合成5,6,4＇‑三羟基黄酮‑7‑0‑D‑葡萄糖醛酸有关物质及其制备方法和应用与流程

本发明涉及药物化学技术领域，尤其涉及一种合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质及其制备方法和应用。

背景技术：

5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸，又名灯盏花乙素、野黄芩苷，是从菊科飞蓬属植物短亭飞蓬(eriger0nbreviscapus)的全草(又名灯盏细辛)中提取的黄酮类混合物的主要有效成分，分子式为c21h18012，分子量为462.37，其结构式如式ⅳ所示：

临床研究表明5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸对高血压、脑出血、脑血栓形成，脑栓塞多发性神经炎，慢性蛛网膜炎及其后遗症具有较好疗效，并对风湿病、冠心病也有一定疗效。此外大量的研究证实5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸具有抗炎、抗氧化、蛋白激酶抑制剂作用，还具有对糖尿病、肾病、风湿类风湿等疾病的治疗作用。因此，目前5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸临床上广泛用于治疗脑血栓、脑梗塞、多发性神经炎、慢性蛛网膜等脑血管意外所致瘫痪以及冠心病、心绞痛、治疗痛风性关节炎等症。

目前除了植物提取的合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸，合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸作为改良型创新原料药，具有良好的市场前景。但是合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸杂质谱不同于目前上市的植物提取5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸，对于合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸的有关物质目前尚无研究。杂质的存在将影响产品使用的安全性，按照新药开发过程中杂质控制的相关指导原则的要求，应对样品中杂质进行彻底研究，严格控制。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质及其制备方法和应用。

本发明提供的合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质或其盐，结构如式(ⅰ)所示：

本发明所述的合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸是指通过化学合成的方法制备的5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸。具体制备方法参照昆药集团申请号分别为cn201210114758.9，cn201210114894.8，pct/cn2012/086543的专利申请。

所述合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸含量大于99％，其中含有微量的合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质，含量低于0.5％。

本发明还提供了上述合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质的制备方法，包括以下步骤：

1)式(ⅱ)所示化合物在催化剂的作用下，进行选择性消除反应，生成式(ⅲ)所示化合物；所述催化剂为1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(dbu)、吡啶和4-二甲氨基吡啶(dmap)中的任意一种或几种；

2)式(ⅲ)所示化合物进行水解反应，得到式(ⅰ)所示化合物；

其反应方程式如下：

本发明首先以1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(dbu)、吡啶和4-二甲氨基吡啶(dmap)中的任意一种或几种作为催化剂，式(ⅱ)所示化合物在催化剂的作用下，进行选择性消除反应，选择性的脱去一分子水，生成式(ⅲ)所示化合物。上述催化剂有助于提高选择性消除反应的速率和选择性。

所述选择性消除反应优选在溶剂中进行，在本发明的某些具体实施例中，所述溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、甲苯、四氢呋喃和1,4-二氧六环中的任意一种或几种。

在本发明的某些具体实施例中，所述式(ⅱ)所示化合物与催化剂的摩尔比为1：(0.1～5)，在某些实施例中为1：(0.2～3)，在一些实施例中为1:1。

所述选择性消除反应的温度为10～30℃，反应时间为3～20h，在某些实施例中为4～6h，在一些实施例中为8h，在一些实施例中为10h。

优选的，所述步骤2)具体为：式(ⅲ)所示化合物在无机碱催化下进行水解反应，然后加入无机酸调节体系ph值至2～3，进行中和反应，得到式(ⅰ)所示化合物。

在本发明的某些具体实施例中，所述无机碱选自氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化钾、碳酸钾和碳酸钠中的任意一种或几种。

所述无机酸选自盐酸、硫酸、乙酸、甲酸、硝酸和磷酸中的任意一种或几种。

所述水解反应的溶剂选自丙酮、水、甲醇、乙醇、二氯甲烷、二甲基亚砜、四氢呋喃和二氧六环中的任意一种或几种。

所述水解反应的温度优选为-10～40℃，在某些实施例中为-8～0℃，在一些实施例中为-5℃；反应时间优选为1～10h，在某些实施例中为2～4h，在一些实施例中为3h，在一些实施例中为2h，在一些实施例中为4h。

所述式(ⅲ)所示化合物与无机碱的摩尔比优选为1：(0.1～50)，在某些实施例中为1：(10～30)，一些实施例中为1:25，一些实施例中1:15，一些实施例中1:20。

所述中和反应的温度优选为-10℃～40℃，在一些实施例中为-5℃。

在本发明的某些具体实施例中，可以进一步采用常规方法如重结晶进行提纯，得到符合要求纯度的杂质对照品。

本发明通过hplc法、uv吸收法、核磁共振、ms谱分析对上述合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质进行了结构验证。

本发明所述5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质的结构确证包括以下步骤：

步骤1、hplc法证实制备所得5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b与昆药集团股份有限公司合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸中有关物质(杂质)b的保留时间完全一致。

步骤2、uv谱图证实制备所得5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b与昆药集团股份有限公司合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸中有关物质b特征峰完全一致。

步骤3、核磁共振氢谱、碳谱对制备所得5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b的化学结构进行了确证。

步骤4、经ms谱分析，证实昆药集团股份有限公司合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸中有关物质b，与制备所得5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b，具有相同的分子离子信号。

本发明所述结构确证方法步骤1中，色谱条件流动相和体积比为：流动相a:water/tfa＝1000/1(v/v)，流动相b:acet0nitrile/tfa＝1000/1(v/v)，样品溶剂:acetonitrile/dmso＝50/50(v/v)。

本发明所述结构确证方法步骤3和步骤4证实了5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸杂质b的化学结构如式ⅰ所示。

本发明还提供了上述合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质或其盐或上述制备方法制备的合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质，在合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸或其制剂有关物质检测时，作为对照品的应用。

具体的，可应用于合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸或其制剂的杂质分析控制、药理毒理研究等。

本发明以5,6,4’-三乙酰氧基黄酮-7-o-d-三乙酰氧基葡萄糖醛酸甲酯(结构式如式ⅱ所示)为原料，经选择性消除和水解两步反应，成功制备得到5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b，并进一步纯化，最终获得5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b单体，进行确证后得出该有关物质化学结构。该方法合成路线短、成本低、操作简单，结果准确，产品纯度高，反应收率高，产品易于纯化，可用于合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸样品的杂质分析控制，有利于合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸的质量控制，更好的保障了产品质量。

附图说明

图1是实施例1制备的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b(批号：20140913)的hplc分析谱图；

图2是昆药集团股份有限公司合成的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸(批号20140424-1)的hplc分析谱图；

图3是实施例1制备的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b(批号20140913)以5％质量分数加入到5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸(批号20140424-1)的hplc分析谱图；

图4是昆药集团股份有限公司合成的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸(批号20140424-1)中5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b的uv谱图；

图5是实施例1制备的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b(批号20140913)的uv谱图；

图6是实施例1制备的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b(批号20140913)的hplc分析谱图；

图7是合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸(批号20140424-1)+实施例1制备的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b(20140913)的ms谱图；

图8是实施例1制备的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸杂质b(20140913)的ms谱图；

图9是合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸(批号20140424-1)的ms谱图。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质(以下简称5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b)及其制备方法和应用进行详细描述。

实施例1

(1)化合物ⅲ的制备

20g(27.4mmol)5,6,4’-三乙酰氧基黄酮-7-o-d–三乙酰氧基葡萄糖醛酸甲酯溶解于200ml甲苯中，然后搅拌下缓慢滴加入1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(dbu)4.1g(27mmol)，30℃下搅拌反应约8小时反应完全。反应混合物搅拌下加入约500ml乙酸乙酯，用500ml水洗两次。分出水层后的有机层中加入适量无水硫酸钠干燥，减压蒸干。硅胶柱层析并用石油醚：乙酸乙酯＝5：1(v/v)的洗脱剂洗脱，得15g白色固体化合物ⅲ,色谱纯度98.00％以上，收率为82％。

¹h-nmr(400mhz,dms0),δ(ppm):7.95(2h,d,j＝8.6hz),7.51(1h,s),7.32(2h,d,j＝8.6hz),6.78(1h,s),6.15(1h,d,j＝7.8hz),5.57(1h,d,j＝10hz),5.38(1h,m),4.94(1h,m),3.67(3h,s),2.34(3h,s),2.31(3h,s),2.25(3h,s),2.02(3h,s),2.01(3h,s).

(2)5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b的制备

13.4g(20mmol)化合物ⅲ中加入200ml丙酮和200ml水的混合溶剂，在-5℃搅拌下缓慢滴加10％的naoh水溶液200ml，搅拌反应约三小时后，经tlc监测反应已完全。-5℃下缓缓向反应液中滴加2mol/l盐酸水溶液中和反应液至ph为2～3，持续搅拌一小时并逐渐升至室温，反应液中渐渐有黄色固体5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸析出。室温下静置过夜，过滤，滤饼用适量水和丙酮洗，干燥后用乙醇重结晶得到8g5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b，批号记为20140913，收率为89％。hplc检测，纯度为98.88％，hplc检测的色谱图和统计结果见图1和表1，表1是图1的数据汇总。

¹h-nmr(400mhz,dms0),δ(ppm):12.78(1h,s),10.51(1h,s),8.71(1h,s),7.93(2h,d,j＝8.8hz),7.11(1h,s),6.94(2h,d,j＝8.8hz),6.83(1h,s),5.99(1h,d,j＝3.6hz),5.81(1h,d,j＝5.6hz),5.74(1h,s),5.28(1h,s),4.14(1h,dd,j＝4.0,4.5hz),3.84(1h,dd,j＝4.5,6.0hz).

表1图1的数据汇总

实施例2

(1)化合物ⅲ的制备

20g(27.4mmol)5,6,4’-三乙酰氧基黄酮-7-o-d–三乙酰氧基葡萄糖醛酸甲酯溶解于200ml二氯甲烷中，然后搅拌下缓慢加入4-二甲氨基吡啶(dmap)1.7g(13.7mmol,0.5eq)，25℃下搅拌反应约10小时反应完全。反应混合物搅拌下加入约300ml乙酸乙酯，用500ml水洗两次。分出水层后的有机层中加入适量无水硫酸钠干燥，减压蒸干。硅胶柱层析并用石油醚：乙酸乙酯＝5:1(v/v)的洗脱剂洗脱，得14.3g白色固体化合物ⅲ,色谱纯度98.00％以上，收率为78％。核磁鉴定结果与实施例1结果一致。

(2)5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b的制备

13.4g(20mmol)化合物ⅲ中加入200ml丙酮和200ml水的混合溶剂，在0℃搅拌下缓慢滴加10％的氢氧化钾水溶液220ml，搅拌反应约四小时后，经tlc监测反应已完全。0℃下缓缓向反应液中滴加乙酸中和反应液至ph为2～3，持续搅拌一小时并逐渐升至室温，反应液中渐渐有黄色固体5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b析出。室温下静置过夜，过滤，滤饼用适量水和丙酮洗，干燥后用乙醇重结晶得到7.4g5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b，收率为83％。hplc检测，纯度达98.00％以上，核磁鉴定结果与实施例1结果一致。

实施例3

(1)化合物ⅲ的制备

20g(27.4mmol)5,6,4’-三乙酰氧基黄酮-7-o-d–三乙酰氧基葡萄糖醛酸甲酯溶解于200ml四氢呋喃中，然后搅拌下滴加入吡啶6.5g(82.2mmol)，25℃下搅拌反应约6小时反应完全。反应混合物搅拌下加入约200ml乙酸乙酯，用500水洗两次。分出水层后的有机层中加入适量无水硫酸钠干燥，减压蒸干。硅胶柱层析并用石油醚：乙酸乙酯＝5:1(v/v)的洗脱剂洗脱，得14.7g白色固体化合物ⅲ,色谱纯度98.00％以上，收率为80％。核磁鉴定结果与实施例1结果一致。

(2)5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b的制备

13.4g(20mmol)化合物ⅲ中加入200ml丙酮和200ml水的混合溶剂，在5℃搅拌下缓慢滴加10％的氢氧化锂水溶液190ml，搅拌反应约两小时后，经tlc监测反应已完全。5℃下缓缓向反应液中滴加2mol/l硫酸水溶液中和反应液至ph为2～3，持续搅拌一小时并逐渐升至室温，反应液中渐渐有黄色固体5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b析出。室温下静置过夜，过滤，滤饼用适量水和丙酮洗，干燥后用乙醇重结晶得到7.6g5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b，收率为85％。hplc检测，纯度达98.00％以上，核磁鉴定结果与实施例1结果一致。

实施例4结构确证

1、hplc确证合成制备所得化合物为合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸中的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b：

hplc色谱条件如下：

hplc系统：watersalliance2695四元泵

watersalliance2998pda检测器

watersalliance2695自动进样器

watersalliance2695柱温箱

empower2网络版工作站

色谱柱:agilentzorbaxsb-c8,5um,250x4.6mmpn:880975-906

流速:1.0ml/min.

检测波长:uv254nm

进样体积:10ul

柱温:30℃

自动进样器温度:5℃

流动相a:water/tfa＝1000/1(v/v)

流动相b:acetonitrile/tfa＝1000/1(v/v)

样品溶剂:acetonitrile/dms0＝50/50

样品浓度:1.0mg/ml

实施例1合成制备获得的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b(批号：20140913)，与合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸(批号20140424-1)中含有的杂质b的等同性验证：

分别对合成制备所得5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b、合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸进行hplc分析(谱图如图1、图2所示)，表2是图2的数据汇总。再将约5％的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b标准品，加入昆药集团股份有限公司合成的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸样品(批号20140424-1)，进行hplc分析(谱图如图3所示)，表3是图3的数据汇总。

分析结果显示，合成制备获得的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b标准品出峰位置与5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸中本身含有的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b完全吻合。

对二者的uv吸收进行检测，谱图如图4、图5所示，结果表明两者的uv吸收图谱完全一致。因此它们的等同性可以得到确认。

表2图2的数据汇总

表3图3的数据汇总

2、质谱和lc/ms解析

测试条件：

质谱：waterssqd

软件：watersempower2网络版

source:120℃desolvati0n:300℃capilary:3.5kv

lc-ms:

流动相a:超纯水(milliporeultrapurewatersystem，resistivity：18.2mω.cm)+0.1％甲酸

pumpb:色谱纯乙腈(merckkgaa64271,hypergradeforlc-ms)+0.1％甲酸

色谱柱：t3(3μm)，100×4.6mm

柱温:30℃

检测波长:λ＝254nm,230nmand218nm/pda

流速:1.0ml/min

谱图见图6、图7、图8和图9。

由上述谱图可知，对5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸(批号20140424-1)中含有的杂质b，以及合成制备的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸杂质b(批号201409132)进行lc/ms分析，均显示其分子量为444([m-h]^-443)(见图8和图9)。由其分子量可以推测，杂质b应该是5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸脱一分子水后的产物。并且，5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸中本身含有的杂质b，与合成制备的杂质b，具有相同的分子离子信号。

3、5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸杂质b的核磁共振谱图解析

核磁共振氢谱：

仪器型号：brukeravanceiii400spectrometer(z115310,sn10032129)

溶剂：[d6]dmso(d,99.9％)+0.03％v/vtms,10*0.6mlampoule,cambridgeisotopelaboratories,inc.,lot12a-029

温度：25℃

测试数据见表4。

表4核磁共振氢谱数据汇总

核磁共振¹³c谱：

仪器型号：brukeravanceiii400spectrometer(z115310,sn10032129)

溶剂：[d6]dmso(d,99.9％)+0.03％v/vtms,10*0.6mlampoule,cambridgeisotopelaboratories,inc.,lot12a-029

温度：25℃

结果见表5。

表55,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸杂质b的核磁共振碳谱分析

由以上结果可知，ms一级谱给出了杂质准确的分子量信息：m/z442.7,与5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸脱一分子水后所得的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b分子量一致。hplc谱确证了制备所得5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b与合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸中5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b的保留时间完全一致，且uv谱证实了二者的特征吸收峰完全一致。核磁共振氢谱和碳谱，证实了5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质(杂质)b化学结构如式(ⅰ)所示：

由上述实施例可知，本发明证实了上述5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸有关物质b的结构，并成功制备得到该化合物，且具有较高的纯度，可以直接用于合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-d-葡萄糖醛酸的杂质分析控制，以此基础制订了严格的杂质限度，为将来产品的安全使用提供了理论依据。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。