本发明涉及一种采用三液相浮选与高效制备液相色谱仪联用，从中药材甘草中分离纯化甘草酸和甘草异黄酮乙的方法。
背景技术：
甘草是一味古老的植物药，在中国、希腊和印度的古代医药中均有记载，至今已有几千年的医用历史，临床用于治疗免疫系统、呼吸系统、消化系统等多种疾病。到目前为止，从甘草中分离得到的化合物已有400多种，其中的生物活性成分（例如三萜皂苷、黄酮及酚类化合物）均表现出抗炎、抗菌、抗氧化、抗hiv等重要的药理作用。
目前，针对甘草中有效成分提取工艺的研究已有大量报道，但同时针对其中几种具体成分进行分离纯化的研究仍然较少。作为一种中药材，甘草常以煎煮取汤的方式获得其有效成分。然而，对于煎煮获得的大量水提液而言，常规的前处理方法（溶剂萃取、吸附技术和溶剂蒸发等）需要大量的有机试剂，不仅耗时且成本较高。因此，选用一种操作简单、高效、有机试剂消耗少、绿色环保的前处理方法显得尤为重要。
针对大量水样的处理问题，溶剂浮选技术具有独特的优势。其原理在于，水样中待分离物质由于较小的表面张力易附着在气泡表面，在自下而上的气流带动下，随气泡逐渐上升至浮选柱顶部，气泡于相与相之间的界面处破裂，待分离物质即溶解于与其极性、密度等性质相近的溶剂中，从而达到分离的效果。溶剂浮选技术具有操作简便、分离过程温和、分离效率高、富集系数高和有机溶剂消耗量低等优点，广泛用于天然产物中活性物质分离、样品前处理、水中有机污染物分离等领域。
结合三液相萃取技术，在传统的两相溶剂浮选基础上加以改进，本发明首次提出了三液相浮选技术。它采用极性较小的有机溶剂为上相，聚合物溶液为中间相，较高盐浓度的甘草水提液为下相。由于三相极性的差异，在浮选过程中，水相中待分离物质根据相似相容原理，富集在与其极性相近的不同相中，从而实现分离富集。三液相浮选技术可初步实现极性相差较大的目标物的分离，减少后续的纯化步骤步骤，节能环保。
本发明建立了三液相浮选-高效制备液相分离纯化甘草中甘草酸和甘草异黄酮乙的方法。该方法操作简单，简便易行，且过程温和，分离效率高，对甘草酸和甘草异黄酮乙的分离纯化具有实际意义，也为天然产物有效成分的分离纯化提供了新的思路。
技术实现要素：
本发明的目的是通过水提法从甘草中获得目标成分，然后通过三液相浮选和高效制备液相色谱分离纯化，得到甘草酸和甘草异黄酮乙，纯度分别为93%、和95%以上。
本发明的方案是：通过水提法获得的甘草样品经三液相浮选进行分离富集，再通过高效制备液相色谱分离制备高纯度甘草酸和甘草异黄酮乙。选择三液相浮选溶剂体系，有三个组分构成，a组分是甘草水提液（加盐），b组分是peg1000水溶液（w:w=1:1），c组分是乙酸乙酯。a作为下相，b作为中相，c作为上相，调节a:b:c三组分的体积比为600-200:10-30:10-30，溶液ph为7，盐浓度为250-400g/l，氮气流速为20-60ml/min，浮选时间20-60min，经过一次浮选实现甘草酸和甘草异黄酮乙的初步分离。
首先在浮选柱中加入上述三液相浮选体系，然后调节氮气流速，开始浮选。浮选结束后收集上相和中相样品，采用高效制备液相色谱仪（岛津），包括：lc-6ad高压输液泵（两个）；spd-20a二极管阵列检测器；cbm-20a中央系统控制器；lc-solution工作平台。色谱柱选择ymc-packods-a制备柱（250mm×20mmi.d.,5μm）；紫外检测波长250nm；柱温为室温；流动相为a：乙腈，b：水；流速8ml/min。分离中相样品时，进样量0.5-1.5ml，0-25min，21%-21%a；25-30min，21%-45%a；30-50min，45%-55%a。分离上相样品时，进样量0.2-0.7ml，0-10min，50%-60%a；10-22min，60%-60%a；22-52min，60%-75%a。
通过本方法获得的甘草酸和甘草异黄酮乙的纯度分别高达93%和95%以上。适用于三液相浮选与各种型号的高效制备液相色谱仪联用，从甘草水提液中分离制备甘草酸和甘草异黄酮乙单体。