本发明涉及到靶向抗癌药物的开发，属于生物医药或诊断试剂领域。
背景技术：
：：notch信号在进化上非常保守，对决定细胞的命运起着关键作用。notch信号参与调控各种正常和非正常的生理功能,在许多肿瘤中发挥着很重要的调控作用，但是，在不同肿瘤中，notch信号都可能发挥不同的作用。了解notch信号在特定肿瘤中的作用及作用机理对寻找靶向抗癌药物将非常有利。如，在肝癌的研究中，越来越多的证据表明notch信号与肝癌发生与维持有非常紧密的联系。与肝癌紧密相关的乙肝病毒x蛋白(hbx)能够激活notch信号，notch受体在绝大多数肝癌病人肝癌组织中也比周围正常组织中表达量异常高，同时，激活notch信号可促进细胞生长和肝癌发生，而抑制notch信号则可抑制细胞生长。notch2在肝癌，白血病等癌症细胞中作为癌基因发挥致癌作用。因此，notch2可以作为一个受体靶点开发靶向抗肿瘤药物。单克隆抗体(monoclonalantibody，mab)是药物开发的一个新的热点方向。单克隆抗体是大分子蛋白，特异性很强，亲和力很高，稳定性很好。这些抗体可以用于疾病治疗，疾病诊断或者健康检查。目前，全球已有几十个临床用mab药物如adalimumab，这些药物被用于抗肿瘤治疗，自身免疫病等人类疾病。在全球生物药物市场，单克隆抗体药物市场快速增长，抗体药物在未来全球药物市场上大有可为。本发明将开发人源化或全人源notch2受体单克隆抗体，以此为基础进一步开发抗体药物或抗体诊断试剂。小鼠（murine）和嵌合（chimeric）类单克隆抗体具有很强的免疫原性（immunogen），相关药物应用会诱导机体对外来抗体的免疫应答，产生严重副作用，药物效果也很有限。人源化和全人源单克隆抗体具有高度的人源特异性，大大降低机体识别对这些抗体的识别和免疫排斥，因而安全性大大提高。目前，开发人源化和全人源单克隆抗体技术也已出现，如噬菌体展示技术（phagedisplay），转基因小鼠技术（transgenicmice），细胞展示技术，新克隆生物技术（neoclonebiotechnology）等。人源化和全人源单克隆抗体可以直接作为抗体药物用于人类疾病治疗，同时，也可以被用作药物载体与其它非特异性，非选择性药物（如传统的肿瘤化疗药物）联合应用，形成抗体药物复合物（antibody-drugconjugates，adcs）。这些抗体药物复合物adcs变成了抗原靶向的特异性药物，进一步提高药物靶向性，减少对人体的副作用。这些人源化和全人源单克隆抗体也可用于与其它生物活性分子（如放射性同位素，核酸片段oligodna，多肽片段，sirna，microrna,荧光分子，抗肿瘤药物，免疫抑制剂，代谢调控因子等等）相连，构成相应的靶向复合物，广泛应用于疾病治疗，疾病诊断和健康检测等等。目前，人源化和全人源单克隆抗体主要是针对一些特定靶点如cd25,cd33,tnf-α,vegf,vegfr,egfr。这些分子在特定组织表达或具有特定功能，因而可用于靶向治疗或临床检测。例如，vegf为血管内皮细胞生长因子。bevacizumab是人源化（humanized）抗vegf单克隆抗体，用于治疗转移性直肠结肠癌。tnf-α为肿瘤坏死因子。adalimumab是全人源抗tnf-α单克隆抗体，用于治疗类风湿关节炎。此外，还有更多人源化和全人源单克隆抗体正在临床试验中。单克隆抗体药物代表着全新的现代药物发展方向之一。notch2受体已经被确认为特定的分子靶点，也被应用于靶向药物的研究开发，我们也长期开发以notch信号为靶点开发抗肿瘤药物。然而，还没有针对notch2的人源化或全人源单克隆抗体的开发。本发明首次公布人源化或全人源notch2单克隆抗体的开发，并以此单克隆抗体为载体与各种生物活性分子（如化疗药物，放射性药物）偶联，构建各种抗体靶向药物复合物或用于疾病诊断的抗体复合物。技术实现要素：本发明是确认人源化（humanized）或全人源（fullyhuman）notch2受体单克隆抗体(monoclonalantibody)及其相关药物或诊断试剂的开发与应用。1，人源化（humanized）或全人源（fullyhuman）notch2受体单克隆抗体。本发明是基于notch2的表达特异性和功能特异性来开发人源化或全人源notch2单克隆抗体(可以是，但不限于，igg1,igg2，igg3,igg4,iga，igd，ige)。可以通过计算机模拟，预测，软件分析和实验，筛选notch2特定序列片段作为免疫原（immunogen）。notch2特定序列片段如，但不限于：ceknrcqnggtcvaqamlgkatcrcasgftgedcq,ystshpcfvsrpclnggtchmlsrdtyectcqvgftgkecqwtdaclshpcangstct,tvanqfsckcltgftgqkcetdvnecdipghcqhggtclnlpgsyqcqcpqgftgqyc,dslyvpcapspcvnggtcrqtgdftf等等。利用噬菌体展示（phagedisplay），细胞展示技术，转基因（transgenic）老鼠等技术获得所要求的人源化或全人源notch2单克隆抗体。2，以人源化或全人源notch2单克隆抗体开发抗体药物或抗体诊断试剂。2.1直接利用人源化或全人源notch2单克隆抗体（mab）作为疾病治疗药物。已经有一些人源化或全人源单克隆抗体药物已被成功开发和临床应用。notch2单克隆抗体也可以直接应用于一些notch2特异性的人类疾病如肿瘤的治疗。2.2利用人源化或全人源notch2单克隆抗体作为载体，将相关生物活性分子与抗体相连，构建抗体-活性分子复合物，开发notch2靶向的临床药物或临床诊断试剂。生物活性分子与notch2单克隆抗体的复合物，其形式（formula）为：a-b-mab。在a-b-mab中，mab代表全人源或人源化notch2单克隆抗体。b为药物（a）与抗体（mab）之间的连接链（linkers），可以是（但不限于）肽（peptide），单个氨基酸，葡萄糖醛酸（glucuronides），腙（hydrazone），二硫桥（disulfidebridge），硫醚（thioether），螯合基团(chelatinggroups)或其他等。也可以是可裂解的连接链（cleavablelinkers）如val-ala,或非裂解的连接链（non-cleavablelinkers)，或两个或多个联合应用（如多肽与硫醚一起作为连接链，多肽连接链一端连接螯合基团，另一端连接硫醚，构成完整的连接链），将药物与notch2单克隆抗体连接在一起。连接链（linkers）的应用与策略主要基于不同抗体，不同药物等多方面的考量。肽可以是（但不限于）含两个或多个氨基酸（自然态氨基酸或修饰后的氨基酸），如dtyr-dser，dser-lys-d-tyr，val-ala等）。连接链b一端连接药物（a），另一端连接mab。在药物（a）一测，连接链b的连接方式可以更偏向于，但不限于，增加抗体复合物的的亲水性。b可以带有一聚合物（polymer）或亲水聚合物（如polyethyleneglycol,polyvinylalcohol,polyvinylacetate），或为其他连接链。在mab一测，连接链b的连接方式可以是葡萄糖醛酸（glucuronides），腙（hydrazone），二硫桥（disulfidebridge），硫醚（thioether），螯合基团(chelatinggroups)等。a为生物活性分子，通过连接链（linkers）如，但不限于，二硫桥（disulfidebridge），腙（hydrazine），氨基酸，多肽或者硫醚（thioether）等与notch2单克隆抗体相连。a可以是（但不限于）治疗药物（therapeuticagents）,细胞毒性药物（cytotoxicagents）,检测标记（detectablelabels）,核酸（nucleicacid），活性多肽（biologicallyactivepeptide），以及螯合基团（chelatinggroups）等等。例如，notch2单克隆抗体与各种小分子化学药物（a）连接，构成抗体-化学药物复合物（adcs）。notch2单克隆抗体与各种放射性同位素或其偶联基团（a）连接，构成放射性抗体复合物。notch2单克隆抗体与各种诊断用的放射性同位素，荧光基团或其偶联基团（a）等连接，构成放射性抗体或荧光抗体等。notch2单克隆抗体与活性多肽（a）等连接，构成抗体-多肽复合物。notch2单克隆抗体与核酸如oligodna，oligopna，oligorna，sirna，microrna或类似物等（a）连接，构成抗体-核酸复合物。这些复合物用于，但不限于，诊断或治疗疾病肿瘤，自身免疫病，aids病等。用于获得人源化或全人源notch2单克隆抗体的技术与方法为已知的或新的技术方法。可以是，但不限于，噬菌体展示（phagedisplay），细胞展示技术，或转基因（transgenic）老鼠等这些技术方法。本发明中，治疗药物(therapeuticagents)（a）指任何用于治疗，诊断人类疾病或其他处理的化合物或药物，这些化合物或药物可以是自然存在的，修饰的，合成的等。这些化合物或药物可以是促进或抑制生物活性，可以用于（但不限于）治疗肿瘤，细胞异常增值，类癌综合征，血管发生，类风湿关节炎，炎症性疾病,自身免疫病等。治疗药物可以是抗肿瘤的，包括细胞毒性的。治疗药物可以是（但不限于）烷化剂（alkylatingagents），抗生素，抗代谢药，免疫调节剂，拓扑酶（topoisomerases）抑制剂，微管蛋白抑制剂，激素激动剂（agonists）或拮抗剂（antagonists）。这些药物可以通过直接或间接方式起作用或补充剂（supplementaryagents）起作用。细胞毒性药物(cytotoxicagents)（a）指任何自然存在的，修饰的，合成的对肿瘤细胞或其它目的细胞产生细胞毒性的化合物。这些药物可以用于（但不限于）治疗肿瘤，自身免疫病，或其他疾病或症状。细胞毒性药物可以是（但不限于）烷化剂（alkylatingagents），抗生素，抗代谢药，免疫调节剂，拓扑酶（topoisomerases）抑制剂，微管蛋白抑制剂，激素激动剂（agonists）或拮抗剂（antagonists）等。检测标记(detectablelabels)（a）指任何用于诊断的检测标记，可以是，但不限于，细胞毒性和非细胞毒性。可以是，但不限于，包含一个或多个如下特性：荧光，颜色，细胞毒性（toxicity），放射性（radioactivity），辐射敏感（radiosensitivity），光敏感（photosensitivity），非放射性。检测标记可以是直接连接到抗体上某氨基酸部位，也可以通过螯合基团，肽或其它分子或其他连接链与抗体连接。检测标记可以是重金属离子，或稀土离子，如gd3＋，fe3＋，mn3＋等。放射性检测标记可以是放射性碘标记，如122i125i，131i，111in，201ti，111ag等。或者这些放射性物标记在某氨基酸，某肽或其它基团上，如dtyr，dphe等。非放射性检测标记可以是各种已知的荧光（fluorescence）或染料（dye）。毒性（toxic）检测标记可以是蓖麻毒素（ricin），或如上所述的放射性物，化学治疗药物，辐射敏感剂等。螯合基团(chelatinggroups)（a）指任何相关基团，可以是合成的，自然的或改造的。可以是与肽类药物（peptideagent）偶联的基团，也可以是与如上所述的检测标记（如荧光，染料，放射性同位素等）形成复合物（complex），如金属（metal），光敏感剂。螯合基团可以与如上所述的一种或多种治疗药物，细胞毒性药物或检测标记等形成单一药物靶点复合物或多个药物靶点复合物。活性多肽(biologicallyactivepeptides)（a）指任何自然存在的，修饰的，合成的多肽（包括蛋白与抗体，蛋白与抗体为长链大分子多肽），这些多肽具有生理功能或参与生物过程（biologicalprocess）。如，这些多肽可以是（但不限于）激素（hormones），生长因子（growthfactors），细胞因子（cytokines），神经传递因子（neurotransmitters），抗原（antigens），抗体（antibodies）和其它蛋白（proteins）等。细胞因子（cytokines）可以是（但不限于），趋化因子（chemokines），干扰素（interferons），肿瘤坏死因子（tnf）,淋巴因子（lymphokines），白细胞介素（interleukines）等。多肽（peptides）（a）指任何多肽，如，但不限于，单链多肽（linearpeptide），聚合多肽（polypeptide），环状多肽（cyclicpeptide），分支多肽(branchedpeptide)等。多肽指含有两个或更多氨基酸并由肽键或修饰后的肽键或其他方式连在一起的多肽或蛋白。多肽包括短链肽（尤指寡聚肽oligopeptide，或低聚物oligomer）以及长链肽（氨基酸序列长至100氨基酸残基）。多肽包括自然修饰的或化学修饰的氨基酸或多肽序列。修饰（modification）可发生在多肽的任何位置，包括多肽骨架（backbone），氨基酸侧链，氨基端，羧基端等。核酸或类似物（a）指任何自然存在的，修饰的，合成的或其它方式获得的核酸或核酸片段。可以是(但不限于)，oligodna，oligopna，oligorna，sirna，microrna或类似物。聚合物（polymer）指自然发生的或合成的聚合物，尤其是亲水性聚合物（hydrophilicpolymer），这有助于改变整个抗体复合物的水溶性或生物分布。聚合物可以是（但不限于），poly（ethyleneglycol）(peg),dextran,poly(vinylalcohol)(pva),hydroxyelthylstarch,pvp,phpma,gelatin,polysuccinamide(psi)等。这些聚合物可以被修饰，如succinylation（带负电荷），psi部分水解，或与其他化合物反应来添加含有羧基或氨基的基团。这类修饰可以增加或改变聚合物的亲水性或使抗体与治疗药物或细胞毒性药物或螯合基团更容易偶联。我们的实验结果及其他公开资料支持上述结论：附图说明图1人notch2结构示意图。图2人notch2受体氨基酸序列。图3notch信号的激活。一个细胞表面的notch配体与另一个细胞表面的notch受体相互作用，诱导notch受体两次剪切，释放notch活性部分icn，icn从细胞质进入细胞核，与notch靶点基因csl结合，激活基因转录并进一步调控下游信号。图4细胞增殖实验(mttassay)显示，notch信号的激活促进肝癌htb-52细胞的增殖。notch受体notch1，notch2，notch3和notch4的活性部分icn1,icn2，icn3和icn4均促进htb-52细胞增殖。图5细胞增殖实验(mttassay)显示，notch信号的激活促进正常肝细胞thle2的增殖。notch受体notch1，notch2，notch4的活性部分icn1,icn2和icn4均明显促进htb-52细胞增殖。但notch受体notch3的活性部分icn3的作用不明显。图6激活notch信号促进淋巴瘤hpb-all细胞的增殖。过表达notch的活性片icn2，icn3，icn4诱导hpb-all细胞增殖。图7westernblot蛋白印迹实验显示，细胞增殖实验显示，notch信号抑制因子vpa，tsa和dbz抑制肝癌细胞htb-52的生长。图8facs分析实验显示，notch信号抑制因子vpa，tsa和dbz诱导肝癌细胞htb-52的细胞凋亡。图9抗体结构示意图。一个抗体由四条链组成，包括两条轻链和两条重链，由二硫键（s-s）连接在一起。抗体中的每条链中都有一个可变的可变区和有一个保守的恒定区。图10不同抗体示意图。包括小鼠（mouse）抗体，嵌合（chimeric）抗体，人源化（humanized）抗体，全人源（fullyhuman）抗体。图11抗体-药物复合物（antibody-drugconjugate）结构示意图。图12受体靶向特异性药物(antibody-drugconjugate,peptide-drugconjugate,radio-labeledpeptide,radio-labeledantibody等)通过受体进入靶向肿瘤细胞示意图。a，人体内生长的肿瘤；b，肿瘤细胞表面存在各种受体，特定受体靶向药物识别细胞表面特定受体，与之相互作用，激活受体；c，药物-受体复合物诱导细胞内吞（endocytosis），受体靶向特异性药物进入受体特异性肿瘤细胞；d，细胞内酶降解药物载体，释放抗肿瘤药物，药物杀死受体靶向肿瘤细胞。当前第1页12当前第1页12