本发明属于活性多肽提取领域，尤其涉及一种鱿鱼活性多肽的提取方法。
背景技术：
鱿鱼，又称句公、柔鱼或枪乌贼，是软体动物门头足纲管鱿目开眼亚目的动物。我国鱿鱼加工主要分布在浙江和山东，鱿鱼年加工量为30~40万吨，其中鱿鱼皮占加工量的8%~10%，鱿鱼皮干物质中80%左右是胶原蛋白，本发明以鱿鱼及其加工废弃物为原料提取鱿鱼活性多肽，制备具有抗氧化活性多肽产品，为鱿鱼加工废弃物的综合利用探索一条新途径，并且可以减少环境污染，又能够充分利用现有资源，提高企业的经济效益。
现有技术提供多种活性多肽提取方法，例如，中国发明专利文献一种鳖甲活性多肽提取物的制备方法及应用授权公告号：cn103705907b该发明属于中药提取物的制备技术领域，具体公开了一种鳖甲活性多肽提取物的制备方法及应用。本发明方法的具体步骤包括：鳖甲经水煎煮提取，提取液用蒸馏水稀释至相当于含鳖甲药材4-8g/100ml的浓度，分别采用微滤、多级超滤得到超滤液，减压浓缩，冷冻干燥得到分子量小于6kd的冻干粉。该发明采用多级膜分离方法制备鳖甲的活性多肽物质部位，经过中试试验，其工艺参数可过渡到产业化；所制备的鳖甲活性多肽提取物具有保肝作用，可以用于制备预防或治疗肝纤维化、酒精性肝损伤的药物或保健食品。
现有技术采用多级膜分离方法制备鳖甲的活性多肽物质部位，提取到的鳖甲活性多肽提取物具有保肝作用，但提取时间长，提取率有待提高。
技术实现要素：
本发明针对上述技术问题提供一种鱿鱼活性多肽的提取方法，多肽活性高，提取工艺简单且活性多肽提取率显著提高。
本发明针对上述技术问题所采取的方案为：一种鱿鱼活性多肽的提取方法，步骤如下：
1）预处理：将鱿鱼用蒸馏水洗净，切块；用蒸馏水去除鱿鱼中杂质，避免杂质对提取活性多肽的影响，切块为后续匀浆做工艺准备。
2）匀浆：往鱿鱼块中加入缓冲液冰浴匀浆；加入缓冲液稳定ph值，提高鱿鱼的持水能力，便于匀浆，调节离子强度，避免引起细胞渗透压改变，有利于活性多肽溶出和提取。
3）离心：将匀浆后的溶液进行搅拌，静置，离心取上清液；搅拌让匀浆液充分混合，利于多肽的提取，采用离心机取得上清液，便于后续的抽滤及提高活性多肽的提取率。
4）冻干：在上清液中加入鱿鱼0.3~1.2%重量份的析出剂，静置抽滤得到鱿鱼活性多肽，冻干保存。加入析出剂提高鱿鱼中的活性多肽析出，效果明显优异，由于活性多肽对环境的要求较高，故采用冻干保存方式。
缓冲液液ph为6.5~8，浓度为45~55mol/l，在此范围的ph值和浓度缓冲液与鱿鱼反应效果优异。
缓冲液由以下成分及重量份组成：磷酸二氢钾5~10份、氢氧化钠2~8份、氯化钠1~3份、二氢黄酮甙0.1~1份、三聚磷酸钠1~4份、聚丙烯酸甲酯0.3~1.2份。维持ph的平衡，起到溶解保护作用，提高鱿鱼的持水能力，便于匀浆，调节离子强度，避免引起细胞渗透压改变，活性多肽分布均匀，有利于活性多肽溶出和提取。
析出剂由以下成分及重量份组成：硫酸铵3~5份、氯化钠1~3份、硝酸钾0.5~1份、纳他霉素0.2~0.6份和γ-亚麻酸1~3份。在短时间有效的使活性多肽析出并且不影响多肽的活性，提高活性多肽的提取率，使鱿鱼活性多肽提取时间缩短，保证较高的提取率。
步骤3中搅拌时间为10~15min,在2~10℃下静置2~3小时，置入离心机进行离心，离心转速9000~10000r/min,离心10~20min。通过搅拌使缓冲液与鱿鱼块的匀浆充分混合让活性多肽分布均匀，使用离心机取得上清液，除去无用的杂质。
蒸馏水中添加有二甲基甲酰胺2~3重量份和β-环糊精0.1~0.7重量份，可有效的去除鱿鱼表面杂质，使杂质溶解并清洗干净，避免提取过程中杂质对提取到的活性多肽和提取率的影响。
步骤2中缓冲液加入量按体积是鱿鱼块的2~3倍，保证缓冲液充分与鱿鱼块混合，而缓冲液起到维持ph的平衡，溶解保护作用，提高鱿鱼的持水能力，便于匀浆，调节离子强度，避免引起细胞渗透压改变，活性多肽分布均匀，有利于活性多肽溶出和提取。
步骤4中抽滤使用1~3层滤纸和1~2层的200~400目滤布抽滤，避免在预处理清洗后提取过程中有杂质参杂进提取液，进一步滤除上清液中杂质，保证提取的活性多肽纯度高且提取率也高。
有益效果：本发明在预处理中使用的蒸馏水中添加有二甲基甲酰胺和β-环糊精，可有效的去除鱿鱼表面杂质，使杂质溶解并清洗干净，避免提取过程中杂质对提取到的活性多肽和提取率的影响，在匀浆过程中使用的缓冲液可维持ph的平衡，起到溶解保护作用，提高鱿鱼的持水能力，便于匀浆，调节离子强度，避免引起细胞渗透压改变，活性多肽分布均匀，有利于活性多肽溶出和提取，在上清液中添加析出剂可在短时间有效的使活性多肽析出并且不影响多肽的活性，提高活性多肽的提取率，使鱿鱼活性多肽提取时间缩短，保证较高的提取率。本发明以鱿鱼为原料，从鱿鱼中提取活性多肽工艺简单，提取的活性多肽含量高，提取效果优异，提取的鱿鱼活性多肽具有很好的应用价值。
具体实施例
以下结合具体实施例作进一步详细描述：
实施例1：
一种鱿鱼活性多肽的提取方法，步骤如下：
1）预处理：将鱿鱼用蒸馏水洗净，切块；用蒸馏水去除鱿鱼中杂质，避免杂质对提取活性多肽的影响，切块为后续匀浆做工艺准备。
2）匀浆：往鱿鱼块中加入缓冲液冰浴匀浆；加入缓冲液稳定ph值，提高鱿鱼的持水能力，便于匀浆，调节离子强度，避免引起细胞渗透压改变，有利于活性多肽溶出和提取。
3）离心：将匀浆后的溶液进行搅拌，静置，离心取上清液；搅拌让匀浆液充分混合，利于多肽的提取，采用离心机取得上清液，便于后续的抽滤及提高活性多肽的提取率。
4）冻干：在上清液中加入鱿鱼0.3~1.2%重量份的析出剂，静置抽滤得到鱿鱼活性多肽，冻干保存。加入析出剂提高鱿鱼中的活性多肽析出，效果明显优异，由于活性多肽对环境的要求较高，故采用冻干保存方式。
缓冲液液ph为6.5~8，浓度为45~55mol/l，在此范围的ph值和浓度缓冲液与鱿鱼反应效果优异。
缓冲液由以下成分及重量份组成：磷酸二氢钾5~10份、氢氧化钠2~8份、氯化钠1~3份、二氢黄酮甙0.1~1份、三聚磷酸钠1~4份、聚丙烯酸甲酯0.3~1.2份。起到维持ph的平衡，溶解保护作用，提高鱿鱼的持水能力，便于匀浆，调节离子强度，避免引起细胞渗透压改变，活性多肽分布均匀，有利于活性多肽溶出和提取。
析出剂由以下成分及重量份组成：硫酸铵3~5份、氯化钠1~3份、硝酸钾0.5~1份、纳他霉素0.2~0.6份和γ-亚麻酸1~3份。在短时间有效的使活性多肽析出并且不影响多肽的活性，提高活性多肽的提取率，使鱿鱼活性多肽提取时间缩短，保证较高的提取率。
步骤3中搅拌时间为10~15min,在2~10℃下静置2~3小时，置入离心机进行离心，离心转速9000~10000r/min,离心10~20min。通过搅拌使缓冲液与鱿鱼块的匀浆充分混合让活性多肽分布均匀，使用离心机取得上清液，除去无用的杂质。
蒸馏水中添加有二甲基甲酰胺2~3重量份和β-环糊精0.1~0.7重量份，可有效的去除鱿鱼表面杂质，使杂质溶解并清洗干净，避免提取过程中杂质对提取到的活性多肽和提取率的影响。
步骤2中缓冲液加入量按体积是鱿鱼块的2~3倍，保证缓冲液充分与鱿鱼块混合，而缓冲液起到维持ph的平衡，溶解保护作用，提高鱿鱼的持水能力，便于匀浆，调节离子强度，避免引起细胞渗透压改变，活性多肽分布均匀，有利于活性多肽溶出和提取。
步骤4中抽滤使用1~3层滤纸和1~2层的200~400目滤布抽滤，避免在预处理清洗后提取过程中有杂质参杂进提取液，进一步滤除上清液中杂质，保证提取的活性多肽纯度高且提取率也高。
实施例2：
一种鱿鱼活性多肽的提取方法，优选的步骤如下：
1）预处理：将鱿鱼用蒸馏水洗净，切块；用蒸馏水去除鱿鱼中杂质，避免杂质对提取活性多肽的影响，切块为后续匀浆做工艺准备。
2）匀浆：往鱿鱼块中加入缓冲液冰浴匀浆；缓冲液加入量按体积是鱿鱼块的优选3倍，保证缓冲液充分与鱿鱼块混合，加入缓冲液稳定ph值，提高鱿鱼的持水能力，便于匀浆，调节离子强度，避免引起细胞渗透压改变，有利于活性多肽溶出和提取。缓冲液液ph为优选7.2，浓度为优选50mol/l，在此的ph值和浓度缓冲液与鱿鱼反应效果优异。
3）离心：将匀浆后的溶液进行搅拌，静置，离心取上清液；搅拌时间为优选15min,在优选4℃下静置优选3小时，置入离心机进行离心，优选离心转速10000r/min,优选离心15min。通过搅拌使缓冲液与鱿鱼块的匀浆充分混合让活性多肽分布均匀，使用离心机取得上清液，除去无用的杂质。搅拌让匀浆液充分混合，利于多肽的提取，采用离心机取得上清液，便于后续的抽滤及提高活性多肽的提取率。
4）冻干：在上清液中加入鱿鱼优选的1.2%重量份的析出剂，静置抽滤得到鱿鱼活性多肽，冻干保存。抽滤使用优选3层滤纸和优选1层的优选300目滤布抽滤，避免在预处理清洗后提取过程中有杂质参杂进提取液，进一步滤除上清液中杂质，保证提取的活性多肽纯度高且提取率也高。加入析出剂提高鱿鱼中的活性多肽析出，效果明显优异，由于活性多肽对环境的要求较高，故采用冻干保存方式。
缓冲液由以下成分及重量份组成：优选磷酸二氢钾10份、优选氢氧化钠7份、优选氯化钠2份、优选二氢黄酮甙0.1份、优选三聚磷酸钠3份、优选聚丙烯酸甲酯0.8份。起到维持ph的平衡，溶解保护作用，提高鱿鱼的持水能力，便于匀浆，调节离子强度，避免引起细胞渗透压改变，二氢黄酮甙和三聚磷酸钠通过磷酸二氢钾保持活性多肽活性，提高多肽活性，聚丙烯酸甲酯是活性多肽分布均匀，有利于活性多肽溶出和提取，从而提高多肽提取率。
析出剂由以下成分及重量份组成：优选硫酸铵4份、优选氯化钠2份、优选硝酸钾0.7份、优选纳他霉素0.3份和优选γ-亚麻酸1份。在短时间有效的使活性多肽析出并且不影响多肽的活性，提高活性多肽的提取率，使鱿鱼活性多肽提取时间缩短，保证较高的提取率。
蒸馏水中添加有优选二甲基甲酰胺2重量份和优选β-环糊精0.5重量份，可有效的去除鱿鱼表面杂质，使杂质溶解并清洗干净，避免提取过程中杂质对提取到的活性多肽和提取率的影响。
本发明在预处理中使用的蒸馏水中添加有二甲基甲酰胺和β-环糊精，可有效的去除鱿鱼表面杂质，使杂质溶解并清洗干净，避免提取过程中杂质对提取到的活性多肽和提取率的影响，在匀浆过程中使用的缓冲液可维持ph的平衡，起到溶解保护作用，提高鱿鱼的持水能力，便于匀浆，调节离子强度，避免引起细胞渗透压改变，活性多肽分布均匀，有利于活性多肽溶出和提取，在上清液中添加析出剂可在短时间有效的使活性多肽析出并且不影响多肽的活性，提高活性多肽的提取率，使鱿鱼活性多肽提取时间缩短，保证较高的提取率。本发明以鱿鱼为原料，从鱿鱼中提取活性多肽工艺简单，提取的活性多肽含量高，提取效果优异，提取的鱿鱼活性多肽具有很好的应用价值。
应当理解，这些实施案例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。