如下：葡萄糖2％，硝酸钠0.3％，磷酸二氢钾0.042％，磷酸氢二钾0.12％，硫酸亚铁0.005％，硫酸镁0.05％，氯化钙0.005％，pH为7.5。

本发明获得的生物乳化剂用于处理高粘度、重质烃类污染的油泥。

本发明获得的乳化剂的乳化活性可以达到83.2％，对液体石蜡的乳化稳定性在30d后仍保持72.8％。同时该生物乳化剂应用于处置高粘度、重质烃类污染的油泥具有很好的脱油效果，能使油泥中的含油量由原来的26.2％降低到了现在的1.5％，含油量降低94％以上，与物理、化学方法相比可节约成本30％，在节约成本、保护环境的同时展现出了重大的经济效益和规模化应用的潜力。

附图说明

图1：不同(NH₄)₂SO₄浓度梯度条件下制备的乳化剂的乳化活性(E24)。

图2：不同温度梯度条件下制备的乳化剂的乳化活性(E24)。

图3：本发明中制备的乳化剂与乳化剂粗提物的乳化活性对比。

图4：本发明中制备的乳化剂对液体石蜡的稳定性结果。

图5：本发明中制备的乳化剂与乳化剂粗提物的乳化稳定性对比。

图6：处理前后的油泥对比。

具体实施方式

申请人在使用保藏编号为CGMCC No.9430的地衣芽孢杆菌属XS2-450菌株的发酵液作为乳化剂使用时发现，该乳化剂的乳化活性偏低，在一些物质的乳化活性不稳定，且脱油效果不佳。因此，对发酵液进行处理，从而获得效果更好的乳化剂。下面结合实施例对本发明中活性菌株Geobacillus sp.XS2-450产生物乳化剂的制备方法、乳化活性及在含油污泥应用方面进行了详细的描述。

实施例1：乳化剂的制备

1)粗提物的制备

将活性菌株Geobacillus sp.XS2-450摇床60℃，180rpm振荡培养10h作为发酵用种子液，接种量10％(v/v)，接种到发酵培养基中，在发酵12h时添加终浓度为0.1％的棕榈油作为产生高活性生物乳化剂的诱导剂，产乳化剂发酵液培养时间为24h，将得到的发酵液在4℃，5000rpm的条件下离心30min除去菌体，得到的上清液为乳化剂的粗提物。粗提物进行浓缩至原上清液至1/5体积，4℃条件下保存。

2)盐析处理

取20ml步骤1)制备的乳化剂粗提物加入硫酸铵颗粒使其分别达到10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的饱和度，在室温下搅拌1h，之后在4℃条件下放置4h，将不同饱和度的硫酸铵溶液在4℃,10000rpm的条件下离心30min除去沉淀，测定含有乳化剂上清液的乳化活性。

结果如图1所示，与其它浓度条件下的(NH₄)₂SO₄梯度盐析获得的上清液相比，在40％硫酸铵进行盐析的条件下，其上清液的乳化活性达到最高，(E24＝79.8％)；所以，选用饱和度为40％的硫酸铵进行乳化剂的制备，将得到的样品用于后续实验过程中。

3)热处理

活性菌株Geobacillus sp.XS2-450的最适生长温度为60℃且其产生的生物乳化剂在100℃时还能保持在50％左右；据此设置不同的温度梯度(60℃、70℃、80℃、90℃、100℃)处理30min，在4℃,10000rpm的条件下离心30min除去沉淀，获得的上清液即为本发明制备的乳化剂。测定上清液中所含有乳化剂的乳化活性。

结果如图2所示，温度处理后乳化剂的活性在80℃,30min条件下其活性(E24＝83.2％)；所以，选用温度为80℃，30min处理作为乳化剂的制备方法。

将此条件下的乳化剂的活性与XS2-450菌株的发酵液直接作为乳化剂的乳化活性相比较，活性得到了明显的提高，结果如图3(其中a为实施例1中制备的乳化剂，b为XS2-450菌株的发酵液)所示，其乳化活性E24＝83.2％，活性相对提高了10.2％。

实施例2实施例1制备的乳化剂的稳定性

将实施例1制备的乳化剂与等体积的液体石蜡混合，涡旋震荡3min，分别静置24h，15d，30d，检测并记录乳化活性变化过程。

结果如图4所示，实施例1制备的乳化剂对液体石蜡的乳化稳定性24h后83.2％,30d后仍保持72.8％。

将实施例1制备的乳化剂的稳定性与XS2-450菌株的发酵液的乳化稳定性相比较，稳定性了也得到了明显的提升；结果如图5所示(其中a为实施例1中制备的乳化剂，b为XS2-450菌株的发酵液)，在第30d后实施例1制备的乳化剂对液体石蜡的乳化稳定性相比乳化剂粗提物的稳定性提高了7.9％。

实施例3：实施例1制备的乳化剂的效果

本发明主要利用实施例1中制备的生物乳化剂处理高粘度、重质烃类污染的油泥。

将油泥搅拌使其均质化，调配油泥、生物乳化剂的比例使其达到4:5，加入10倍于油泥的水，在60℃条件下充分搅拌，使其乳化油泥中的原油，静置，沉降的油渣进行深度脱油，脱除残余高黏成分，从而达到油泥中的油和残渣分离的目的，最后将乳化的上层原油全部进行回收。在处理过程中对油泥含油量进行监测，油泥中的含油量由原来的26.2％降低到了现在的1.5％，含油量降低94％以上，处理前后油泥如图6所示，符合油泥处置标准；与物理、化学处理方法相比可节约成本30％以上，由此可见其有很大的应用价值。