一种鸡干扰素IFN‑λ与IFN‑α的融合蛋白的制作方法

本发明属于生物工程技术领域的基因融合表达，具体涉及一种融合鸡λ、α干扰素基因及其制备方法和应用。

背景技术：

干扰素(interferon,IFN)是一种在特定的诱导剂作用下，宿主细胞产生的一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和增强免疫功能的细胞因子，其本质为分泌性多功能糖蛋白。1957年被英国科学家lsaacs研究病毒间相互作用时首次发现，其本质为蛋白质，由病毒诱导产生，干扰病毒复制，限制病毒感染。根据干扰素来源，氨基酸序列及生物活性不同，干扰素被分为三大类，分别为Ⅰ型干扰素，包括IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-κ、IFN-ω和IFN-τ，其中IFN-α与IFN-β的研究比较成熟；Ⅱ型干扰素为IFN-γ，但其功能主要为调节免疫功能，抗病毒效应不强；Ⅲ型干扰素包括IFN-λ1(IL-29),IFN-λ2(IL-28A)，IFN-λ3(IL-28B)与2013年新发现的IFN-λ4。IFN-α属于Ⅰ型干扰素,由582个核酸构成，除去93个信号肽后，共编码162个氨基酸。不同种鸡IFN-α间相对保守，核苷酸同源性在99.3％以上。能够在大部分细胞中被病毒诱导产生，虽然不直接作用于病毒粒子，但由于其能很快诱导宿主细胞产生抗病毒蛋白，所以一直以来Ⅰ型干扰素都是研究热点之一。研究表明鸡IFN-α能够抑制H5N1病毒繁殖，同时对新城疫疫苗免疫也有一定影响。IFN-λ(interferonλ)，又称Ⅲ型干扰素，是继干扰素Ⅰ，Ⅱ之后发现的一类新型干扰素。通过与其特异性异二聚体复合受体(IFN-λR1/IL-10R2)结合，激活JAK-STAT信号通路，从而发挥抗病毒效应。由于其受体特异性，导致IFN-λ有着不同于Ⅰ型干扰素的其他优势，人IFN-λ的研究日益增多，但对鸡IFN-λ的研究尚浅，少量研究表明鸡IFN-λ在气管环实验中可抑制流感病毒的增殖。目前尚无将这两个鸡干扰素串联表达并检测其抗病毒活性的例子。

新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒引起的鸡和多种禽类发病的急性高度接触性传染病。该病的主要发病特征为呼吸困难、神经紊乱、下痢、粘膜和浆膜出血。由于新城疫毒株不同，新城疫患病动物的严重程度有很大差异。该病传播迅速，死亡率很高，严重危害养禽业，对世界经济造成了巨大损失。

技术实现要素：

为了弥补两种干扰素的缺陷，实现两种干扰素的优势互补。本发明所述的鸡干扰素IFN-λ与IFN-α的融合蛋白生产简便，成本低，活性高，对新城疫和流感有良好的治疗效果。

本发明的第一目的是提供上述鸡IFN-λ与IFN-α融合蛋白。

本发明的另一目的是提供该融合蛋白的生产方法和原核表达质粒pET32a-IFNλ-linker-IFNα的制备方法。

本发明的再一目的是提供该融合蛋白在细胞上抑制病毒繁殖和在临床上治疗动物病毒性疫病的应用和效果。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种鸡IFN-λ与IFN-α融合基因(IFNλ-linker-IFNα)，其核苷酸序列如下：

CAGGTCACCCCGAAGAAGAGCTGCAGCCTCTCCAAGTACCAGTTCCCTGCACCTTTGGAGTTGAAGGCAGTGTGGAGGATGAAGGAGCAGTTTGAAGACATCATGCTGTTAACAAACAGAAAATGCAACACCAGACTCTTCCATCGGAAGTGGGACATAGCTGAGCTGTCGGTACCTGACCGAATCACCCTGGTGGAGGCTGAGCTGGACCTCACCATCACCGTGCTCACAAACCCCACAACCCAGAGACTGGCAGAGACGTGCCAACAGCCCCTGGCCTTCCTTACCCAAGTCCAGGAGGACCTGCGAGACTGCTTGGCCCTCGAGGCACCTTCACATCAGCCCTCTGGGAAACTGAGGCACTGGCTGCAGAAGCTGGAGACAGCCAAGAAGAAGGAGACCGCCGGCTGCCTGGAGGCCTCAGCCATCCTCCACATCTTCCAAGTACTGAACGACCTGCGGTGCGCAGCCCAGCGCGAGGATTGCACTTCTGGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGGTCGTGCAACCACCTTCGCCCCCAGGATGCCACCTTCTCTCACGACAGCCTCCAGCTCCTCCGGGACATGGCTCCCACACTACCCCAGCTGTGCCCACAGCACAACGCGTCTTGCTCCTTCAACGACACCATCCTGGACACCAGCAACACCCGGCAAGCCGACAAAACCACCCACGACATCCTTCAGCACCTCTTCAAAATCCTCAGCAGCCCCAGCACTCCAGCCCACTGGAACGACAGCCAACGCCAAAGCCTCCTCAACCGGATCCACCGCTACACCCAGCACCTCGAGCAATGCTTGGACAGCAGCGACACGCGCTCCCGGACGCGATGGCCTCGCAACCTTCACCTCACCATCAAAAAACACTTCAGCTGCCTCCACACCTTCCTCCAAGACAACGATTACAGCGCCTGCGCCTGGGAACACGTCCGCCTGCAAGCTCGTGCCTGGTTCCTGCACATCCACAACCTCACAGGCAACACGCGCACTTAG

以上所述鸡IFN-λ与IFN-α融合基因是通过重叠延伸PCR法(gene splicing by overlapextension，SOE-PCR)融合而成，分别将两个干扰素基因扩增出来之后，除去信号肽，再通过疏水性柔性氨基酸接头(linker)(G4S)3将鸡IFN-λ与IFN-α连接，克隆至原核表达载体pET32a(+)，通过BL21系统表达及纯化后，分别在体内与体外检测其抗病毒活性。

上述鸡IFN-λ与IFN-α融合基因是通过以下步骤获得：

(1)引物设计

引物设计是根据Genbank提供的鸡IFN-λ的基因序列(GenBank no.KF680102.1)与IFN-α的基因序列(GenBank no.AM049251.1)，通过SignalP预测并除去信号肽，设计两对引物，分别在上下游插入EcoR1与Hind3两个酶切位点，为IFN-λ-F,IFN-λ-R1，IFN-α-F1，IFN-α-R。然后分别在IFN-λ的下游以及IFN-α上游设计2个含有互补疏水性柔性氨基酸接头的引物IFN-λ-R2与IFN-α-F2。序列如下：

IFN-λ-F：CCGGAATTCCAGGTCACCCCGAAGAA

IFN-λ-R1：CCCAAGCTTCTAAGTGCAATCCTCGCGCTGGGC

IFN-λ-R2：

CTCCGCTACCGCCTCCACCAGAGCCTCCTCCACCAGTGCAATCCTCGCGCTGGGC

IFN-α-F1：CCGGAATTCTGCAACCACCTTC

IFN-α-F2：

TCTGGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGGTCGTGCAACCACCTTC

IFN-α-R：CCCAAGCTTCTAAGTGCGCGTGTTGCC

(2)基因克隆与鉴定

用SPF鸡胚自制鸡胚成纤维(CEF)细胞，使用新城疫GM毒株攻毒后，抽提RNA，经反转得到扩增鸡IFN-λ与IFN-α基因的模板cDNA，使用IFN-λ-F,IFN-λ-R1，IFN-α-F1，IFN-α-R引物扩增出鸡IFN-λ与IFN-α去信号肽的基因片段。

接下来用SOE-PCR方法将鸡IFN-λ与IFN-α基因融合：第一步，分别用IFN-λ-F,IFN-λ-R2与IFN-α-F2，IFN-α-R引物扩增出含有linker的两个基因片段；第二步，以第一步胶回收产物为模板，不加引物，PCR扩增10-15个循环；第三步，以第二步PCR产物为模板，用IFN-λ-F和IFN-α-R扩增PCR，得到的产物即鸡IFN-λ与IFN-α基因片段。

一种鸡IFN-λ与IFN-α融合蛋白(chIFN-λ+α)原核表达载体的构建

(1)将融合基因克隆至pMD-19T载体

将鸡IFN-λ与IFN-α融合基因连接至pMD-19T载体，16℃连接4h以上，转化至含氨苄琼脂平板，挑取单克隆菌放入LB培养基中摇菌，菌液PCR鉴定出阳性克隆，测序正确后扩大培养，提取质粒pMD-19T-chIFN-λ+α。

(2)pET32a-chIFN-λ+α重组质粒构建

分别将pMD-19T-chIFN-λ+α与pET32a空载体用EcoR1与Hind3快切酶双酶切，胶回收后用T4连接酶，常温连接30min以上，转化至含氨苄琼脂平板，挑取单克隆菌放入LB培养基中摇菌，菌液PCR鉴定出阳性克隆，测序正确后扩大培养，提取重组质粒pET32a-chIFN-λ+α。

本发明采用基因工程方法融合鸡IFN-λ与IFN-α，有以下有益效果：

(1)本发明利用Ⅰ、Ⅲ型干扰素的受体分布差异规律，利用基因工程方法将两者融合，有利于更高水平综合发挥两个干扰素的效果；

(2)本发明成功在包涵体中提取chIFN-λ+α融合蛋白，经变性、复兴、纯化后，能提取出较高浓度蛋白，为后续实验打下良好的基础。；

(3)本发明提取的融合蛋白chIFN-λ+α在体内、体外实验中均有良好的抗病毒效果。

附图说明

图1为PCR扩增的鸡IFN-λ基因琼脂糖核酸电泳图；其中，泳道M为DNA marker DL2000，泳道1为阴性对照，泳道2为chIFN-λ基因扩增结果。

图2为PCR扩增的鸡IFN-α基因琼脂糖核酸电泳图；其中，泳道M为DNA marker DL5000，泳道1，2为chIFN-α基因扩增结果，泳道3为阴性对照。

图3为SOE-PCR扩增的chIFN-λ+α基因琼脂糖核酸电泳图；其中，泳道M为DNA marker DL2000，泳道1为chIFN-λ+α基因扩增结果，泳道2为阴性对照。

图4为SDS-PAGE鉴定chIFN-λ+α蛋白表达结果图；其中，泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为pET-32a空载体对照，泳道2为chIFN-λ+α上清，泳道3为chIFN-λ+α包涵体沉淀。

图5为Western blot鉴定chIFN-λ+α蛋白表达结果图；其中，泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为pET-32a空载体对照，泳道2为chIFN-λ+α上清，泳道3为chIFN-λ+α包涵体沉淀。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但本发明并不限于此。

实施例1鸡IFN-λ与IFN-α(chIFN-λ+α)融合基因原核表达载体的构建

(1)相关引物设计与合成

引物设计是根据Genbank提供的鸡IFN-λ的基因序列(GenBank no.KF680102.1)与IFN-α的基因序列(GenBank no.AM049251.1)，通过SignalP预测并除去信号肽，设计两对引物，分别在上下游插入EcoR1与Hind3两个酶切位点，为IFN-λ-F,IFN-λ-R1，IFN-α-F1，IFN-α-R。然后分别在IFN-λ的下游以及IFN-α上游设计2个含有互补疏水性柔性氨基酸接头的引物IFN-λ-R2与IFN-α-F2。序列如下：

IFN-λ-F：CCGGAATTCCAGGTCACCCCGAAGAA

IFN-λ-R1：CCCAAGCTTCTAAGTGCAATCCTCGCGCTGGGC

IFN-λ-R2：

CTCCGCTACCGCCTCCACCAGAGCCTCCTCCACCAGTGCAATCCTCGCGCTGGGC

IFN-α-F1：CCGGAATTCTGCAACCACCTTC

IFN-α-F2：

TCTGGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGGTCGTGCAACCACCTTC

IFN-α-R：CCCAAGCTTCTAAGTGCGCGTGTTGCC

(2)基因克隆与鉴定

取10日龄SPF鸡胚，用镊子去除头、四肢和内脏，将鸡肉剪碎后胰酶消化4min,过滤，制成CEF细胞，传代一次之后，使用新城疫GM毒株攻毒，12h后，抽提RNA，经反转得到扩增鸡IFN-λ与IFN-α基因的模板cDNA，使用IFN-λ-F,IFN-λ-R1，IFN-α-F1，IFN-α-R引物进行扩增，反应体系如下：25μl Premix ExTaq酶，2.5μl模板DNA(cDNA)，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，蒸馏水补至50μl。反应程序如下：94℃预变性4min,94℃变性1min,55℃退火30s,72℃延伸40s,72℃延伸7min，其中第2至第4步35个循环。核酸电泳条带大小分别约561bp与582bp。

用SPF鸡胚自制鸡胚成纤维(CEF)细胞，使用新城疫GM毒株攻毒后，抽提RNA，经反转得到扩增鸡IFN-λ与IFN-α基因的模板cDNA，使用IFN-λ-F,IFN-λ-R1，IFN-α-F1，IFN-α-R引物扩增出鸡IFN-λ与IFN-α去信号肽的基因片段。

接下来用SOE-PCR方法将鸡IFN-λ与IFN-α基因融合：第一步，分别用IFN-λ-F,IFN-λ-R2引物扩增出含有linker的IFN-λ-linker片段，用IFN-α-F2，IFN-α-R引物扩增出含有linker的linker-IFN-α片段，将两者分别胶回收；第二步，以第一步胶回收产物为模板，等摩尔混合，不使用引物，PCR扩增，反应体系如下：10μl Premix ExTaq酶，8.4μl蒸馏水，第一步胶回收产物等摩尔混合共1.6μl，反应程序如下：94℃预变性4min,94℃变性1min,60℃退火30s,72℃延伸40s,72℃延伸7min，其中第2至第4步15个循环；第三步，以第二步PCR产物为模板，用IFN-λ-F和IFN-α-R扩增PCR，得到的产物即chIFN-λ+α基因片段。

(3)将融合基因克隆至pMD-19T载体

将chIFN-λ+α融合基因连接至pMD-19T载体，反应体系如下：5.0μl Ligation SolutionⅠ，0.5μl pMD 19-T vector，4.5μl chIFN-λ+αPCR回收产物。16℃连接4h以上，用DH5α感受态转化至含氨苄琼脂平板，37℃放置过夜，挑取单克隆菌放入含氨苄LB培养基中摇菌6-8h，菌液PCR鉴定出阳性克隆，反应体系如下：7.5μl Premix rTaq酶,6.1μl ddH₂O，0.2μl上游引物IFN-λ-F，0.2μl下游引物IFN-α-R，1.0μl菌液，反应程序如下：94℃预变性4min,94℃变性1min,55℃退火30s,72℃延伸40s,72℃延伸7min，其中第2至第4步30个循环。挑选鉴定阳性样品送测序，测序正确后扩大培养，提取质粒

pMD-19T-chIFN-λ+α。

(4)pET32a-chIFN-λ+α重组质粒构建

分别将pMD-19T-chIFN-λ+α与pET32a空载体用EcoR1与Hind3快切酶双酶切，反应体系如下：1.5μl EcoR1酶，1.5μl Hind3酶，5μl 10×Buffer,2-5μg质粒，ddH₂O补至50μl，37℃水浴30min。胶回收后用T4连接酶，酶切产物按照pMD-19T-chIFN-λ+α：pET32a空载体＝3:1的比例加入8μl，1μl T4连接酶，1μl T4连接Buffer，常温连接30min以上，转化至含氨苄琼脂平板，挑取单克隆菌放入含氨苄LB培养基中摇菌，菌液PCR鉴定出阳性克隆，送测序，测序正确后扩大培养，提取重组质粒pET32a-chIFN-λ+α。

实施例2蛋白表达与鉴定

将重组质粒pET32a-chIFN-λ+α用BL21感受态转化，单克隆菌扩大培养后，按照1:100比例接种氨苄LB培养基，37℃摇床培养，直至OD600nm值为0.6左右时，加入IPTG诱导表达后，菌液离心，弃上清，PBS重悬、离心清洗2次后，超声破碎仪200W裂解15min，4℃离心分离出沉淀，用预冷PBS清洗2次，用含8M尿素的Lysis Equilibration Buffer溶解包涵体，室温孵育60min，4℃离心出去不溶杂质，上清用0.45μm滤器过滤，将其与Ni柱结合，用不同浓度咪唑洗脱液洗脱直至OD280值为0，最后用含有250mmol/L咪唑的Elution Buffer洗脱，收集滤液。将滤液放入用EDTA处理过的透析袋中，分别用8M,6M,4M,2M,0M,PBS进行梯度透析，每次间隔12h，最后用SDS-PAGE鉴定。

实施例3体外抗病毒活性鉴定

将DF-1细胞铺板至96孔板细胞板，待长至80％-90％，将chIFN-λ+α以4倍梯度稀释100μl加入每孔，分别从4^-1-4^-10,，每个梯度24个重复，于37℃孵育12h，分别将100TCID50VSV,NDV,AIV病毒加入，100μl每孔，于37℃孵育1h，将病毒液弃掉，用PBS洗2次，换上2％血清DMEM，放于37℃48h，检测病毒含量。结果显示：chIFN-λ+α对DF-1细胞产生良好的保护能力，在体外DF-1细胞上有良好的VSV,NDV,AIV抗病毒活性，分别为3.2*10 ⁴IU/mg，4.6*10 ⁴IU/mg，1.5*10 ⁵IU/mg。

实施例4体内抗病毒活性鉴定

在2周龄SPF鸡上检测chIFN-λ+α抗病毒活性。给2周龄SPF鸡静脉注射100μgchIFN-λ+α，4h后，以同样的量再次进行静脉注射，再隔2h后注射攻新城疫病毒。之后1、3、5、7、9、11天采集咽拭子与泄殖腔拭子，普通鸡胚接胚检测排毒；每日观察鸡采食与精神状况；记录死亡情况。结果显示：chIFN-λ+α组对SPF鸡的保护率可达到25％,而攻毒对照组的存活率仅8％；此外，咽拭子与泄殖腔拭子结果显示，chIFN-λ+α组与攻毒对照组比较，可推迟3-7d排毒，且排毒量明显降低；chIFN-λ+α组的SPF鸡采食正常，精神良好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

华南农业大学

一种鸡干扰素IFN-λ与IFN-α的融合蛋白

（1） 鸡IFN-λ+α基因

CAGGTCACCC CGAAGAAGAG CTGCAGCCTC TCCAAGTACC AGTTCCCTGC ACCTTTGGAG 60

TTGAAGGCAG TGTGGAGGAT GAAGGAGCAG TTTGAAGACA TCATGCTGTT AACAAACAGA 120

AAATGCAACA CCAGACTCTT CCATCGGAAG TGGGACATAG CTGAGCTGTC GGTACCTGAC 180

CGAATCACCC TGGTGGAGGC TGAGCTGGAC CTCACCATCA CCGTGCTCAC AAACCCCACA 240

ACCCAGAGAC TGGCAGAGAC GTGCCAACAG CCCCTGGCCT TCCTTACCCA AGTCCAGGAG 300

GACCTGCGAG ACTGCTTGGC CCTCGAGGCA CCTTCACATC AGCCCTCTGG GAAACTGAGG 360

CACTGGCTGC AGAAGCTGGA GACAGCCAAG AAGAAGGAGA CCGCCGGCTG CCTGGAGGCC 420

TCAGCCATCC TCCACATCTT CCAAGTACTG AACGACCTGC GGTGCGCAGC CCAGCGCGAG 480

GATTGCACTg gtggaggagg cTCTGGTGGA GGCGGTAGCG GAGGCGGAGG GTCGTGCAAC 540

CACCTTCGCC CCCAGGATGC CACCTTCTCT CACGACAGCC TCCAGCTCCT CCGGGACATG 600

GCTCCCACAC TACCCCAGCT GTGCCCACAG CACAACGCGT CTTGCTCCTT CAACGACACC 660

ATCCTGGACA CCAGCAACAC CCGGCAAGCC GACAAAACCA CCCACGACAT CCTTCAGCAC 720

CTCTTCAAAA TCCTCAGCAG CCCCAGCACT CCAGCCCACT GGAACGACAG CCAACGCCAA 780

AGCCTCCTCA ACCGGATCCA CCGCTACACC CAGCACCTCG AGCAATGCTT GGACAGCAGC 840

GACACGCGCT CCCGGACGCG ATGGCCTCGC AACCTTCACC TCACCATCAA AAAACACTTC 900

AGCTGCCTCC ACACCTTCCT CCAAGACAAC GATTACAGCG CCTGCGCCTG GGAACACGTC 960

CGCCTGCAAG CTCGTGCCTG GTTCCTGCAC ATCCACAACC TCACAGGCAA CACGCGCACT 1020

TAG 1023

（2） 鸡IFN-λ基因

ATGGTATGCT ACGGGGTCAC AATTATTTTG GTGGGGACCC TGGGGTCCCT CCTGGTGGGT 60

GCCTTCCCCC AGGTCACCCC GAAGAAGAGC TGCAGCCTCT CCAAGTACCA GTTCCCTGCA 120

CCTTTGGAGT TGAAGGCAGT GTGGAGGATG AAGGAGCAGT TTGAAGACAT CATGCTGTTA 180

ACAAACAGAA AATGCAACAC CAGACTCTTC CATCGGAAGT GGGACATAGC TGAGCTGTCG 240

GTACCTGACC GAATCACCCT GGTGGAGGCT GAGCTGGACC TCACCATCAC CGTGCTCACA 300

AACCCCACAA CCCAGAGACT GGCAGAGACG TGCCAACAGC CCCTGGCCTT CCTTACCCAA 360

GTCCAGGAGG ACCTGCGAGA CTGCTTGGCC CTCGAGGCAC CTTCACATCA GCCCTCTGGG 420

AAACTGAGGC ACTGGCTGCA GAAGCTGGAG ACAGCCAAGA AGAAGGAGAC CGCCGGCTGC 480

CTGGAGGCCT CAGCCATCCT CCACATCTTC CAAGTACTGA ACGACCTGCG GTGCGCAGCC 540

CAGCGCGAGG ATTGCACTTA G 561

（3） 鸡IFN-α基因

ATGGCTGTGC CTGCAAGCCC ACAGCACCCA CGGGGGTACG GCATCCTGCT GCTCACGCTC 60

CTTCTGAAAG CTCTCGCCAC CACCGCCTCC GCCTGCAACC ACCTTCGCCC CCAGGATGCC 120

ACCTTCTCTC ACGACAGCCT CCAGCTCCTC CGGGACATGG CTCCCACACT ACCCCAGCTG 180

TGCCCACAGC ACAACGCGTC TTGCTCCTTC AACGACACCA TCCTGGACAC CAGCAACACC 240

CGGCAAGCCG ACAAAACCAC CCACGACATC CTTCAGCACC TCTTCAAAAT CCTCAGCAGC 300

CCCAGCACTC CAGCCCACTG GAACGACAGC CAACGCCAAA GCCTCCTCAA CCGGATCCAC 360

CGCTACACCC AGCACCTCGA GCAATGCTTG GACAGCAGCG ACACGCGCTC CCGGACGCGA 420

TGGCCTCGCA ACCTTCACCT CACCATCAAA AAACACTTCA GCTGCCTCCA CACCTTCCTC 480

CAAGACAACG ATTACAGCGC CTGCGCCTGG GAACACGTCC GCCTGCAAGC TCGTGCCTGG 540

TTCCTGCACA TCCACAACCT CACAGGCAAC ACGCGCACTT AG 582

（4）IFN-λ-F

CCGGAATTCC AGGTCACCCC GAAGAA 26

（5）IFN-λ-R1

CCCAAGCTTC TAAGTGCAAT CCTCGCGCTG GGC 33

（6）IFN-λ-R2

CTCCGCTACC GCCTCCACCA GAGCCTCCTC CACCAGTGCA ATCCTCGCGC TGGGC 55

（7）IFN-α-F1

CCGGAATTCT GCAACCACCT TC 22

（8）IFN-α-F2

TCTGGTGGAG GCGGTAGCGG AGGCGGAGGG TCGTGCAACC ACCTTC 46

（9）IFN-α-R

CCCAAGCTTC TAAGTGCGCG TGTTGCC 27