本发明属于基因工程领域，具体涉及一种大片段基因整合提高黑曲霉纤维素酶酶活的方法。
背景技术：
黑曲霉纤维素酶是一种广泛应用的酶类；黑曲霉具有很好的食品安全性，是食品或工业生产中广泛应用的菌种。黑曲霉产生的纤维素酶酶系组成中，纤维素外切酶的活力相对较低。已有的提高黑曲霉纤维素酶酶系的方法是通过基因工程的手段导入纤维素外切酶基因，提高外切酶的酶活；或者敲除某一些外分泌蛋白，降低外分泌蛋白的分泌量，从而提高纤维素酶蛋白的分泌量。目前这些方法中，每次只能剔除一个基因或增强一个基因的表达。
实际上，非纤维素酶的酶类对黑曲霉的代谢网络也会产生影响。非纤维素酶类和纤维素酶类的多克隆可能是提高纤维素酶酶活的一个创新型的策略。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种大片段基因整合提高黑曲霉纤维素酶酶活的方法，该方法通过多次同源重组将里氏木霉纤维素酶系相关的基因大片段一次性整合到黑曲霉基因组中，达到纤维素酶基因、非纤维素酶基因多克隆的效果，从而影响黑曲霉的代谢网络，提高黑曲霉的纤维素酶酶活。本发明的目的还在于提供一种纤维素酶酶活提高的黑曲霉菌株。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种大片段基因整合提高黑曲霉纤维素酶酶活的方法，包括如下步骤：
（1）合成两端含有限制性内切酶酶切位点序列的如下dna片段：
dna片段1：酶切位点序列1-里氏木霉基因同源片段前段1-潮霉素抗性基因单元盒-黑曲霉基因组片段1-里氏木霉基因同源片段后段1-酶切位点序列2；
dna片段1-2：酶切位点序列1-里氏木霉基因同源片段前段1-黑曲霉基因组片段1-酶切位点序列2；
dna片段2：酶切位点序列1-里氏木霉基因同源片段前段2-潮霉素抗性基因单元盒-黑曲霉基因组片段2-里氏木霉基因同源片段后段2-酶切位点序列2。
其中，里氏木霉基因同源片段前段1的序列如seqidno.1所示，潮霉素抗性基因单元盒的序列如seqidno.2所示，黑曲霉基因组片段1的序列如seqidno.3所示，里氏木霉基因同源片段后段1的序列如seqidno.4所示，里氏木霉基因同源片段前段2的序列如seqidno.5所示，黑曲霉基因组片段2的序列如seqidno.6所示，里氏木霉基因同源片段后段2的序列如seqidno.7所示。
（2）将步骤（1）中的3个dna片段分别连接到载体上构建得到同源重组载体1、同源重组载体1-2、同源重组载体2。
（3）用同源重组载体1转化里氏木霉，筛选得到同源重组成功的里氏木霉菌株1。里氏木霉菌株1的基因组上含有外源片段潮霉素抗性基因单元盒、黑曲霉基因组片段1。
用同源重组载体1-2转化里氏木霉菌株1，筛选得到同源重组成功的里氏木霉菌株1-2。里氏木霉菌株1-2在里氏木霉菌株1的基础上去除了潮霉素抗性基因单元盒，其基因组上含有外源片段黑曲霉基因组片段1。
用同源重组载体2转化里氏木霉菌株1-2，筛选得到同源重组成功的里氏木霉菌株2。里氏木霉菌株2的基因组上含有外源片段黑曲霉基因组片段1、潮霉素抗性基因单元盒、黑曲霉基因组片段2。
（4）将里氏木霉菌株2的基因组断裂片段导入到黑曲霉，以潮霉素抗性作为筛选标记，筛选得到同源重组成功的黑曲霉菌株g，黑曲霉菌株g的纤维素酶酶活得到提高。此过程的同源重组是以黑曲霉基因组片段1、黑曲霉基因组片段2为同源重组位点，将里氏木霉菌株2基因组上这两个位点之间的大片段整合到了黑曲霉基因组上。
优选的，上述方法中，所述的载体为pcambia1300，酶切位点序列1、酶切位点序列2分别为sacii、hindiii的酶切位点序列；所述的里氏木霉为里氏木霉rutc-30；所述的黑曲霉为黑曲霉cbs513.88。
一种纤维素酶酶活提高的黑曲霉菌株，通过上述方法得到。
本发明大大提高了黑曲霉的纤维素酶酶活，所得到菌株的滤纸酶活是出发菌株的2.17倍。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1、材料
黑曲霉cbs513.88，里氏木霉rutc-30，质粒pcambia1300（biovector），农杆菌eha105，大肠杆菌dh5α，限制性内切酶（takara）等。
合成的dna片段1，其序列组成为：ggccgcgg（sacii酶切位点序列）-里氏木霉基因同源片段前段1-潮霉素抗性基因单元盒-黑曲霉基因组片段1-里氏木霉基因同源片段后段1-aagcttgg（hindiii酶切位点序列）。
合成的dna片段1-2，其序列组成为：ggccgcgg（sacii酶切位点序列）-里氏木霉基因同源片段前段1-黑曲霉基因组片段1-aagcttgg（hindiii酶切位点序列）。
合成的dna片段2，其序列组成为：ggccgcgg（sacii酶切位点序列）-里氏木霉基因同源片段前段2-潮霉素抗性基因单元盒-黑曲霉基因组片段2-里氏木霉基因同源片段后段2-aagcttgg（hindiii酶切位点序列）。
其中，里氏木霉基因同源片段前段1、潮霉素抗性基因单元盒、黑曲霉基因组片段1、里氏木霉基因同源片段后段1、里氏木霉基因同源片段前段2、黑曲霉基因组片段2、里氏木霉基因同源片段后段2的序列分别如seqidno.1-7所示。
2、方法
一、同源重组质粒的构建
（1）质粒pcambia1300的提取
含有pcambia1300的大肠杆菌dh5α接种到含有卡那霉素的lb培养基（lb培养基：氯化钠1%，蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，121℃灭菌20min，加入微孔过滤的卡那霉素，卡那霉素在lb中的终浓度为30µg/ml）中，35℃培养过夜。使用质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司，dp103）按照说明书说明提取pcambia1300质粒，提取步骤如下：
使用前请先在漂洗液pw中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
1）柱平衡步骤：向吸附柱cp3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液bl，12000rpm（13400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2）取2ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm（13400×g）离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液p1（请先检查是否已加入rnasea），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
4）向离心管中加入250μl溶液p2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
5）向离心管中加入350μl溶液p3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm（13400×g）离心10min。
6）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱cp3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
7）可选步骤：向吸附柱cp3中加入500μl去蛋白液pd，12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3重新放回收集管中。如果宿主菌是enda+宿主菌（tg1，bl21，hb101，jm系列，et12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒dna，推荐采用此步。如果宿主菌是enda-宿主菌（dh5α，top10等），这步可省略。
8）向吸附柱cp3中加入600μl漂洗液pw（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
9）重复操作步骤8）。
10）将吸附柱cp3放入收集管中，12000rpm（13400×g）离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
11）将吸附柱cp3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液eb，室温放置2min，12000rpm（13400×g）离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的ph值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddh2o做洗脱液，并保证其ph值在7.0-8.5范围内，ph值低于7.0会降低洗脱效率。且dna产物应保存在-20℃，以防dna降解。为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm（13400×g）离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。
（2）质粒pcambia1300、dna片段的酶切和电泳
往41μlpcambia1300质粒溶液或dna片段（dna片段1、1-2、2）溶液中加入2μlsacii、2μlhindiii和5μl酶切缓冲液，总体积为50.0µl，在30℃酶切2h。使用琼脂糖凝胶电泳试剂盒（上海一基实业有限公司）进行电泳。
1）打开试剂盒，依照说明书清点各种试剂，并按实验需要量将50×电泳缓冲液稀释为1×电泳缓冲液待用；将核酸荧光染料与6×loadingbuffer按1:1比例混合备用。
2）把u型凝胶托盘放入制胶槽中，插好梳子，置于一水平面上。
3）将0.25g琼脂糖加到盛有适当体积1×电泳缓冲液的三角瓶或玻璃瓶中（常用凝胶浓度0.8-1.2%）。
4）将瓶口用封口膜轻轻盖住，在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖完全熔化（熔化到没有小颗粒物为止）。
5）将温热的凝胶溶液倒入u型凝胶托盘中（超过二分之一处）。
6）将凝胶室温放置15-30min完全冷却至凝固，小心拔除梳子，将凝胶托盘移入电泳槽，梳井（点样孔）一端朝负极方向，加入1×电泳缓冲液，使凝胶全部被浸没。
7）将样品与6×loadingbuffer和核酸荧光染料充分混合（20μl样品+1μl6×loadingbuffer+1μl核酸荧光染料），用微量移液器将以上混合物缓慢加入梳井内，注意避免引入气泡。
8）盖上电泳槽盖，样品应向阳极（红色插头）泳动，提供5-10v/cm的电压。
9）当样品与染料在凝胶中迁移到足够距离时，关上电源，拔出电极插头和打开电泳槽盖，在dna电泳图谱观察仪中观察核酸条带。
（3）胶回收
使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒回收质粒pcambia1300、dna片段的酶切、电泳产物。
1）从琼脂糖凝胶中割下含目的条带的胶块，称重。
2）加入胶块重量3-6倍的bufferb2，50℃水浴5-10分钟溶胶。
3）选做，对于<500bp的片段，加入1/3bufferb2体积的异丙醇。
4）将溶胶液移入吸附柱中，8000×g离心30秒。倒掉收集管中液体。
5）加入500μlwashsolution，9000×g离心30秒，倒掉收集管中液体。
6）重复步骤5）一次。
7）空吸附柱于9000×g离心1分钟。
8）将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入15-40μlelutionbuffer，室温静置1分钟后，离心1分钟。保存管中dna溶液。
（4）质粒pcambia1300和dna片段的连接
使用dnaligationkitver.2.1（takara）进行连接。
1）将酶切的质粒pcambia1300与酶切的dna片段混合制备成体积为10μl的dna溶液，质粒和dna片段的体积比为1:3。
2）向上述dna溶液中加入等体积的solutioni，充分混匀。
3）16℃反应12h。
（5）大肠杆菌的转化和筛选
1）从-80℃冰箱中取100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞悬液，冰上溶解10分钟。
2）取10μl上述连接产物加入感受态细胞中，轻轻摇匀，冰上放置30分钟。
3）42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却2分钟。
4）加入890μllb液体培养基（不含kan），混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（kanr）。
5）将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含kan的lb筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
大肠杆菌转化子长出后挑取部分转化子接种于lb液体培养基，37℃、200rpm培养12-16小时后，提质粒验证，验证正确的同源重组质粒命名为pcambia1300-1（pcambia1300与dna片段1连接）、pcambia1300-1-2（pcambia1300与dna片段1-2连接）、pcambia1300-2（pcambia1300与dna片段2连接）。
二、农杆菌介导转化里氏木霉及筛选同源重组菌株
（1）农杆菌感受态细胞的制备
1）在新活化的农杆菌eha105的lb平板（lb液体培养基添加5%琼脂）上，挑取单克隆于lb液体培养基。
2）28℃、220r/min振荡培养至od600达到0.6-0.7。
3）取1.5ml无菌离心管，每管分装1ml菌液，6000r/min离心10min。
4）去除上清，用1ml10%无菌甘油重悬菌体，6000r/min离心10min，重复此过程3次，充分洗涤菌体以去除残留的培养基。
5）洗好的菌体用100μl20%无菌甘油重悬，-70℃保存备用。
（2）质粒pcambia1300-1转化农杆菌
1）将100µl农杆菌eha105感受态细胞置于冰上，加入10µlpcambia1300-1，充分混匀，冰上放置30min。
2）置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中，待其融化。
3）加1ml无抗生素的ym液体培养基（酵母膏0.3%，胰蛋白胨0.5%，麦芽糖0.5%，自然ph）于28℃、230r/min培养2-4h。
4）3000r/min离心2min收集菌体，将上清吸去500µl，剩余液体重悬培养菌后直接涂布含卡那霉素30µg/ml的ym平板，28℃、230r/min培养36h。
5）挑取单菌落接种到含卡那霉素的ym液体培养基中，28℃、250r/min培养48h，将菌液用于保存-20℃，得到含有质粒pcambia1300-1的农杆菌。
（3）里氏木霉菌丝的制备
1）从-80℃冰箱取出甘油管保藏的里氏木霉rutc-30，置于室温下，快速解冻。
2）吸取适量菌液加到淀粉培养基平板上，用涂布棒将菌液涂布均匀（或者用无菌接种环蘸取适量菌液作平板划线分离），34℃恒温培养5天。
3）待平板上长出单菌落后，用无菌牙签挑取单菌落移至装有察氏培养基的三角瓶中，34℃培养5天。
4）将三角瓶中菌液全部转移至50ml离心管，8000rpm离心5min，弃去上清。
5）加入20ml生理盐水，反复吹打混匀，8000rpm离心洗涤5min，弃上清，再加入适量生理盐水重悬使菌体浓度od600值达到1.5左右，留待转化用。
（4）含有质粒pcambia1300-1的农杆菌转化里氏木霉
1）试剂的配制
无机盐液：将2.61gkcl、7.48gkh2po4和29.8gnano3溶于80ml水中，再加水定容至100ml，用5mkoh调ph至5.5，高压灭菌，4℃保存。
50%葡萄糖（w/v）：50g葡萄糖溶于90ml蒸馏水中，定容至100ml，高压灭菌。
1mmgso4：24.7gmgso4溶于90ml蒸馏水中，定容至100ml，高压灭菌。
mm微量元素溶液：将1.1gh3bo3、2.1gznso4·7h2o、0.16gcuso4·5h2o、0.5gmnc12·4h2o、0.5gfeso4·7h2o、0.17gcoc12·6h2o、0.15gna2moo4·2h2o和0.1gedta溶于90ml蒸馏水中，定容至100ml，高压灭菌，4℃保存。
mm选择培养平板：取20ml无机盐溶液、20ml50%葡萄糖溶液、2ml1mmgso4溶液、1mlmm微量元素溶液加入到957ml经高压灭菌含有20g琼脂粉的蒸馏水中使总体积至1l，充分混匀（即琼脂浓度2%）。当温度降至60℃，加入1ml100mg/ml潮霉素b（终浓度100μg/ml）和1ml0.2m头孢噻肟（终浓度0.2mm），加入1ml200mm乙酰丁香酮（终浓度0.2mm)，混合均匀后制成mm选择培养平板。
pda培养基：①称量和熬煮：按培养基配方逐一称取去皮土豆。土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20-30min，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。②加热溶解：把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15-20g（提前搞碎），然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所1000ml。
2）农杆菌转化里氏木霉
在含有200μm乙酰丁香酮的im培养基平板上贴一层玻璃纸滤膜（尽量不要产生气泡），将100μl里氏木霉菌丝悬液与100μl转化有质粒pcambia1300-1的农杆菌培养液等体积混合均匀后涂布于滤膜上，22.5℃避光培养3天。
3）筛选
将滤膜转移至含有200μm头孢噻肟（目的杀死农杆菌细胞）和100μg/ml潮霉素的mm选择培养基平板，30℃培养4-6天，待菌落长出后，挑取菌落进行鉴定，筛选得到同源重组成功的菌株命名为里氏木霉菌株1。里氏木霉菌株1的基因组上含有潮霉素抗性基因单元盒、黑曲霉基因组片段1。
（5）里氏木霉菌株1潮霉素抗性基因的去除
按照上述步骤（1）-（4）的方法用同源重组质粒pcambia1300-1-2转化里氏木霉菌株1，转化后筛选的方法为：将滤膜涂布于mm平板上，30℃培养4-6天，对长出的每个菌落标记后，再转移接种于含有100μg/ml潮霉素的mm平板上，30℃培养4-6天，对应接入的地方没有长出菌落的菌株即为去除潮霉素抗性基因的里氏木霉菌株1-2。里氏木霉菌株1-2的基因组上含有黑曲霉基因组片段1。
（6）质粒pcambia1300-2转化里氏木霉菌株1-2
按照上述步骤（1）-（4）的方法用同源重组质粒pcambia1300-2转化里氏木霉菌株1-2，筛选得到的同源重组成功的菌株即为里氏木霉菌株2。里氏木霉菌株2的基因组上含有黑曲霉基因组片段1、潮霉素抗性基因单元盒、黑曲霉基因组片段2。
三、纤维素酶酶活提高的黑曲霉菌株的构建
（1）里氏木霉菌株2基因组提取
里氏木霉菌株2基因组提取用真菌基因组dna提取试剂盒（货号d2300，生产厂家北京索莱宝）提取。提取步骤如下：
1）里氏木霉菌株2菌丝接种于pda平板，30℃培养3天，从平板上挑取100mg菌丝，加200μl溶液a，用玻璃研磨器适当研磨分散菌丝，加入20μlrnasea，再加入100mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡，约30min。
2）加入20μl10mg/ml的蛋白酶k，充分混匀，55℃水浴消化，30min。消化期间可颠倒离心管混匀数次，12000rpm离心2min。将上清转移到一个新的离心管中。如有沉淀，可再次离心。
3）在上清中加入200μl溶液b，充分混匀。如出现白色沉淀，可放55℃水浴5min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能导致提取的dna量少及不纯，还有可能导致上柱后堵柱子，请增加消化时间。
4）再加入200μl无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响dna的提取，将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，放置2分钟。
5）12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
6）向吸附柱中加入700μl漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
7）向吸附柱中加入500μl漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
8）12000rpm离心2min，将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、pcr等。
9）将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200μl经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心1min。
10）离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，即可得基因组dna
11）基因组dna用移液枪反复吹打，并用枪头在离心管壁反复碾压，得到里氏木霉菌株2的基因组断裂片段。
（2）里氏木霉菌株2的基因组断裂片段导入到黑曲霉
黑曲霉cbs513.88接种到pda培养基上，30℃培养4d，挑取菌丝。按照裂解酶液:菌丝重量10:1配比混合，30℃酶解2h，得到黑曲霉原生质体悬液。裂解酶液组成为：2g/l纤维素酶+1g/l蜗牛酶溶解于1mol/l山梨醇溶液；纤维素酶、蜗牛酶购自华美生物工程公司。
取100μl黑曲霉原生质体悬液，加入约10μl里氏木霉菌株2的基因组断裂片段，用枪头轻轻吹吸混匀，加入500μlpeg溶液（25%peg8000，50mmol/lcacl2，10mmol/ltris-hcl，ph7.5），轻轻颠倒混匀，冰浴20min，取出后缓缓加入1mlpeg溶液，室温放置5min，将其与含有潮霉素b（100μg/ml）的再生培养基（酵母提取物0.2g/l，蛋白胨0.5g/l，氯化钠0.2g/l，66g/lmaso4，淀粉1g/l，琼脂117g/l）混匀后倒平板，34℃培养5～6d，在再生培养基上筛选得到的同源重组成功的菌株即为目的菌株。此过程的同源重组是以黑曲霉基因组片段1、黑曲霉基因组片段2为同源重组位点，将里氏木霉菌株2基因组上这两个位点之间的大片段整合到了黑曲霉基因组上。将目的菌株命名为黑曲霉菌株g。
（3）黑曲霉菌株g发酵
黑曲霉菌株g选育：挑取黑曲霉菌株g孢子用无菌水稀释到孢子浓度为1×107/ml，涂布pda平板，30℃培养72h得到单菌落，单菌落接种到pda斜面，30℃培养108h左右，得到黑曲霉菌株g选育的孢子。同时以出发菌株黑曲霉cbs513.88作为对照。
接种发酵：选育的孢子接种于装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，孢子最终浓度为1×108孢子/ml发酵培养基，30℃、130r/m培养96h。其中，发酵培养基组成：mm微量元素液6ml，麸皮20g，甘蔗渣（粉碎过20目筛）12g，葡萄糖5g，蛋白胨2g，自来水定容至1l。
发酵结束后，用滤纸过滤发酵液，测定滤液的纤维素酶酶活，测定方法依据文献（冯月，蒋建新，朱莉伟，菅红磊。纤维素酶活力及混合纤维素酶协同作用的研究。北京林业大学学报，2009，第31卷，增刊1）。测定的黑曲霉菌株g发酵液的滤纸酶活为3.9u/ml，纤维素酶内切酶酶活26.5u/ml，葡糖苷酶酶活为19.2u/ml，外切酶酶活为1.30u/ml；黑曲霉cbs513.88发酵液的滤纸酶活为1.8u/ml，纤维素酶内切酶酶活24.5u/ml，葡糖苷酶酶活为18.3u/ml，外切酶酶活为0.37u/ml。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>湖北工业大学
<120>一种大片段基因整合提高黑曲霉纤维素酶酶活的方法
<130>1
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<170>patentinversion3.3
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<223>里氏木霉基因同源片段前段1
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