表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法与流程

本发明属于细胞工程技术领域，涉及一种用嵌合抗原受体修饰后T细胞的扩增培养与保存方法，具体涉及一种表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法。

背景技术：
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淋巴T细胞是构成细胞免疫的主要成分，而利用基因工程使T细胞表达嵌合抗原受体能使T细胞转化成为具有特异性杀伤肿瘤细胞的效应细胞，是一种有前景的肿瘤免疫治疗策略。嵌合性抗原受体应用的关键是确定一种肿瘤相关抗原，这种抗原具有在肿瘤细胞表面过表达或高表达，而在正常组织无表达或低表达，CD19在早期B细胞的发育中扮演重要的角色，所有的急性白血病都表达CD19。CD20表达于90％以上的B淋巴瘤细胞和正常B淋巴细胞，而在造血干细胞、原始B淋巴细胞、正常血细胞以及其他组织上不表达。因此，CD19和CD20可作为恶性淋巴细胞白血病免疫治疗的一种有效的靶抗原。构建靶向CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体慢病毒，并将其高效率的转染至T淋巴细胞，对转染后的淋巴T细胞扩增培养并保存是对恶性B淋巴细胞白血病细胞免疫治疗的前提关键。因此，本发明提供一种用于人T细胞的慢病毒转化及扩增培养与保存的方法，对于恶性B淋巴细胞白血病细胞免疫治疗具有重要临床意义。

技术实现要素：
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针对现有技术存在的问题，本发明的目的旨在提供一种表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法。

为达到上述目的，本发明采取以下技术方案：

表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法，包括如下步骤：

S1：将分离获得的CD4和CD8阳性T细胞悬浮于含人血清AB和细胞介素-2(IL-2)的培养基中，经T细胞激活试剂在37℃，5％CO₂孵育箱中进行培养激活；

所述含有人血清AB和细胞介素-2的培养基为含2％的人血清AB和200单位/mL的细胞介素-2的T细胞培养基，其是一种无异源成分的无血清培养基，专门用于人T细胞的生长和扩增。

所述T细胞激活试剂采用TransAct CD3/28。

S2：经T细胞激活试剂激活后，将T细胞转移至离心管中，离心后取上清；

S3：将上述上清倾倒至另一离心管中备用，轻弹有细胞沉淀的离心管底部使细胞分散，将细胞重新悬浮于收集备用的上清中，移出少量细胞悬液计数；

S4：用备用的离心上清调整细胞浓度，然后接种于培养板中；

所述备用的离心上清调整细胞浓度为0.5X10⁶/mL，按0.5X10⁶/1mL/孔的量接种于六孔培养板中。

S5：将慢病毒从-80℃条件下取出，于室温中融化后，加入到上述含有T细胞的培养板中，混匀，置37℃，5％CO₂孵育箱中进行孵育；

所述加入含有T细胞的培养板中的慢病毒用量根据病毒的感染滴度，按照感染复数(multiplicity ofinfection，MOI)5计算病毒用量。

S6：待孵育结束时，向培养板中加入含人血清AB和细胞介素-2的培养基，混匀，置37℃，5％CO₂孵育箱中进行孵育(如果收集备用的离心上清没有用完，可与上述培养基混合然后加入孔中)；

所述含有人血清AB和细胞介素-2的培养基为含2％的人血清AB和200单位/mL的细胞介素-2的T细胞培养基，其是一种无异源成分的无血清培养基，专门用于人T细胞的生长和扩增。

S7：孵育后进行T细胞的收集，并取少量细胞计数计算总细胞数和细胞存活率，同时用流式细胞仪检测CD19和CD20的表达水平；

S8：将收集的T细胞转移至加有含人血清AB和细胞介素-2的培养基的G-Rex100培养装置中，置37℃，5％CO₂孵育箱中进行扩增培养，中间无需换液或其他处理，尽量减少对细胞的干扰(根据培养板的细胞采用G-Rex100培养装置的数量，如一个六孔板的细胞用一个G-Rex100)；

所述含有人血清AB和细胞介素-2的培养基为含2％的人血清AB和200单位/mL的细胞介素-2的T细胞培养基，其是一种无异源成分的无血清培养基，专门用于人T细胞的生长和扩增。

S9：待细胞培养结束后，收获扩增细胞，并取少量细胞计数计算总细胞数和细胞存活率，同时用流式细胞仪检测CD19和CD20的表达水平，另取部分细胞进行支原体检测和内毒素检测；

S10：将剩余细胞进行离心，并弃上清，再用复方电解质注射液洗涤细胞一次，再次进行离心后，即得细胞沉淀悬浮细胞；

S11：按照不同的治疗剂量将细胞沉淀悬浮细胞置于细胞冻存液中，并转移到细胞冻存袋中，此时移出1mL细胞进行无菌检测；

所述细胞冻存液包括24％的复方电解质注射液，10％的DMSO，8％的人血清白蛋白。

S12：在将细胞沉淀悬浮细胞于细胞冻存液之前，启动细胞冻存程序；

所述细胞冻存程序，具体包括如下步骤：

a.启动细胞冻存程序，使细胞冻存室温度降至4℃；

b.将含有细胞的冻存袋移至冻存室，继续运行冻存程序；

c.细胞中温度降低1℃/min至-11.5℃；

d.冻存室中温度降低20℃/min至-55℃；

e.冻存室中温度降低15℃/min至-25℃；

f.冻存室中温度降低1℃/min至-45℃；

g.冻存室中温度降低10℃/min至-100℃。

S13：待细胞温度降到-90℃，细胞冻存完成；

S14：将冻存好的细胞移至液氮中进行长期保存。

本发明表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法，通过构建靶向CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体慢病毒，并将其高效率的转染至T淋巴细胞，对转染后的淋巴T细胞进行了扩增培养并保存，使CD19和CD20作为恶性淋巴细胞白血病免疫治疗的一种有效的靶抗原，对于恶性B淋巴细胞白血病细胞免疫治疗具有重要临床意义。

附图说明：

图1是本发明实施例中表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体T细胞的扩增结果示意图；

图2是实施例中表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体T细胞培养于G-Rex100培养装置中的图片；

图3是实施例中冰冻保存的表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体T细胞。

具体实施方式：

下面对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1

一种表达CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体T细胞的转化及扩增培养与保存方法，包括如下步骤：

S1：将分离获得的CD4和CD8阳性T细胞悬浮于含2％的人血清AB和200单位/mL的细胞介素-2的T细胞培养基中，经T细胞激活试剂在37℃，5％CO₂孵育箱中进行培养激活；

S2：经T细胞激活试剂激活作用一天后，将T细胞转移至离心管中，300r离心10min后取上清；

S3：将上清倾倒至另一离心管中备用，轻弹有细胞沉淀的离心管底部使细胞分散，将细胞重新悬浮于收集备用的上清中，移出少量细胞悬液计数；

S4：用备用的离心上清调整细胞浓度为0.5X10⁶/mL，然后按0.5X10⁶/1mL/孔的量接种于六孔培养板中；

S5：将慢病毒从-80℃条件下取出，于室温中融化后，加入到上述含有T细胞的六孔培养板中，混匀，置37℃，5％CO₂孵育箱中进行孵育6h；

S6：待孵育结束时，向六孔培养板中每孔加入1mL含2％的人血清AB和200单位/mL的细胞介素-2的T细胞培养基，混匀，置37℃，5％CO₂孵育箱中进行孵育4天(如果收集备用的离心上清没有用完，可与上述培养基混合然后加入孔中)；

S7：孵育4天后进行T细胞的收集，并取少量细胞计数计算总细胞数和细胞存活率，同时用流式细胞仪检测CD19和CD20的表达水平；

S8：将收集的T细胞转移至加有含2％的人血清AB和200单位/mL的细胞介素-2的T细胞培养基的G-Rex100培养装置中，如图2所示，至培养基体积到450mL，置37℃，5％CO₂孵育箱中进行扩增培养8天，中间无需换液或其他处理，尽量减少对细胞的干扰；

S9：待细胞培养至7天结束后，收获扩增细胞，并取少量细胞计数计算总细胞数和细胞存活率，同时用流式细胞仪检测CD19和CD20的表达水平，另取部分细胞进行支原体检测和内毒素检测；

S10：将剩余细胞进行300g离心10min，并弃上清，再用复方电解质注射液洗涤细胞一次，再次进行300g离心10min后，即得细胞沉淀悬浮细胞；

S11：如图3所示，按照不同的治疗剂量将细胞沉淀悬浮细胞置于细胞冻存液中，并转移到细胞冻存袋中，此时移出1mL细胞进行无菌检测；

S12：在将细胞沉淀悬浮细胞于细胞冻存液之前，启动细胞冻存程序；

所述细胞冻存程序，具体包括如下步骤：

a.启动细胞冻存程序，使细胞冻存室温度降至4℃；

b.将含有细胞的冻存袋移至冻存室，继续运行冻存程序；

c.细胞中温度降低1℃/min至-11.5℃；

d.冻存室中温度降低20℃/min至-55℃；

e.冻存室中温度降低15℃/min至-25℃；

f.冻存室中温度降低1℃/min至-45℃；

g.冻存室中温度降低10℃/min至-100℃。

S13：待细胞温度降到-90℃，细胞冻存完成；

S14：将冻存好的细胞移至液氮中进行长期保存。

如图1所示，为表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体T细胞的扩增结果可知：T细胞培养第5天至第13天之间细胞扩增的数量增至1750*10⁶到2200*10⁶，然后可计算总细胞数和细胞存活率。