本发明涉及生物技术育种领域，具体涉及一种利用基因组编辑技术定点突变小麦相关基因对小麦进行改造的方法。
背景技术：
：：小麦起源于中东新月沃土(levant)地区，是世界上重要的粮食作物之一，也是我国仅次于水稻的第二大农作物，其生产关系到世界和我国的粮食安全。小麦是一种温带长日照植物，适应范围较广，自北纬17°-50°，从平原到海拔约4000m的高原(如中国西藏)均有种植。全世界有43个国家，有35％-40％的人口以小麦为主要粮食。据联合国粮农组织2004年统计，全世界小麦收获面积32.36亿亩，单产193.8千克/亩，总产6.27亿吨。随着世界粮食生产形势日益严峻，进一步提高小麦triticumaestivuml.,2n＝42,aabbdd)产量成为当前迫切需要解决的问题。小麦产量是由单位面积有效穗数、每穗粒数和千粒重构成的，实现三者的最佳协调关系，力争达到产量最大化，是目前亟待解决的问题。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种改造小麦的方法。本发明所提供的改造小麦的方法，包括如下步骤：抑制小麦中dep1蛋白的表达和/或活性，进而实现小麦改造。上述方法中，所述抑制dep1蛋白表达的方法可以为使dep1蛋白的编码基因功能降低或丧失。使dep1蛋白的编码基因功能降低或丧失，可采用现有技术中的任何方式实现，以使基因产生缺失突变、插入突变或碱基变换突变，进而实现基因功能降低或丧失。使dep1蛋白的编码基因功能降低或丧失具体可以采取化学诱变、物理诱变、rnai、基因组定点编辑、同源重组等方法。无论采取哪种方法，既可对dep1蛋白的整个编码基因作为靶标，又可将调控dep1基因表达的各个元件作为靶标，只要能实现基因功能丧失或降低即可。如可以将dep1的编码基因的第1外显子、第2外显子、第3外显子、第4外显子或第5外显子作为靶标。上述基因组定点编辑方法中，可采用锌指核酸酶(zincfingernuclease,zfn)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease,talen)技术或成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crisprassociated,crispr/cas9system)技术，以及其它能实现基因组定点编辑的技术。上述各种基因定点突变技术，在操作中具体可按照如下步骤进行：在小麦中表达特异于靶标片段的核酸酶，在核酸酶的作用下，所述靶标片段被剪切，再通过小麦的自身dna修复，完成对所述靶标片段的定点改造，进而实现使dep1蛋白的编码基因功能降低或丧失。上述方法中，在小麦中表达特异于靶标片段的核酸酶的方法为：直接向小麦中导入核酸酶或向小麦中导入用于表达所述核酸酶的遗传物质。其中的遗传物质为dna质粒或dna线性片段或体外转录的rna。核酸酶指进行定点编辑的活性功能物质。上述在小麦中表达特异于靶标片段的核酸酶的方法中还可包括如下步骤：将导入所述核酸酶或所述遗传物质后的小麦在无选择压力的情况下种植生长，所述核酸酶或未整合在小麦染色体上的所述遗传物质被细胞降解。在无选择压力情况下，植物自身的防御机制会抑制外源基因的进入并将已进入的外源基因降解。因而，将导入所述核酸酶或所述遗传物质后的小麦进行种植生长，外源基因(包括用于表达特异于所述靶标片段的核酸酶的质粒或成套质粒上的任何片段)不会整合入小麦基因组中，最终获得的小麦为非转基因的定点改造小麦。当使用crispr/cas9方法时，相应的，所述遗传物质为能转录向导rna和表达cas9蛋白的重组载体或dna线性片段；或所述遗传物质由能转录向导rna的重组载体或dna线性片段(或分别转录crrna和tracrrna的两个重组载体或dna线性片段)，以及能表达cas9蛋白的重组载体或dna线性片段或rna组成；或所述遗传物质由向导rna，以及能表达cas9蛋白的重组载体或dna线性片段或rna组成；所述向导rna为由crrna和tracrrna通过部分碱基配对结合而成的具有回文结构的rna；所述crrna含有能够与所述靶标片段互补结合的rna片段。在所述重组载体中，启动所述向导rna的编码核苷酸序列转录的启动子可为u3启动子或者u6启动子。当使用talen核酸酶时，所述用于表达特异于所述靶标片段的核酸酶的遗传物质可为同时表达成对talen蛋白的重组质粒，或同时表达成对talen蛋白的dna线性片段；或同时表达成对talen蛋白的rna；所述talen蛋白由能够识别所述靶标片段并与其结合的dna结合域和foki结构域组成；当使用锌指核酸酶时，所述用于表达特异于所述靶标片段的核酸酶的遗传物质可为同时表达成对zfn蛋白的重组质粒，或同时表达成对zfn蛋白的dna线性片段；或同时表达成对zfn蛋白的rna；所述zfn蛋白由能够识别所述靶标片段并与其结合的dna结合域和foki结构域组成。本发明的具体例子中采用了crispr/cas9技术，其中涉及的靶序列为seqidno.1，使用的向导rna序列为seqidno.2。进一步具体的，本发明中使用了如下(1)或(2)所示载体，当使用(1)所示载体时需与pjit163-ubi-rcas9载体联合使用，才能实现上述发明目的：(1)能转录向导rna的重组载体，按照如下方法制备：将seqidno.3和seqidno.4所示片段进行退火，然后与经bbsi酶切的ptau6-grna载体骨架相连，得到重组载体，记作ptau6-grna-tadep1-1；(2)能转录向导rna和表达cas9蛋白的重组载体，按照如下方法制备得到：以载体ptau6-grna-tadep1-1为模板，用seqidno.5和seqidno.6所示引物对进行扩增，得到扩增产物；将扩增产物用spei进行酶切，酶切产物与经spei酶切的pjit163-ubi-rcas9载体骨架相连，得到重组载体。上述方法中，所述改造小麦可为增强小麦的光合作用能力、和/或增加小麦叶片叶绿素含量和/或改变小麦株型。其中的改变小麦株型具体可为使小麦株高变矮小。上述方法适用于任何小麦，只要含有上述靶序列即可，本发明列举的例子是普通小麦(triticumaestivuml.)。由于小麦是多倍体植物，因此上述方法改造后得到的小麦可以是所有染色单体均被定点编辑的小麦，也可以是部分染色单体被定点编辑的小麦。本发明还提供了实现上述方法的一种工具，即用于改造小麦的试剂盒。本发明所提供的改造小麦的试剂盒，包括如下任一种：(1)sgrna分子：其序列如seqidno.2所示；(2)所述sgrna的编码dna分子；(3)表达所述sgrna的载体；(4)能转录向导rna的重组载体，按照如下方法制备：将seqidno.3和seqidno.4所示片段进行退火，然后与经bbsi酶切的ptau6-grna载体骨架相连，得到重组载体，记作ptau6-grna-tadep1-1；(5)能转录向导rna和表达cas9蛋白的重组载体，按照如下方法制备得到：以载体ptau6-grna-tadep1-1为模板，用seqidno.5和seqidno.6所示引物对进行扩增，得到扩增产物；将扩增产物用spei进行酶切，酶切产物与经spei酶切的pjit163-ubi-rcas9载体骨架相连，得到重组载体；(6)对小麦进行基因组定点编辑的crispr/cas9系统，其中的靶标序列为seqidno.1；(7)对小麦进行基因组定点编辑的crispr/cas9系统，其中的sgrna分子序列为seqidno.2所示。本发明通过基因组定点编辑技术同时突变小麦中dep1基因的三个位点(即同时敲除tadep1-a1基因、tadep1-b1基因和tadep1-d1基因)，得到了株型变矮小且光合作用增强的小麦。附图说明图1为靶位点位置，及tadep1基因靶位点的sgrna在小麦原生质体中的活性检测。图2为用pcr/re检测crispr介导的小麦dep1基因t0代突变体以及测序结果。图3为小麦dep1基因纯合突变体tadep1-aabbdd的株高表型。图4为小麦dep1基因纯合突变体tadep1-aabbdd的光合能力。图5为小麦dep1基因纯合突变体tadep1-aabbdd的旗叶厚度和叶绿素含量。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。pjit163-ubi-rcas9载体在如下文献中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得：“wang,y.etal.simultaneouseditingofthreehomoeoallelesinhexaploidbreadwheatconfersheritableresistancetopowderymildew.nat.biotechnol.32,947-95(2014).ptau6-grna载体在如下文献中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得：shan,q.etal.targetedgenomemodifiationofcropplantsusingacrispr-cassystem.nat.biotechnol.31,686–688(2013).pjit163载体：guerineau,f.,lucy,a.&mullineaux,p.effectoftwoconsensussequencesprecedingthetranslationinitiatorcodonongeneexpressioninplantprotoplasts.plantmol.biol.18,815–818(1992).小麦品种“科农199”在如下文献中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得：李俊明；张相岐；张爱民；王志国；安调过；纪军；王静.高产广适小麦新品种——科农199.麦类作物学报.2007.368-368。实施例1、小麦tadep1靶位点的选择并构建敲除载体一、tadep1靶位点的选择普通小麦(triticumaestivuml.)是六倍体植物，大部分基因都以多个拷贝的形式分布在基因组a、基因组b和基因组d组上。小麦dep1基因在基因组a、基因组b和基因组d上都有分布，分别命名为tadep1-a1基因、tadep1-b1基因和tadep1-d1基因。tadep1的三个拷贝分别位于小麦5a、5b、5d染色体上，包含5个外显子，4个内含子，构建敲除载体选择的靶位点位于第4外显子的保守区(图1a)。利用crispr技术敲除的靶标双链中的一条链具有如下结构：5-nx-ngg-3，pam(ngg)中的n表示a、t、c和g中的任一种，nx中的n表示a、t、c和g中的任一种，x＝20。crispr对tadep1-a1基因、tadep1-b1基因和tadep1-d1基因的靶序列分别如下(seqidno.1)(参见图1a)，“ccg”为pam(原型间隔序列毗邻基序),下划线表示avaii酶切位点。tadep1-a1基因:ccggtcctggcgtctttattggt；tadep1-b1基因:ccggtcctgccgtctttattggt；tadep1-d1基因:ccggtcctgccgtctttactggt；即在tadep1-a1基因、tadep1-b1基因和tadep1-d1基因中，此靶序列存在snp，加粗的即是snp。二、sgrna的设计根据靶序列，设计sgrna，其序列为accaauaaagacggcaggacguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu(seqidno.2)。三、重组载体的构建用限制性内切酶bbsi酶切ptau6-grna，回收约2.85kb的载体骨架。根据设计的靶位点tadep1序列，合成如下带有粘性末端(下划线部分)的引物：tadep1-1f：cttgaccaataaagacggcaggac(seqidno.3)；tadep1-1r：aaacgtcctgccgtctttattggt(seqidno.4)。将tadep1-1f和tadep1-1r进行退火，形成有粘性末端的双链dna命名为tadep1-1,将其和上述载体骨架连接，得到重组质粒。质粒经测序验证阳性质粒，即在ptau6-grna质粒的酶切位点bbsi处正向插入seqidno.3所示dna片段后得到的重组质粒为阳性，命名为ptau6-grna-tadep1-1。在小麦细胞中，当pjit163-ubi-cas9载体和含有靶标序列的ptau6-grna-tadep1-1质粒同时存在时在有活性的sgrna的介导下，cas9蛋白在靶序列区域切割，形成dna双链断裂，触发机体内的自我损伤修复机制，细胞自发修复该缺口的过程中会引入突变(本处“突变”指的是广义突变，包括插入、缺失、狭义突变等形式，这些突变使基因功能失活)。上述靶序列tadep1含有avaii酶切识别序列，可以被avaii限制性内切酶切割。靶序列区域被编辑后，如果发生了突变，则avaii酶切识别序列被破坏，将不能被限制性内切酶avaii切割；如果没有发生突变，将可以被限制性内切酶avaii切割。实施例2、转化小麦原生质体及检测重组载体在原生质体中的活性将质粒ptau6-grna-tadep1-1和pjit163-ubi-rcas9通过peg介导的方式共转入小麦品种科农199的原生质体，然后提取原生质体的基因组dna，用a、b、d的通用引物通过pcr扩增包含靶位点的tadep1基因，然后将pcr扩增产物用avaii单酶切，将不能被限制性内切酶切开的pcr扩增产物进行测序。用于扩增含有靶位点tadep1的通用引物序列如下：上游引物tadep1-f:cagcaaaccccacttgcatcagaac下游引物tadep1-r:cagcacagccatgaagcacatatgca原生质体中检测重组载体活性的酶切结果见图1b，泳道1和泳道2中含有不能被avaii切开的pcr条带，说明靶位点tadep1-1有活性，泳道3为野生型对照pcr产物可以被avaii完全切开，泳道4为pcr产物对照。测序(图1b)结果表明靶位点处产生了少量碱基的插入与缺失，证实重组载体tau6-sgrna-tadep1-1在靶位点处进行了基因定点编辑。实施例3、转化小麦及表型鉴定一、转化为了提高在植物中的转化效率，我们将质粒ptau6-grna-tadep1-1和pjit163-ubi-rcas9构建到同一个质粒中。具体操作如下：用u6-spei-f：cggactagtgaccaagcccgttattctgac(seqidno.5)和sgrna-spei-r：cggactagtaaaaaaagcaccgactcggtgccac(seqidno.6)为引物，质粒ptau6-grna-tadep1-1为模板扩增tau6-grna片段，将该pcr产物用spei进行酶切纯化后与同样用spei酶切回收后的pjit163-ubi-rcas9载体相连，最终构建在同一载体上，命名为pge-tadep1，并将载体进行测序验证。将该载体通过基因枪转化的方法转入小麦品种科农199中。提取t0代转基因植株基因组dna，用含有靶位点tadep1-1的特异引物对基因组dna进行pcr扩增，pcr产物用avaii单酶切，酶切结果见图2a。经pcr、酶切检测后，在t0代，得到小麦dep1基因发生定点突变的转基因植株，其中包括tadep1-a1基因、tadep1-b1基因和tadep1-d1基因同时发生定点突变的杂合株。对其中8株突变体的测序结果见图2b。将t0代转基因植株自交，得到t1代和t2代植株，其中包括tadep1-a1基因、tadep1-b1基因和tadep1-d1基因同时发生定点突变的纯合株。用于扩增tadep1-a1基因的引物对如下：上游引物：ccagcaaaccccacttgcatcagaac；下游引物：gtgtactctactggaaggaaggttacaag。用于扩增tadep1-b1基因的引物对如下：上游引物：ccagcaaaccccacttgcatcagaac；下游引物：cagatgaatactgcgtccctacgataggt。用于扩增tadep1-d1基因的引物对如下：上游引物：ccagcaaaccccacttgcatcagaac；下游引物：ctgggcgggttcagttagcaggttac。二、表型鉴定将t0-7植株进行自交，鉴定，选取dep1-aabbdd基因型(即纯合型)植株，15个重复进行表型的观察鉴定。实验结果表明无论是在营养生长还是生殖生长阶段，突变体均表现出株高显著矮小的表型(图3a)，在生殖生长阶段，突变体株高(36.7cm)相对于野生型(56.0cm)降低19.3cm。(图3b)。通过测量不同光合强度下小麦旗叶光合速率，结果表明光强在0-200区间时，突变体与野生型光合作用强度无明显差别，而在500-2000范围内光强下，突变体光合作用显著高于野生型(p<0.05)(图4)。通过测量突变体及野生型旗叶厚度及叶绿素含量指标，结果表明突变体旗叶厚度显著比其野生型增厚约5cm(图5a),且叶绿素含量相比较于其野生型成明显增高的趋势(图5b)。序列表<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所<120>一种改造小麦的方法<160>6<210>1<211>23<212>dna<213>普通小麦（triticumaestivuml.）<221>misc_feature<222>(10)，(19)<223>s为c或g，y为c或t<400>1ccggtcctgscgtctttaytggt23<210>2<211>103<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2accaauaaagacggcaggacguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu103<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3cttgaccaataaagacggcaggac24<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4aaacgtcctgccgtctttattggt24<210>5<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223><400>5cggactagtgaccaagcccgttattctgac30<210>6<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223><400>6cggactagtaaaaaaagcaccgactcggtgccac34当前第1页12当前第1页12