哺乳动物的环二核苷酸信号通路的药物靶向的制作方法
【专利说明】晡乳动物的环二核苷酸信号通路的药物靶向
[0001] 本发明在由美国国立卫生研究院（NIH)提供的基金编号ROI AI-093967的政府支 持下进行。政府对本发明具有一定的权利。
【背景技术】
[0002] 细胞质的DNA诱导I型干扰素和其它的细胞因子，其对于抗微生物防御是重要的， 但也可导致自身免疫。此DNA信号通路需要衔接蛋白STING和转录因子IRF3,但DNA传感 (DNA sensing)的机制尚不清楚。本文中，本发明人报道了在存在DNA而没有RNA的情况 下，哺乳动物细胞质提取物在体外从ATP和GTP合成了环GMP-AMP (cGAMP)。哺乳动物细胞 的DNA转染或DNA病毒感染也触发cGAMP的产生。cGAMP结合STING，导致激活IRF3并诱 导干扰素0 (IFNP)。因此，cGAMP代表了后生动物中的第一环二核苷酸，并且其作为响应 细胞质DNA而触发干扰素产生的内源第二信使起作用。
[0003] 通过生化分级和定量质谱，本发明人还确定了 cGAMP合酶（cGAS)，其属于核苷酸 转移酶家族。cGAS的过表达激活转录因子IRF3并以STING-依赖的方式诱导IFNP。敲除 cGAS抑制了经DNA转染或DNA病毒感染的IRF3激活和IFNI3诱导。cGAS在细胞质中结 合DNA并催化cGAMP合成。这些结果表明，cGAS是胞质DNA传感器，其通过产生第二信使 cGAMP诱导干扰素。
[0004] 本发明将这些发现应用于涉及环-GMP-AMP合酶（cGAS)和环-GMP-AMP (cGAMP)的 新方法和组合物，包括其在制剂（包括疫苗佐剂）、药物筛选、治疗方法和诊断中的用途。
【发明内容】
[0005] 在一个方面中，本发明提供了基于细胞的药物筛选，这包括抑制cGAS的方法，其 包括将细胞或细胞提取物与有效量的外源性cGAS抑制剂相接触，并检测所获得的合酶抑 制。在具体的实施方式中，通过环-GMP-AMP诱导的IRF3激活（二聚化或核转位）、干扰素 产生或NF-kB激活来推理检测所获得的抑制。
[0006] 在另一个方面中，本发明提供了治疗方法，这包括抑制cGAS的方法，其包括将确 定的有需求的细胞与有效量的外源cGAS抑制剂相接触。在具体的实施方式中，方法包括向 确定的有需求且包含所述细胞的哺乳动物施用抑制剂，和/或抑制剂是小分子环化酶抑制 剂或是cGAS特异性shRNA或siRNA。
[0007] 在另一个方面中，本发明提供了体外药物筛选，这包括抑制cGAS的方法，其包括 将包含合酶、ATP、GTP的混合物与抑制剂在条件下相接触，其中所述条件下抑制剂抑制了经 合酶的ATP和GTP到环-GMP-AMP和无机焦磷酸的催化转化，并检测所获得的合酶抑制。在 一个具体的实施方式中，混合物进一步包括DNA并且转化是DNA-依赖性的。在其它的实施 方式中，cGAS是组成型活性的。
[0008] 在另一个方面中，本发明提供了体外药物结合测定，这包括抑制cGAS结合到底物 或辅因子的方法，其包括将包含合酶和ATP或GTP的底物或DNA辅因子的混合物与抑制剂 在条件下相接触，其中所述条件下抑制剂抑制了合酶到底物或辅因子的结合，并检测所获 得的结合抑制。
[0009] 在另一个方面中，本发明提供了制备cGAMP的方法，所述方法包括在条件下形成 包含cGAS、ATP和GTP的混合物，其中所述条件下合酶催化转换ATP和GTP到cGAMP，其中 合酶、ATP和GTP是预定义量的，或者方法进一步包括分离或检测所获得的cGAMP的步骤。 在【具体实施方式】中，混合物进一步包括DNA并且转化是DNA-依赖性的。
[0010] 在另一个方面中，本发明提供了检测cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突变的方法， 所述方法包括以下步骤：检测来自人的样品中的cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突变，并基 于cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突变将所述的人分配一个自身免疫性疾病度量；和任选地 向所述的人施用用于自身免疫性疾病的治疗方法。
[0011] 在另一个方面中，本发明提供了包含预定量的cGAMP的组合物，如进一步包含针 对靶病原体的免疫原的疫苗，其中cGAMP提供了佐剂。在【具体实施方式】中，组合物不含其它 的环二核苷酸，和/或另外地，适合于作为佐剂或疫苗，例如无菌的，药学上可接受的，以确 定的、预定的量、比率等，并且组合物可以是为单个使用量化的散装或单位剂量。本发明还 提供了诱导或促进免疫应答的方法，包括向有需求的哺乳动物施用有效量的此类组合物。 在【具体实施方式】中，给药是粘膜（舌下或鼻内）、肌内或皮下给药。
[0012] 本发明包括所列【具体实施方式】的所有组合。进一步的实施方式和本发明的适用性 的全部范围将因下文所给出的详细描述而变得显而易见。然而，应当理解的是，详细描述和 具体实施例虽然表示了本发明的优选实施方式，但仅以说明的方式给出，这是因为本发明 的精神和范围内的各种变化和修改因这一详细描述而对于本领域技术人员而言变得显而 易见。
【具体实施方式】
[0013] 本发明提供了涉及cGAS和cGAMP的方法和组合物，这包括其在制剂（包括疫苗佐 剂）、药物筛选、治疗方法和诊断中的用途。
[0014] 要点：2' 3' -cGAMP是哺乳动物细胞所产生的内源性第二信使；2' 3' -cGAMP是 STING的高亲和配体；2' 3' -cGAMP是I型干扰素的强诱导物；2' 3' -cGAMP结合诱导了 STING 的构象变化。
[0015] 在一个方面中，本发明提供了基于细胞的药物筛选，这包括抑制cGAS的方法，药 物筛选包括将细胞或细胞提取物与有效量的外源性cGAS抑制剂相接触，并检测所获得的 合酶抑制。合酶通常地是人或鼠cGAS，并且可以在融合蛋白中被截断、重组，或进行其它修 改以适合分析。通常，方法是作为筛选分析进行的，其中抑制剂是用于分析的候选抑制剂， 其可能来自文库、先导化合物优化等。例如通过cGAMP诱导的IRF3激活（二聚化或核转 位）、干扰素产生或NF-kB激活直接或推理检测抑制，通过例如质谱、基于抗体的分析（例 如，ELISA、ALPHA、荧光偏振等）直接检测cGAMP和其它产物。例如，可以通过q-RT-PCR测 量IFN RNA，通过非变性凝胶电泳测量IRF3二聚化。另外的合适的读取包括ATP、GTP和焦 磷酸（PPi)的测量。
[0016] 在另一个方面中，本发明提供了治疗方法，这包括抑制cGAS的方法，治疗方法包 括将确定的有需求的细胞与有效量的外源cGAS抑制剂相接触。在具体的实施方式中，方法 包括向确定的有需求且包含所述细胞的哺乳动物施用抑制剂，和/或抑制剂是小分子环化 酶抑制剂，或是cGAS特异性shRNA或siRNA，或其它的RNAi或反义RNA cGAS特异性抑制 剂。
[0017] 本发明人的数据表明，cGAS和cGAS-cGAMP途径对于触发针对自身和外源DNA的炎 症反应是重要的，因此cGAS抑制剂可用于降低相关自身免疫性疾病的病原性cGAS活性。类 似地，本发明人的数据表明，cGAS对于从正常细胞到癌细胞的转化也是重要的，并且对于癌 细胞的生存和转移也是重要的，因此cGAS抑制剂可用于降低相关的肿瘤性（neoplastic) 疾病的病原性cGAS活性。
[0018]目前用于狼疮和其它自身免疫性疾病的治疗方法涉及大剂量的免疫抑制剂，其具 有严重的副作用。虽然一种新的BAFF抗体（Benlysta)已被批准用于治疗狼疮，但其只能 勉强有效。用小分子抑制剂（尤其是口服可用的那些）靶向cGAS提供了超过现有治疗 方法的显著的优点。cGAS抑制剂靶向于狼疮和其它自身免疫性疾病的根本原因，并为患 者提供了治疗益处。此外，在自身免疫性病况如全身性红斑狼疮（SLE)、Sj6gren综合征和 Aicardi-Goutiferes综合征下，细胞溶质的DNA先天免疫途径是异常激活的，并且cGAS抑制 为这些疾病和其它自身免疫性疾病提供了一种合理的治疗方法。
[0019] 在另一个方面中，本发明提供了体外药物筛选，这包括抑制cGAS的方法，药物筛 选包括将包含合酶、ATP、GTP的混合物与抑制剂在条件下相接触，其中所述条件下抑制剂抑 制了经合酶的ATP和GTP到cGAMP和无机焦磷酸的催化转化，并检测所获得的合酶抑制。 在具体的实施方式中，混合物进一步包括DNA且转化是DNA-依赖性的。在其它的实施方式 中，cGAS是组成型活性的。通常，方法是作为筛选分析进行的，其中抑制剂是用于分析的候 选抑制剂，其可以来自文库、先导化合物优化等。混合物可以包含于细胞或细胞提取物中， 或可以是无细胞的。
[0020] 在另一个方面中，本发明提供了体外药物结合测定，这包括抑制cGAS结合到底物 或辅因子的方法，药物结合测定包括将包含合酶和ATP或GTP的底物或DNA辅因子的混合 物与抑制剂在条件下相接触，其中所述条件下抑制剂抑制了合酶到底物或辅因子的结合， 并检测所获得的结合抑制。通常，方法是作为筛选分析进行的，其中抑制剂是用于分析的候 选抑制剂，并且可以以各种合适的方式（包括固相免疫分析、荧光偏振分析等）来实现。
[0021] 在另一个方面中，本发明提供了制备cGAMP的方法，所述方法包括在条件下形成 包含cGAS、ATP和GTP的混合物，其中所述条件下合酶催化转换ATP和GTP到cGAMP，其中 合酶、ATP和GTP是预定义量的，或者方法进一步包括分离或检测所获得的cGAMP的步骤。 在【具体实施方式】中，混合物进一步包括DNA并且转化是DNA-依赖性的。
[0022] cGAS活性的病原性表达，尤其是作为过表达或突变的结果，与人类自身免疫性疾 病相关；因此，本发明还提供了用于检测cGAS水平或突变的方法和分析，尤其是作为用于 人类自身免疫性疾病的诊断工具。因此，在另一个方面中，本发明提供了检测cGAMP水平、 cGAS水平或cGAS突变的方法，所述方法包括以下步骤：检测来自人的样品中的cGAMP水 平、cGAS水平或cGAS突变，并基于cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突变将所述的人分配一个 自身免疫性疾病的度量；和任选地向所述的人施用用于自身免疫性疾病的治疗方法。
[0023] 在另一个方面中，本发明提供了包含预定量的cGAMP的组合物，如进一步包含针 对靶病原体的免疫原的疫苗，其中cGAMP提供了佐剂。在【具体实施方式】中，组合物基本上或 实质上不含其它的环二核苷酸。本发明还提供了诱导或促进免疫应答的方法，所述方法包 括向有需求的哺乳动物施用有效量的此类组合物。在【具体实施方式】中，给药是粘膜（舌下 或鼻内）、肌内或皮下给药。
[0024] 作为I型干扰素的强诱导物，cGAMP提供了合理的免疫佐剂。cGAMP可以用作疫苗 佐剂，尤其是粘膜疫苗，并且可以与免疫原配制并形成环-二-GMP和c-二-AMP作为疫苗佐 剂进行递送；参见，例如 Pedersen 等人，PLoS ONE, Nov 2011,6, 11，e26973;Ebensen 等人， Vaccine 29, 2011，5210-5220 ;Chen 等人，Vaccine 28, 2010, 3080-3085。实际上，cGAMP 佐 剂往往更有效，这是因为cGAMP比c-二-GMP在诱导干扰素方面更有效。
[0025] 应当理解的是，本文所描述的实施例和实施方式仅用于说明的目的，并且考虑到 其各种修改或改变都对本领域技术人员有暗示作用，它们均包括于本申请的精神和范围以 及所附权利要求的范围内。所有本文引用的出版物、专利和专利申请（包括其中引用的） 通过引用以其整体出于所有目的并入本文。
[0026] 实施例
[0027] 实施例1.环-GMP-AMP在经胞质DNA的天然免疫信号中是内源性第二信使
[0028] 对抗外源遗传因素的宿主防御是活有机体的最基本的功能之一。真核细胞感知细 胞质中存在自身或外源DNA，作为异物侵入的危险信号或标志（1)。DNA可以经细菌或病毒 感染、转染或在导致自身免疫性疾病如狼疮的某些病理条件下从核或线粒体中"泄漏"而被 引入到细胞质内。在哺乳动物细胞中，胞质DNA触发I型干扰素（IFN)和通过内质网蛋白 STING(也称为MITA、MPYS或ERIS)的其它细胞因子的产生（2)。STING招募并激活胞质激 酶IKK和TBK1，其分别激活转录因子NF-kB和IRF3。然后NF-kB和IRF3进入细胞核并 一起发挥作用以诱导IFN和其它细胞因子。DNA依赖性RNA聚合酶III已被证明是一种传 感器，其检测和转录富含AT的DNA如聚[dA :dT]到能够刺激RIG-I途径的RNA配体以诱导 IFN(3,4)。然而，大多数DNA序列不激活RNA聚合酶III-RIG-I途径。相反的，胞质DNA以 序列独立性方式激活STING-依赖性途径。胞质DNA如何激活STING途径仍然难以理解。
[0029] 本发明人假设DNA结合并激活假定的胞质DNA传感器，其然后直接或间接地激活 STING，导致IRF3和NF-kB的激活。为了测试这一模型，本发明人使用鼠纤维肉瘤细胞系 L929(已知其以STING依赖性方式诱导干扰素(IFNP) (5))开发了体外互补分析。本发 明人使用稳定表达抗STING的短发夹（sh)RNA的L929细胞系，使得DNA转染仅激活STING 的上游因子（包括假定的DNA传感器）。用不同类型的DNA转染L929-shSTING细胞，然后 将这些细胞的细胞质提取物与人单核细胞系THP1或鼠巨噬细胞系Raw264. 7相混合，将其 用产气荚膜梭菌素〇(perfringolysin 0)(PF0)透化。PF0处理在质膜上打孔（6)，允许细 胞质扩散进出细胞，同时在细胞内保留了包括内质网（其包含STING)和高尔基体的细胞器 (7)。如果在DNA转染的细胞中产生了 STING的上游激活物，则预期包含这种激活子的细胞 质在PF0-透化的细胞中激活STING，导致IRF3的磷酸化和二聚化。
[0030] 转染有已知为干扰素刺激性DNA(ISD)、聚[dA :dT]、富含GC的50个碱基对的 dsDNA(G:C50)、聚[dl :dC]或鲱鱼睾丸DNA(HT-DNA)的 DNA序列的 L929-shSTING 细胞的细 胞质提取物在透化的THP1细胞中激活IRF3,这表明此活性独立于DNA序列。
[0031] 为了确定STING激活物是否是一种蛋白质，本发明人在95°C孵育细胞质提取物以 变性大多数蛋白质，然后将"热的上清液"与透化的THP1细胞孵育。意外的是，来自于ISD 或HT DNA转染的细胞的热的上清液引起了 IRF3的二聚化。此活性抵抗Benzonase (其降 解DNA和RNA)或蛋白酶K的处理。因此，STING激活物可能不是蛋白质、DNA或RNA。
[0032] 为了测试DNA是否可以在体外刺激耐热的STING激活物的产生，本发明人将HT DNA与L929-shSTING细胞质提取物（S100)在存在ATP的情况下孵育。将反应混合物加热 至95°C使蛋白质变性。引人注目的是，上清液与透化的Raw264. 7细胞的孵育导致了 IRF3 的二聚化。这一活性依赖于添加DNA到细胞质提取物中。其它的DNA(包括聚[dA:dT]、聚 [dG :dC]和ISD)也在L929-shSTING细胞质提取物中刺激了 STING的产生，而聚[I :C]和 单链RNA没有活性。用透化的THP1细胞获得了类似的结果。在透化的THP1细胞中敲降 STING去除了经转染到L929细胞的DNA或添加到L929细胞质提取物的DNA所产生的耐热 因子的IRF3的激活。对照实验表明，STING的敲降抑制了 IRF3的激活以及在HT-DNA转染 的THP1细胞中的IFNP和TNFa的诱导，但经聚[I :C]转染或仙台病毒感染（已知其激活 RIG-I途径）的IRF3的激活不受STING敲降的影响。本发明人还测试了数种细胞系的细胞 质提取物产生耐热STING激活物的能力。将HT-DNA与来自原代MEF细胞、小鼠骨髓衍生的 巨噬细胞（BMDM)和L929细胞的提取物孵育，导致产生了激活IRF3的耐热因子。来自THP1 而不是HEK293T细胞的人类细胞提取物也能够产生这种STING激活物。这些结果与本发明 人先前所发现的原代MEF、BMDM、L929和THP1细胞（而不是HEK293T细胞）具有STING依 赖性、RNA聚合酶III非依赖性通路以诱导I型干扰素⑶相一致。
[0033] 之后，本发明人使用多个层析步骤（包括STING-标签亲和纯化步骤）从L929 细胞提取物中纯化耐热的STING激活物。先前的研究已经表明，细菌分子环-二-AMP 和环-二-GMP结合到STING并诱导I型干扰素（8,9)。然而，使用微型（nano)液相色 谱质谱（微型-LC-MS)，本发明人没有检测到与所预期的c-二-GMP([M+H] + = 691)或 c-二-AMP([M+H] + = 659)相一致的MS或MS/MS谱。有趣的是，MS谱的深入研究揭示了具 有675. 1 (z = 1+)和338. 1 (z = 2+)的质荷比（m/z)的两个离子，其存在于活性部分但不 存在于背景谱中。这些m/z值（尽管质谱仪（LTQ)的低质量精度）相当于c-二-GMP和 c-二-AMP的计算的平均m/z值（675 = [691+659]/2)。这一观察表明，所检测的离子是 c-二-GMP 和 c-二-AMP 的杂合体，即环-GMP-AMP (m/z = 675. 107, z = l+;m/z = 338. 057， z = 2+)。这种离子的碰撞诱导解离（CID)碎片（m/z = 338. 1，z = 2+)揭示了数个占优势 的具有所预期的产物离子c-GMP-AMP (cGAMP)的m/z值的离子。重要的是，使用选择性反应 监测（SRM)的定量质谱表明，来自C18柱的级分中代表cGAMP的离子丰度与其IRF3刺激活 性很好地相关联。最近已在细菌弧菌（Vibro cholera)中鉴定了 cGAMP并显示出在细菌趋 化性和定植中发挥作用（10)。然而，尚未报道cGAMP在真核细胞中存在或具有功能。
[0034] 为了验证耐热STING激活物的身份，本发明人使用了高分辨率高精度质谱仪（Q Exactive，Thermo)来进行微型-LC-MS分析。细胞衍生的STING激活物具有675. 107 (z = 1+)和338. 057 (z = 2+)的m/z，其精确匹配cGAMP的理论值。为了进一步表征cGAMP的结 构和功能，本发明人开发了十步的单烧瓶方案以化学合成cGAMP。细胞衍生的STING激活物 的MS/MS谱与化学合成的cGAMP的谱相同。这些结果证实L929细胞产生cGAMP。
[0035] 定量RT-PCR和ELISA分析表明，化学合成的cGAMP在引入到细胞后在L929细 胞中诱导IFNPRNA和蛋白质。滴定实验表明，即使浓度低至10nM，cGAMP也强烈地诱导 IFN0 RNA。实际上，基于ELISA分析，cGAMP在i秀导IFN0方面比c_二一GMP更强。cGAMP 还在激活IRF3方面比c-二-GMP和c-二-AMP更强。为了确定L929提取物是否包含可以 合成其它类型的能激活IRF3的二-核苷酸或寡核苷酸的酶，本发明人以不同组合测试了所 有四种核糖核苷酸。ATP和GTP都是支持IRF3的激活物的合成所必要且充分的，这进一步 支持了L929包含从ATP和GTP合成cGAMP的酶。
[0036] 为了确定DNA病毒感染是否导致细胞中cGAMP的产生，本发明人用缺少ICP 34. 5 (已知在受感染的细胞中拮抗干扰素产生的病毒蛋白（11))的HSV-1感染L929细胞。 如DNA转染一样，HSV-1 A ICP34. 5感染导致L929细胞中IRF3的激活。来自转染DNA或感 染病毒的细胞的细胞提取物包含可以在透化的Raw264. 7细胞中激活IRF3的耐热因子。作 为对照，本发明人用水泡性口炎病毒株VSV-A M51-GFP (已知通过RIG-I通路引发强干扰素 产生的RNA病毒（12，13))感染L929细胞。与HSV-1相比，VSV感染的细胞在相同的体外 分析中不包含耐热IRF3激活物，尽管VSV感染确实在L929细胞中诱导IRF3的激活。通过 反相HPLC富集并使用SRM通过微型-LC-MS定量HSV-1感染细胞中的耐热因子。DNA转染 的或HSV-1感染的细胞（而不是模拟处理的或VSV感染的细胞）产生了升高水平的cGAMP。 动力学实验表明，DNA转染到L929细胞后，在IRF3二聚化之前产生cGAMP且可以检测到 IFNP诱导。为了测试DNA病毒是否可以在人细胞中诱导cGAMP产生，本发明人用HSV1或 牛痘病毒（VACV)感染THP1细胞。两种病毒都在细胞中诱导了 IRF3的二聚化。重要的是， 这两种病毒也都引发了激活IRF3的cGAMP的产生。总之，这些结果表明，在人和小鼠细胞 中的DNA转染和DNA病毒感染产生了 cGAMP，其导致IRF3激活。
[0037] 为了确定cGAMP是否通过STING激活IRF3,本发明人进行了三组实验。首先，本 发明人建立了稳定表达STING的HEK293T细胞系，用cGAMP刺激这些细胞，然后通过定量 RT-PCR测量IFN0的诱导。HEK293T细胞不响应cGAMP，这可能是由于在这些细胞中缺乏 STING表达或STING表达水平非常低。HEK293T细胞中STING的表达使得产生经cGAMP的 高水平的IFN0的诱导。然而，DNA未刺激HEK293T/STING细胞以诱导IFN0，这与HEK293T 细胞缺少产生对DNA刺激的响应的cGAMP相一致。相比之下，L929细胞诱导响应经cGAMP 或DNA的刺激的IFN0。HSV-1感染在L929中诱导IRF3二聚化，而HEK293T或HEK29T/ STING细胞则没有，这表明cGAMP的产生对HSV-1在细胞中激活IRF3是重要的。实际上，来 自