专利名称:稳定型γ-干扰素制剂的制备方法
本发明涉及一种γ干扰素制品。人体干扰素有三种，α、β及γ型。α及β型较稳定，临床主要用于非肠道给药，目前仍处于深入系统地临床研究之中。γ干扰素(此后简称IFN-γ)很不稳定，其水溶液在贮存、冷冻或冷冻干燥过程中活性容易下降，要得到适用于临床的稳定制品非常困难，有一系列的难题需要解决。γ干扰素抗肿瘤活性最强，一旦有了稳定的剂型，临床上将会广泛应用。
按照本发明，要使用的IFN-γ可以是任何衍生的人体γ干扰素，天然的或用再组合制得的，例如天然产生人体IFN-γ的浓缩物，亦即天然的IFN-γ(rIFN-γ)和再组合的IFN-γ(rIFN-γ)，即通过人工培养由基因变换得到的能产生人体IFN-γ的微生物而制备出的含人体IFN-γ的物质(参见European Patent Publication NO 0089676;Nucleic Acids Research 10，2487-2501，1982;Nature，295，503-508，1982;Nucleic Acids Research 10，3605～3615，1982〕。具体地说，前述r-IFN-γ包括由146个氨基酸组成的多肽(其氨基酸顺序见图1)以及多肽的各种(碎)片段，如氨基端空位片段和羧基端空位片段，氨基空位指多肽氨基端部缺少不足4个的氨基酸，这些片段也都是在多肽上第131个氨基酸以后的位置上，或者在氨基端空位的位置上分裂的。此外，r-IFN-γ还包括有多肽(和)被丝氨酸或苏氨酸取代了的属于多肽的半胱氨酸残余部分。
其中最宜使用含146个氨基酸的多肽和缺少C
s-T
r-C
s〔脱(C
s-T
r-C
s)IFN-γ〕的氨基端空位片段。
使用含人体IFN-γ浓度高的水溶液最为有利，高浓度可用基因再组合法做到。
人体IFN-γ的比活性最好要达到1×105至1×107国际单位/毫克(此后简写为IU/mg)，水溶液的活性应达到1×102至1×107IU/ml，最宜为1×104至1×107IU/ml。
葡聚糖及羟乙基淀粉，可用市场买得到的产品。但是本发明的制品用于临床的品级，应当完全与制备非肠道用血浆代用品的品级相同。葡聚糖的平均分子量为10，000～100，000，最好为40，000～70，000;羟乙基淀粉平均分子量为10，000～200，000，最宜为20，000～60，000或200，000。
IFN-γ水溶液中葡聚糖及羟乙基淀粉浓度应在1mg/ml以上，最宜为3～50mg/ml。
除葡聚糖及羟乙基淀粉外，还可把人体血清白旦白(HSA)加到制品中，加入量最宜为2～20mg/ml IFN-γ水溶液。
按照本发明，在人体IFN-γ水溶液中含有半胱氨酸残物时，此制品还可加入还原形硫化合物，如谷胱甘肽(已还原形)、硫辛酸、半胱氨酸、硫代二甘醇、硫代乙醇胺、单硫代甘油，二硫代苏糖醇及有1至7个碳原子的硫代链烷酸，其中以麸氨基硫(还原形)最宜。若允许共存时，这类还原形硫化合物最宜用量不低于0.1mg/ml，最好为0.5～10mg/ml IFN-γ溶液。
还可添加一种或几种氨基酸作稳定剂，如甘氨酸、谷氨酸、α氨基丙酸、生理可接受的盐类及衍生物，单糖类如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖及双糖类，如蔗糖、麦芽糖及乳糖等，这些都有进一步改善稳定性的作用。当然，这些物质也可有挑选地组合。
上述稳定剂中，蔗糖效果较好，掺入量应为10～50mg/mlIFN-γ水溶液。
此制品还可进一步添加表面活性剂，如Tween-20，缓冲剂，等渗剂(isotonizing agent)等。
按照本发明，人体IFN-γ制品为冷冻型或冷冻干燥型，可采用下述方法生产，例如，将葡聚糖或/及羟乙基淀粉加到含人体IFN-γ，浓度为1×102至1×107IU/ml的水溶液中，浓度达1mg/ml以上，最好为3～50mg/ml，亦可加入人体血浆白旦白(HSA)、蔗糖及其它剂。IFN-γ水溶液还可含有0.1mg/ml以上的还原硫化合物，最好为0.5～10mg/ml，及/或痕量表面活性剂，或者把还原形硫化合物及/或表面活性剂再加到这种溶液中，如前述稳定剂情况一样。
按照本发明，可以用冷冻这种水溶液的方法制得冷冻人体IFN-γ制品，通常冷到-80℃至-30℃，冷冻产物最宜贮存于-80℃至-10℃环境之中。减压干燥这种冷冻制品又可制得冷冻干燥IFN-γ制品，干燥压力不超过1毫米汞柱，温度在初期的冷冻温度到30℃范围之内。也可解冻冷冻制品，装入安瓿中，于减压下进行冷冻和干燥，制得冷冻干燥制品。
按照本发明，冷冻干燥的人体IFN-γ制品作为注射制剂，在生产时还有一系列其它步骤，诸如无菌过滤，消毒灌装及冷冻干燥等。
冷冻及冷冻干燥人体IFN-γ制品是有用的，因为在冷冻干燥及后来的贮存中其活性降低很小。
冷冻干燥制品为稳定的含人体IFN-γ固体，特别适宜于非肠道给药。冷冻干燥制品作为注射药剂，临用之前要先在1～100ml的注射蒸馏水、生理盐水、或注射葡萄糖溶液安瓿中溶解。采用适当的载体、赋形剂或稀释剂，这种制品也可用作眼、耳、鼻药制剂。
本发明的冷冻或冷冻干燥人体IFN-γ制品稳定、低毒，可以像已有的人体IFN-γ制品那样，用于各种目的。
IFN-γ的活性指的是抑制病毒生长繁殖的活性，用国际单位(IU)或单位(U)表示，按下述方法测定IU选择一种已确定了活力单位的IFN-γ国际标准样品，用标准样和待测样分别进行在人体羊膜衍生FL细胞系中对Sindbis病毒诱导细胞病变效应的抑制试验，然后根据所得数据之比率计算待测样品的活力。
U选择一种已确定了活力单位的IFN-γ国际标准样品和一种白血球衍生粗IFN-γ样品，进行在人体羊膜衍生FL细胞系中对口腔泡疹病毒(VSV)诱导细胞病变效应的抑制试验，比较所得数据，即可确定白血球衍生粗IFN-γ的活力;待测样品的IFN-γ活力，则通过在人体羊膜衍生的WISH细胞系中对VSV诱导细胞病变效应的抑制试验，测定其抗病毒活性，并以粗IFN-γ为标准，根据所得活力比率计算确定。测定中总是用标准IFN-γ样品进行平行试验。
溶液旦白含量根据假设E280nm＝1.0，相当于1mg计算。这样得到的国际单位(IU)与单位(U)之间的关系为
附图简要说明图1，说明含146个氨基酸的人体IFN-γ中氨基酸的顺序。
图2，说明参考举例4(ⅰ)中的细胞内容物PLC2的结构。
以下举例将详细说明本
发明内容
，但这并非指对本发明的限制。
举例中所用人体IFN-γ，除特别指明之外均用参考举例2(Ⅱ)中所介绍的方法制得。举例6中，人体IFN-γ用由参考举例3介绍的方法制得，举例8、9及10中的脱(C
s-T
r-C
s)IFN-γ用参考举例5介绍的方法制得。
〔举例1〕将60mg葡聚糖(平均分子量70，000)及0.5ml注射蒸馏水加到1ml含3mg谷胱甘肽的人体IFN-γ(2×105U/ml)水溶液中，再进行无菌过滤，得水溶液1.5ml，放入安瓿中，于-30℃下冷冻或冷冻干燥;冷冻干燥产物再用注射蒸馏水恢复原态，分析测定IFN-γ活力。
通常在进行冷冻干燥时，要另取IFN-γ溶液，加50mg D-甘露醇，而不加葡聚糖，作为对照样品。这种对照样溶液也要用相同的方法冷冻干燥。以冷冻干燥前人体IFN-γ的活力为基准，对照样品的剩余活力为61%，而本发明的冷冻干燥制品剩余活力为94%。
〔举例2〕取1ml人体IFN-γ(7×105U/ml)水溶液，内含3mg谷胱甘肽，加入30mg羟乙基淀粉(平均分子量200，000)和0.5ml注射蒸馏水，进行无菌过滤，得水溶液1.5ml，放入安中，于-30℃下冷冻或冷冻干燥。冷冻干燥产物中再加入注射蒸馏水，恢复原态，分别测定其IFN-γ活力。以冷冻或冷冻干燥之前的活力为基准，-30℃下的冷冻制品剩余活力为111%，冷冻干燥制品活力为117%。这表明了制品的稳定性。在-30℃下(冷冻制品)或在40℃下(冷冻干燥制品)贮存两周后，按照初期活力计算，二者剩余活力分别为121%及107%。
〔举例3〕按举例2的方法，另加10mg麸氨酸钠，于-30℃下贮存两周，冷冻干燥制品剩余活力为83%，冷冻制品为105%;在40℃下贮存两周后，冷冻干燥制品的剩余活力与贮存初期的制品的活力相比为105%。由此看来，产品稳定。
〔举例4〕按举例1的方法葡聚糖量减至30mg，另加5mg人体血浆白旦白(HSA)，在-30℃下贮存两周的冷冻干燥制品剩余活力为78%，冷冻制品为90%;贮存于40℃下两周后，冷冻干燥制品的剩余活力为贮存初期的112%，这也说明产品稳定。
〔举例5〕按照举例2的方法制备的IFN-γ溶液，另加蔗糖51mg，冷冻干燥，再用注射蒸馏水恢复原态，测定其人体IFN-γ活力，按冷冻干燥前的人体IFN-γ溶液的活力为准，其剩余活力为99%。
〔举例6〕取1ml按参考举例3的方法制备的人体IFN-γ水溶液(IFN-γ1.6×106IU/ml)，内含谷胱甘肽3mg，加入30mg羟乙基淀粉(平均分子量200，000)和0.5ml注射蒸馏水，进行无菌过滤，滤液1.5ml，装入安瓿中，进行冷冻干燥。冷冻干燥产物用蒸馏水恢复原态，测定人体IFN-γ活力。以冷冻干燥前水溶液的活力为基准，剩余活力为88%。
〔举例7〕取1ml用脱N2注射用蒸馏水配制的人体IFN-γ水溶液，浓度3.0×105IU/ml，与1.5ml的羟乙基淀粉(30mg)水溶液混合一起，在安瓿中冷冻干燥。冷冻干燥物再用注射蒸馏水恢复液态，测定其活力，剩余活力为冷冻干燥前的74%。
〔举例8〕取1ml按参考举例5的方法制得的脱-(C
s-T
r-C
s)的IFN-γ溶液(2.5×106IU/ml)，加入30mg平均分子量为70，000的葡聚糖和0.5ml注射蒸馏水，进行无菌过滤，滤液1.5ml，于安瓿中冷冻干燥。冷冻干燥产物用蒸馏水恢复液态，测定剩余活力，为92%。
〔举例9〕按照举例8的方法，另加30mg羟乙基淀粉，代替30mg葡聚糖，得到制品的剩余活力为95%。
〔举例10〕按举例9的方法，追加10mg麸氨酸钠。得到制品的剩余百分活力为104%。
〔参考举例1〕菌株RRI(pRK 248 CIts，pRC 231/IFI-900)，载有人体IFN-γ代表基因，放在M-9葡萄糖介质中于30℃下进行培养，直至细胞浓度达到3～4×108个细胞/ml，再加葡萄糖和酪氨酸至浓度各为1.0%及0.5%;于42℃下诱导1小时后，离心分离培养物，收集的细胞经冷冻后，贮存起来。(参阅例8日本未审查专利公告№189197/1983)
〔参考举例2〕取1000g按参考举例1方法得到的冷冻细胞，加100mM的Tris-氯化氢缓冲液(PH7.0)3000ml，Tris-氯化氢缓冲液中含7M盐酸胍及2mM酚乙基磺酰氟化物。于4℃下搅拌此混合物，离心分离(17000rpm)30分钟，得清净透明的上清液，再用简称PBS的缓冲液稀释70倍。PBS缓冲液含137mM氯化钠，27mM氯化钾、8mM磷酸氢二钠及147mM磷酸二氢钾。再用Sharples分离机(10，000rpm)除去沉淀，用Perico薄膜过滤器(Millipore Corp;截断分子量10，000)浓缩上清液(220l)到15l，置于40℃过夜;浓缩液又用Sharples离心机再次除去沉淀，得到的上清液以流速1000ml/hr引入装有抗体的滤柱(Ab(Moγ2-11.1);5×30cm)(参阅Specification Japanese patent application NO 176091/1983 filed on Sept.22，1983);此后将下述溶液依次通过此抗体柱2500ml PBS溶液，5000ml含1M氯化钠及0.1% Tween 20的磷酸盐(10mM)缓冲液，2500ml PBS及2500ml含0.5M盐酸胍(20mM)磷酸盐缓冲液(PH7.0)。最后，用后一种溶液冲洗抗体柱，得到500ml有抑制病毒活性的洗出馏分。
(Ⅱ)，取420ml上述洗出馏分，加谷胱甘肽(已还原形)，使之浓度达10mM，再引入到Sephacryl S-200(制药)滤柱(9×100cm)中。此滤柱事先需用25mM醋酸盐缓冲液进行补偿。醋酸盐缓冲液(PH6.0)含1mM乙二胺四醋酸盐、150mM氯化钠，10mM谷胱甘肽(被还原形)及2M盐酸胍。最后再用同样的缓冲液冲洗滤柱，收集单体洗出馏分(450ml)。这样处理得到的IFN-γ(0.410mg/ml)比活性为3.4×106IU/mg。
〔参考举例3〕取450ml按参考举例2制备的含单体IFN-γ洗出馏分，加入含10mM谷胱甘肽(已还原形)、150mM氯化钠、0.5M盐酸胍及0.01%Tween 20的醋酸盐(25mM)缓冲液(PH6.0)25ml，搅拌后即得旦白含量0.05mg/ml的低浓度溶液。再将此溶液通过Sephadex G-25滤柱(14×100cm)，用前述的醋酸盐缓冲液(PH6.0)冲洗滤柱，得无盐酸胍含IFN-γ的洗出馏分3180ml，旦白含量55.8mg/ml，溶液旦白浓度0.049mg/ml，旦白回收率84.8%，比活性3.5×106IU/mg(旦白)。Sephadex G-25滤柱事先需用前述组成的醋酸盐缓冲液补偿。
由上得到的溶液于4℃下老化48小时后，用Diaflo-PM10，直径43mm(Amicon超过滤薄膜)的超过滤膜浓缩至159ml，浓缩液清净透明，旦白浓度0.92mg/ml，旦白回收率93.9%(146.3mg)，IFN-γ比活性6.8×106IU/mg。
〔参考举例4〕生产脱-(C
s-T
r-C
s)IFN-γ(ⅰ)变换体产生IFN-γ的代表细胞内容物PRC23/IFI-900〔参见例7〕用限制酶NdeⅠ及NcoⅠ消化，分离出一个710bp的NdeⅠ-NcoⅠ DNA片段(A)，此片段(A)含IFN-γ基因域。此外，细胞内容物又分别被限制酶Bgl Ⅱ及Eco RⅠ所消化，又分离出一个265bp DNA片段(B)，此碎片段(B)含λ Pe促进于。片段A、B及用化学法合成的含旦白合成启动密码子的寡核苷酸
AATTCATGCAGGATCCAGTACGTCCTAGGTAT用T4-DNA连结酶，以Nde Ⅰ及Eco RⅠ粘性端作为连接点，使彼此又连接起来。这样得到的DNA片段，经过Nco Ⅰ及Bgl Ⅱ的作用与细胞内容物pRC 23/IFI-900相连结，构成了一个代表细胞内容物pLC2，密码为C
s-T
r-Cys空位的IFN-γ多肽(见图2)。这种细胞内容物。按照Cohn等人用的方法，用于传递Escherichia Coli RRI(pRK 248 cIts)〔P.N.A.S.(USA)，69，2110，1972〕，得到一种变换体，Escherichia Coli(＝E.Coli)PRI(pLC2，pRK 248 cIts)。
(ⅱ)变换体培养菌株E.Coli RRI(pLC2，pRK 248 cIts)，载有由(ⅰ)构成的细胞内容物，于35℃下，在50ml液体介质中进行震荡培养，此液体介质中含有1%细菌胰化旦白腖，0.5%酵母萃取物，0.5%氯化钠及7μg/ml四环素。然后将培养液移入2.5l的M9培养基中，于35℃下成长4小时，于42℃下成长3小时，最后用离心分离法摄取细胞，并将其贮存于-80℃环境中.M-9培养基含0.5%酪氨酸、0.5%葡萄糖及7μg/ml四环素。
(ⅲ)纯化过程取7.1g按(ⅱ)节方法制得的冷冻细胞，悬浮于22ml含7M盐酸胍及2mM酚基甲基磺酰氟的Tris-氯化氢(0.1M)缓冲液中，搅拌1小时(4℃)后，以10，000×g的速率离心分离30分钟，得24ml上清液，再用300ml PBS稀释，并引入到抗体柱(Moγ2-11.1，柱容量15ml)，流速ImI/min，然后用60ml含0.5M盐酸胍的磷酸钠(20mM)缓冲液洗柱，再用45ml含2M盐酸胍的磷酸钠缓冲液冲洗，得到25ml有抑制病活性的馏分，将此馏分通过Sephacryl S-200(制药)柱(2.6×94cm，柱容量500ml)，再用25mM的醋酸铵缓冲液(PH6.0)冲洗，得40ml有抗病毒活性的馏分。醋酸铵缓冲液含有1mM乙二胺四醋酸，0.15M氯化钠，10mM半胱氨酸及2M盐酸胍;Sephacryl S-200(制药)柱使用前需用此醋酸铵缓冲液补偿处理。
最后得到了(C
s-T
r-C
s)空位的IFN-γ多肽脱(C
s-T
r-C
s)IFN-γ，重7.0mg，比活性2.7×106IU/mg。
〔参考举例5〕取2.2ml由参考举例4(ⅱ)方法得到的含脱-(C
s-T
r-C
s)IFN-γ洗出馏分，旦白含量为0.331mg/ml，加入8倍体积的含150mM氯化钠及2M盐酸胍的醋酸盐(25mM)缓冲液，进行稀释(PH6.0)，搅拌，得到的低浓度溶液再通过Sephadex G25柱(2.6×15cm)，用含150mM氯化钠的醋酸盐缓冲液冲洗，得到无盐酸胍的脱(C
s-T
r-Cys)含IFN-γ的洗出馏分30ml。此馏分旦白浓度0.022mg/ml，清净透明，于4℃下老化24小时后，用Diaflo-PMIO，直径25mm超滤薄膜(Amicon超滤薄膜)浓缩至0.68ml，然后再用(0.2μm)过滤器过滤，得0.68ml清澈透明上清液，其旦白浓度0.67mg/ml，旦白回收率63%。Sephadex G-25柱事先用含150nM NaCl的醋酸盐缓冲液进行补偿处理。
图1中各符号意义如下Ala 丙氨酸Asn 天门冬酰胺Asp 天门冬氨酸Cys 半胱氨酸Gln 谷氨酰胺Glu 谷氨酸His 组氨酸Ile 异亮氨酸Leu 亮氨酸Lys 赖氨酸Met 旦氨酸Phe 苯丙氨酸Pro 脯氨酸Ser 丝氨酸Ihr 酪氨酸Val 缬氨酸Arg 精氨酸Gly 甘氨酸
权利要求
1.人体γ-干扰素制剂的制备方法，其特点是在人体γ-干扰素溶液中加入葡聚糖和(或)羟乙基淀粉，然后将所得到的溶液冷冻以制取冷冻制剂。如有必要的话，还可在减压下将冷冻制剂干燥，以制取冷冻干燥制剂。
2.按照权利要求
1的方法，其特点是人体γ-干扰素是再组合人体γ-干扰素。
3.按照权利要求
2的方法，其特点是再组合人体γ-干扰素是来源于高浓度的人体再组合γ-干扰素的水溶液。
4.按照权利要求
2的方法，其特点是再组合的人体γ-干扰素的比活性为1×105至1×107国际单位/毫克。
5.按照权利要求
1的方法，其特点是人体γ-干扰素制剂是浓度为1×102至1×107国际单位/毫升的水溶液。
6.按照权利要求
1的方法，其特点是制剂中含有葡聚糖。
7.按照权利要求
6的方法，其特点是葡聚糖的平均分子量为10000至100，000。
8.按照权利要求
1的方法，其特点是制剂中含有羟乙基淀粉。
9.按照权利要求
8的方法，其特点是羟乙基淀粉的平均分子量为10，000至200，000。
10.按照权利要求
1的方法，其特点是葡聚糖和(或)羟乙基淀粉是浓度为3～50毫克/毫升的水溶液。
11.按照权利要求
1的方法，其特点是，制剂中还含有人体血清白蛋白。
12.按照权利要求
1的方法，其特点是制剂中还含有双糖。
13.按照权利要求
12的方法，其特点是所说的双糖是蔗糖。
14.按照权利要求
1的方法，其特点是制剂中还含有氨基酸。
15.按照权利要求
1的方法，其特点是制剂中还含有还原硫化合物。
16.按照权利要求
15的方法，其特点是，该特点是该还原硫是谷胱甘肽(还原型)。
17.按照权利要求
15的方法，其特点是还原硫化合物是浓度为0.5～100毫克/毫升的水溶液。
18.按照权利要求
1的方法，其特点是制剂为冷冻形式。
19.按照权利要求
1的方法，其特点是制剂为冷冻干燥形式。
20.按照权利要求
1的方法，其特点是冷冻过程是在-80℃至-30℃的温度范围内进行的。
21.按照权利要求
1的方法，其特点是干燥过程是在减压下进行的，其压力不超过0.1毫米汞柱。
22.一种使人体γ-干扰素稳定的方法，其特点是将葡聚糖或羟乙基淀粉，或二者的混合物加入到人体γ-干扰素的水溶液中，然后将所得到的溶液冷冻，而且如有必要的话，还可将所制得的冷冻溶液在减压下进行干燥。
专利摘要
将葡聚糖或/及羟乙基淀粉加到人体γ-干扰素的水溶液中，进行冷冻，如果需要，还可以在减压下进一步干燥这种冷冻溶液，即可制备出一种稳定的人体γ-干扰素制品。
文档编号C07K14/52GK85101930SQ85101930
公开日1986年7月9日 申请日期1985年4月1日
发明者赤木弥三郎, 三浦泰幹, 星野哲夫 申请人:武田药品工业株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan