一种敲除猪胚胎p66shc基因的方法与流程

本发明主要涉及胚胎工程技术和基因工程领域，具体地说，涉及一种利用CRISPR/Cas9基因编辑方法构建敲除p66^shc基因猪胚胎的方法。

背景技术：

早期胚胎的发育与培养环境中的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平有很大的关系。已有研究结果显表明，过氧化氢的存在会诱导小鼠受精卵在体外培养过程中发生周期性停滞、凋亡、坏死等生物学事件^[13]。轻微的氧化损伤最初导致线粒体内膜去极化，线粒体基质和细胞内线粒体分布改变；研究发现用H₂O₂处理48h后，受精卵皱缩，72h后发育停滞，出现DNA碎片，表明在胚胎发育的早期，氧化损伤线粒体致线粒体功能不良，可能导致细胞周期停滞和凋亡的主要原因^[13]。有研究表明，胚胎p66^shc(66-kilodahon isoform of Shc gene products)的表达与ROS水平有着密切的关系，而且研究发现，发现牛早期胚胎发育阻滞中胚胎中的p66^shc mRNA水平要显著高于正常的胚胎^[10]。大约有14％左右的牛体外生产胚胎阻滞在分裂的2-4细胞阶段，在这些阻滞的胚胎中发现有大量的ROS存在，主要以H₂O₂形式存在，这些ROS的产生及数量随着在体外胚胎发育进程而增加；相对于体内胚胎，体外发育胚胎的ROS水平要高得多，产生的这些ROS会对胚胎产生不利的影响，会使得DNA链断裂及蛋白的氧化水平提高等^[17,18]。已有研究也表明，产生的ROS水平能够引起胚胎发生凋亡，影响胚胎体外发育的效率，同时研究表明p66^shc能够识别由ROS引起的DNA破坏^[1]。为此，通过降低胚胎内部p66^shc的表达，就能降低胚胎内ROS的产生，从而提高猪胚胎体外发育效率。

众所周知，CRISPR-Cas系统(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats-associated proteinsystems)是细菌及古细菌进化出来用以抵御病毒和质粒入侵的适应性机制。CRISPR-Ca系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括斑马鱼、小鼠、大鼠、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活样效应核酸酶(Transcriptionactivator-like effector nucleases,TALEN)相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在细胞或斑马鱼中显示出相似甚至更高的效率。CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为选择性基因组编辑提供了一个简便而强大的工具。在实际应用中，CRISPR/Cas系统通常会把两个编码trancRNA与crRNA的基因结合成一个单链向导RNA(sgRNA)，即现在运用的CRISPR/Cas系统主要是由Cas9蛋白和sgRNA组成。该体系其中一个最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的sgRNA(small guide RNA)的引导下同时修饰多个基因组靶点。

基于上述的思路，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑方法在胚胎早期(原核注射方法)，敲除掉p66^shc基因，降低胚胎的ROS表达，通过筛选阳性胚胎，进行后续的研究性工作，从而最终建立高效的猪胚胎体外生产技术体系。

技术实现要素：

本发明旨在构建一种的敲除p66^shc基因猪胚胎生产体系，降低体外胚胎培养过程中的ROS水平，从而通过减少体外培养过程中的损伤等，提高猪胚胎体外生产的效率，最终构建有效的猪胚胎体外生产体系。

为了实现本发明的目的，本发明首先提供一种利用CRISPR-Cas9基因编辑方法敲除主胚胎中p66^shc的方法，具体的操作步骤如下：

(1)设计Oligo DNA序列

在p66^shc基因的表达DNA区域中设计一对20bp左右的oligo DNA，可以通过在线工具设计。按照得分优先选择1-3对的Oligo合成。另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续PCR或测序检测阳性克隆，引物能扩增约300bp的DNA片段，上游引物距突变位点约100bp，下游引物距突变位点约200bp。将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE，准备进行下面的实验。

(2)Oligo的连接

将合成的2条单链Oligo DNA稀释至1μg/μl后，退火形成双链DNA，再与载体连接。pGLKO(Genloci公司购买)是线性载体，无需酶切处理，可直接用于T4 DNA连接酶连接反应。

(3)构建好的质粒转化与扩增

将上述产物按照常规分子克隆技术方法转化到大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，挑取阳性克隆扩增培养后，大量提取质粒，得到构建好的包含敲除p66^shc基因的CRISPR-Cas9系统的表达质粒，保存备用。

(4)质粒转染细胞验证敲除效率

首先解冻培养293T细胞，待生长培养传代2次后，进行转染操作。共转染前提，稀释至质粒浓度为1μg/μl，转染前48小时，接种细胞至备用生产慢病毒的孔板或是培养皿中，转染时，细胞汇合度约为70％-80％为最佳感染状态，活力≥95％以上。以转染时间为起始点，一次收获时间为24h后收获上清，保存于4℃下，如长期保存则在-84℃下。接种适量靶细胞，加入上述收集的含有质粒的病毒颗粒溶液，混匀。将靶细胞有限稀释后，分到96孔板中进行单克隆培养，待细胞长好后，取1000个左右的细胞，提基因组。然后使用T7核酸内切酶初步筛选阳性克隆，并且对筛选后的阳性克隆进行测序分析，并对碱基缺失结果进行比对分析，从而可以验证该p66^shc基因CRISPR-Cas9系统的有效性。

(5)p66^shc基因的CRISPR-Cas9系统构建

设计好上述质粒上Cas9的引物，试剂盒mMESSAGEmMACHINE Ultra Kit(Ambion)其扩增上述得到的Cas9 mRNA，同时用设计好的引物利用试剂盒MEGAshortscript(Ambion)扩增gRNA的序列。得到PCR产物后分别用1.5％凝胶进行电泳，辨认其得到的片段大小。得到p66^shc基因的CRISPR-Cas9系统mRNA后，保存备用。

(6)猪p66^shc基因敲除胚胎生产

把构建好的猪胚胎，在受精后17h进行胞质注射上述p66^shc基因的CRISPR-Cas9系统mRNA，按照浓度为10ng/ul，其每个胚胎注射的总量为3ul。在培养后，利用后续的系统检验该基因的敲除效果，评价其敲除效率。

(7)p66^shc基因敲除结果验证

PCR克隆囊胚后的p66^shc基因DNA序列(一般产物在0.5-1K为好)，其引物设计注意得到的产物的突变位点不要位于中间比较好，利用T7内切酶酶切后，凝胶电泳分析，确认其是不是已经敲除。同时，还可以结合利用PCR产物测序后对比分析得出结论。

附图说明

图1为通过筛选获得三对p66^shc基因的CRISPR-Cas9系统的Oligo引物。

图2为试验中涉及的载体结构图，用于链接gRNA和表达用于胚胎注射的mRNA合成模板序列。

图3为验证其构建p66^shc基因的CRISPR-Cas9系统的敲除效率的酶切示意图。

具体实施方式

(1)设计Oligo DNA序列

首先，在猪流产胎儿组织中提取总的DNA，通过设计p66^shc基因的上游引物和反向的下游引物PCR克隆p66^shc基因全长，然后进行DNA测序，保存序列，分析其启动子区域备用。接着，在p66^shc基因的表达DNA区域中设计一对20bp左右的oligo DNA，可以通过以下在线工具设计：麻省理工学院的CRISPR Design (http://crispr.mit.edu/)或德国癌症研究中心的E-Crisp(www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)。按照得分优先选择1-3对的Oligo合成。通过在线设计，选择得到如下较好的3对Oligo:

(1).TCAATAAGCCCACGCGGGGCTGG

(2).CCGGGGTTTCCTACTTGGTTCGG

(3).GCGAGGAGTGGACCCGCCACGGG

由此按照连接质粒的要求，分别换成以下3对引物

(1)p66^shc-F:5’…accgGTCAATAAGCCCACGCGGGGC…3’

p66^shc-R:5’…aaacGCCCCCGCGTGGGCTTATTGAC…3’

(2)p66^shc-F:5’…accgGCCGGGGTTTCCTACTTGGTT…3’

p66^shc-R:5’…aaacGAACCAAGTGGAAACCCCGGC…3’

(3)p66^shc-F:5’…accgGCGAGGAGTGGACCCGCCACG…3’

p66^shc-R:5’…aaacGCGTGGCGGGTCCACTCCTCGC…3’

将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE，准备进行下面的实验。

(2)T4 DNA Ligase连接

将合成的2条单链Oligo DNA稀释至1μg/μl后，退火形成双链DNA，再与载体连接。pGLKO线性载体，无需酶切处理，可直接用于T4 DNA连接酶连接反应，退火反应体系如下：

将以上体系瞬时离心后，置于PCR仪中95℃孵育3min，孵育后自然冷却20min。取1.75μl的杂交后的双链DNA进行T4连接酶连接反应，反应体系如下：

(3)构建好的质粒转化与扩增

将上述产物按照常规分子克隆技术方法转化到大肠杆菌感受态细胞，其具体操作过程如下：在LB平板上挑取DH5α的单个菌落接种于3.0mL LB液体培养基中，200rpm过夜振荡培养；次日按2％的体积接种于新的LB培养基中，200rpm震荡培养3～4h至OD600＝0.3～0.5；将细菌转移至1.5mL的灭菌离心管中，每管1.0mL，冰浴30min；4℃12000rpm离心30s；完全弃去上清，用1.0mL 0.1mol/L冰冷的CaCl2重悬细菌，冰浴10min；4℃12000rpm离心30s；完全弃上清，用100μL 0.1mol/L冰冷的CaCl2重悬细菌，放置4℃冰箱24h内备用。取质粒1.0μL(适量)加入到100μL新鲜制备的大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；然后置42℃水浴中热休克90s，迅速置冰中冷却1～2min；每管加入预热的800μL LB培养基，37℃200rpm震荡培养45min；取100μL菌液，然后涂布于相应抗性平板上，37℃培养16～24h。

筛选阳性克隆，挑取阳性克隆扩增培养后，大量提取质粒，具体的操作步骤如下：挑取外源基因与载体连接产物转化所涂布抗性平板上的单个菌落，接种于3.0mL的含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，200rpm过夜振荡培养。取1.5mL菌液，12000rpm离心30s，沉淀菌体；完全弃去上清后加入300μL 4℃预冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris-Cl，pH8.0；10mmol/L EDTA)重悬细菌；加入新配制的溶液II 300μL(0.2mol/L NaOH；1％SDS)，快速颠倒离心管5次，将离心管置于冰上；加入225μL用冰预冷的溶液III(5mol/L乙酸钾60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL)，盖紧管口，将管倒置后温和颠倒至蛋白变性成白色团块，置冰上3～5min；4℃12000rpm离心5min，将上清移至新的离心管中；加入等体积的酚∶氯仿，颠倒混匀后置室温5min，12000rpm离心5min；取上清到新的离心管，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min；12000rpm离心l0min，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀一次，干燥，加入30μL的TE(pH8.0)或双蒸水溶解；加入1μL RNase A(10mg/mL)，37℃作用30min。

得到构建好的包含敲除p66^shc基因的CRISPR-Cas9系统的表达质粒，保存备用。

(4)质粒转染细胞验证敲除效率

首先解冻培养293T细胞，待生长培养传代2次后，进行转染操作。共转染前提，稀释至质粒浓度为1μg/μl，转染前48小时，接种细胞至备用生产慢病毒的孔板或是培养皿中，转染时，细胞汇合度约为70％-80％为最佳感染状态，活力≥95％以上。其具体操作过程如下：

(1).加入800ul 0.25％胰酶消化大概30s，随时观察细胞形态，消化结束，加入2倍胰酶体积的完全培养基终止消化，吹打均匀；

(2).5℃，900rpm，离心5min，去上清；

(3).加入1ml PBS，重悬后，25℃，900rpm，离心5min，去上清，重复此步骤1-2次；

(4).加入200ul无血清的培养基，重悬细胞，各加入5μl pGLKO线性载体(Genloci公司)和Packaging Mix(Genloci公司)；

(5).离心过程中，可准备电转设备，开通电源，移液枪吸取200ul的细胞悬液至电极管中(保证不要出现起泡)，按照1200V，20ms，2次脉冲的电转条件进行电转；

(6).电转结束，放入预先准备好的孔板或是培养皿中，加入适量的含血清浓度为2％～10％的DMEM培养基，细胞培养箱培养。

以转染时间为起始点，一次收获时间为24h后收获上清，保存于4℃下，如长期保存则在-84℃下。接种适量靶细胞，加入上述收集的含有质粒的病毒颗粒溶液，混匀。将靶细胞有限稀释后，分到96 孔板中进行单克隆培养，待细胞长好后，取1000个左右的细胞，提基因组。然后使用T7核酸内切酶初步筛选阳性克隆，并且对筛选后的阳性克隆进行测序分析，并对碱基缺失结果进行比对分析，从而可以验证该p66^shc基因CRISPR-Cas9系统的有效性。

(5)p66^shc基因的CRISPR-Cas9系统构建

设计好上述质粒上Cas9的引物，试剂盒mMESSAGEmMACHINE Ultra Kit(Ambion)其扩增上述得到的Cas9 mRNA，同时用设计好的引物利用试剂盒MEGAshortscript(Ambion)扩增gRNA的序列。得到PCR产物后分别用1.5％凝胶进行电泳，辨认其得到的片段大小。得到p66^shc基因的CRISPR-Cas9系统mRNA后，保存备用。

(6)猪合子胚胎注射

把构建好的猪胚胎，在受精后17h进行胞质注射上述p66^shc基因的CRISPR-Cas9系统mRNA，按照浓度为10ng/ul，其每个胚胎注射的总量为3ul。并且按照CRISPR-Cas9系统胚胎组、注射缓冲胚胎组和不注射胚胎组三组进行对比性注射。注射完成后，培养4-6小时，观察胚胎的存活情况，选择质量良好的胚胎进行后续的培养，培养6天后观察。

(7)胚胎发育效率比较

注射p66^shc基因的CRISPR-Cas9系统胚胎组、注射缓冲胚胎组和不注射胚胎组(对照组)在体外进行后续培养。在胚胎培养液洗2～3遍后转入25μL微滴中，上盖矿物油，每滴1-2枚胚胎，38.5℃，饱和湿度，5％CO2培养。44～48h后记录卵裂数，分别在第6和7天时记录桑椹胚和囊胚数，观察不同组别的卵裂率，囊胚胎率等指标。

(8)p66^shc基因敲除结果验证

选择发育到囊胚的胚胎通过吸取滋养层5-10个细胞进行RT-PCR检测p66^shc基因是不是表达，同时计算其敲除的效率。PCR克隆囊胚后的p66^shc基因DNA序列(一般产物在0.5-1K为好)，其引物设计注意得到的产物的突变位点不要位于中间比较好，利用T7内切酶酶切后，凝胶电泳分析，确认其是不是已经敲除。同时，还可以结合利用PCR产物测序后对比分析得出结论。

下表为p66^shc基因的CRISPR-Cas9系统的Oligo引物设计

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