流感病毒重配的制作方法
【专利说明】流感病毒重配
[0001]本申请部分是在生物医学高级研究和开发机构(BARDA)授予的基金号HHS01002010006IC的政府支持下完成。政府对本发明享有某些权利。
技术领域
[0002]本发明属于甲型流感病毒重配领域。此外，其涉及制造用于保护抵御甲型流感病毒的疫苗。
【背景技术】
[0003]针对流感感染的最有效保护是抗流行株的疫苗接种，且尽快生成用于疫苗生产的流感病毒是重要的。
[0004]野生型流感病毒通常在鸡蛋和细胞培养物内生长达到低效价。为了获得生长更好的毒株用于疫苗生产，目前常见的做法是用快速生长的高产供体毒株重配流行疫苗株。这可以通过以下方法完成:用所述流行流感毒株(所述疫苗毒株)和所述高产供体毒株共同感染培养宿主，并选择含有来自所述疫苗毒株的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)区段和来自所述供体毒株的其它病毒区段(即，编码PBU PB2、PA、NP、M1' M2、NS1^P NS 2的那些)的重配病毒。另一个方法是通过反向遗传重配流感病毒(参见，例如参考文献I和2)。
[0005]参考文献3报道，含有来自A/Texas/1/77的PBl基因区段、来自A/NewCaledonia/20/99的HA和NA区段、源自A/Puerto Rico/8/34的经修饰PA区段和来自A/Puerto Rico/8/34的其余病毒区段的重配流感病毒显示增加的细胞中生长。
[0006]目前，就重配流感病毒而言仅有有限数量的供体毒株用于疫苗生产，而最常用的毒株是A/Puerto Rico/8/34 (A/PR/8/34)毒株。然而，包含A/PR/8/34主链区段的重配流感病毒常常不能充分良好生长以确保有效疫苗生产。因此，本领域需要提供进一步和改善的供体毒株用于流感病毒重配。
【具体实施方式】
[0007]发明人目前惊奇地发现，与包含来自相同供体毒株的全部主链区段的重配甲型流感病毒相比，包含来自两种或多种流感供体毒株的主链区段的流感病毒能在培养宿主(特别是细胞培养物)内更快生长。具体而言，发明人已发现，包含源自两种不同高产供体毒株的主链区段的流感病毒能用靶标疫苗相关HA/NA基因产出重配株的得率高于单独使用两种原始供体毒株中任一种所得重配株。
[0008]具有来自两种或多种流感供体毒株的主链区段的重配甲型流感病毒可包含来自不同甲型流感病毒的HA区段和PBl区段。在这些重配流感病毒中，PBl区段优选来自与疫苗毒株具有相同流感病毒HA亚型的供体病毒。例如，PBl区段和HA区段可以都来自具有Hl亚型的流感病毒。重配甲型流感病毒还可包含来自具有不同流感病毒HA亚型的不同甲型流感病毒株的HA区段和PBl区段，其中PBl区段不是来自具有H3HA亚型的流感病毒和/或HA区段不是来自具有Hl或H5HA亚型的流感病毒。例如，PBl区段可来自Hl病毒和/或HA区段可来自H3流感病毒。
[0009]本发明还提供了主链片段来自两种或多种流感供体毒株的重配甲型流感病毒，其中PBl区段来自A/California/07/09流感毒株。该区段可与SEQ ID N0:22的序列具有至少95%相同性或100%相同性。重配甲型流感病毒可具有HlHA亚型。应理解，本发明该方面所述的重配流感病毒将不包含来自A/California/07/09的HA和/或NA区段。
[0010]当所述重配甲型流感病毒包含来自两种或三种供体毒株的主链区段时，各供体毒株可提供多于一种的所述重配甲型流感病毒主链区段，但所述供体毒株中的一或两种也可仅提供单一主链区段。
[0011]当所述重配甲型流感病毒包含来自二、三、四或五种供体毒株的主链区段时，这些供体毒株中的一种或两种可提供多于一种的所述重配甲型流感病毒主链区段。通常，重配甲型流感病毒不可包含超过六种主链区段。因此，例如，若这些供体毒株之一提供五种病毒区段，则该重配甲型流感病毒仅能包含来自总共两种不同供体毒株的主链区段。
[0012]当重配甲型流感病毒包含来自A/Texas/1/77的PBl区段时，其优选不包含来自A/Puerto Rico/8/34的PA、NP或M区段。当重配甲型流感病毒包含来自A/Puerto Rico/8/34的PA、NP或M区段时，其优选不包含来自A/Texas/1/77的PBl区段。在一些实施方式中，本发明不涵盖具有来自A/Texas/1/77的PBl区段和来自A/Puerto Rico/8/34的PA、NP和M区段的重配甲型流感病毒。来自A/Texas/1/77的PBl区段可具有SEQ ID NO:27的序列且来自A/Puerto Rico/8/34的PA、NP或M区段可分别具有SEQ ID NO 28、29或30的序列。
[0013]与包含来自相同流感供体毒株的所有主链区段的重配流感毒株相比，本发明的甲型流感病毒可在相同时间内并在相同生长条件下在MDCK细胞和/或鸡蛋中生长至较高的病毒效价。
[0014]本发明还提供了一种重配甲型流感病毒，其包含来自供体毒株的至少一种主链病毒区段，该供体毒株是A/California/07/09流感毒株。当所述至少一种主链病毒区段是PA区段时，其序列可与SEQ ID NO: 15的序列具有至少95%或至少99%相同性。当所述至少一种主链病毒区段是PBl区段时，其序列可与SEQ ID NO: 16的序列具有至少95%或至少99%相同性。当所述至少一种主链病毒区段是PB2区段时，其序列可与SEQ ID N0:17的序列具有至少95%或至少99%相同性。当所述至少一种主链病毒区段是NP区段时，其序列可与SEQ ID NO: 18的序列具有至少95%或至少99%相同性。当所述至少一种主链病毒区段是M区段时，其序列可与SEQ ID NO: 19的序列具有至少95%或至少99%相同性。当所述至少一种主链病毒区段是NS区段时，其序列可与SEQ ID N0:20的序列具有至少95%或至少99%相同性。
[0015]至少一种主链区段可来源于A/California/07/09流感毒株，如先前段落中所述。优选的重配甲型流感病毒包含来自A/California/07/09流感毒株的PBl区段。发明人已表明，包含该主链区段的重配甲型流感病毒在培养宿主中生长良好。重配甲型流感病毒可包含来自不是A/California/07/09的流感病毒的所有其他主链区段。
[0016]重配甲型流感病毒可包含来自A/California/07/09的PBl区段和来自流感毒株PR8-X 的所有其他主链区段。PR8-X 的区段具有 SEQ ID NO:1 (PA), SEQ ID NO: 2 (PBl) ,SEQID N0:3(PB2)、SEQ ID NO:4(NP)^SEQ ID NO:5(M)^SEQ ID NO:6(NS)^SEQ ID NO:7(HA)或SEQ ID N0:8(NA)的序列。因此，本发明的流感病毒可包含选自下组的一种或多种基因组区段:与SEQ ID NO:1的序列具有至少95%或99%相同性的PA区段、与SEQ ID NO: 3的序列具有至少95%或99%相同性的PB2区段、与SEQ ID NO:5的序列具有至少95%或99%相同性的M区段、与SEQ ID N0:4的序列具有至少95%或99%相同性的NP区段，和/SSEQID NO:6的序列具有至少95%或99%相同性的NS区段。该重配甲型流感病毒还可包含具有SEQ ID N0:1和/或3-6的序列的一种或多种病毒区段。在优选的实施方式中，重配流感毒株包含本段落中提及的所有基因组区段。该实施方式是优选的，因为发明人发现这种重配甲型流感病毒在细胞培养物和含胚鸡蛋中生长地特别好。
[0017]通常，重配流感病毒会每种主链区段各仅包含一个。例如，当流感病毒包含来自A/California/07/09的PBl区段时，其不会同时包含来自另一甲型流感供体毒株的PBl区段。
[0018]所述主链病毒区段可就特定培养宿主中的培养进行优化。例如，当重配流感病毒在哺乳细胞中培养时，使至少一种病毒区段适应培养宿主中的最佳生长是有利的。例如，当表达宿主是犬细胞(如MDCK细胞系)时，该病毒区段可具有优化细胞中病毒生长的序列。因此，本发明的重配流感病毒可包含PB2基因组区段，该区段在使用成对比对算法与SEQ IDNO:3比对时在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸389的位置处具有赖氨酸，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO: 3比对时在对应于SEQ ID NO: 3的氨基酸559的位置处具有天冬酰胺。根据本发明，还提供了重配流感病毒，其中PA基因组区段在使用成对比对算法与SEQID NO:1比对时在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸327的位置处具有赖氨酸，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO:1比对时在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸444的位置处具有天冬氨酸，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO:1比对时在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸675的位置处具有天冬氨酸。本发明的重配流感病毒还可具有NP基因组区段，该区段在使用成对比对算法与SEQ ID NO:4比对时在对应于SEQ ID NO:4的氨基酸27的位置处具有苏氨酸，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO:4比对时在对应于SEQ ID NO:4的氨基酸375的位置处具有天冬酰胺。变体流感毒株还可包含两个或多个这些突变。优选地，变体流感病毒含有同时具有前述两种氨基酸变化的变体PB2区段，和/或含有前述全部三种氨基酸变化的PA，和/或含有前述全部两种氨基酸变化的NP区段。该甲型流感病毒可能是Hl毒株。
[0019]替代或补充地，该重配流感病毒可包含PBl区段，其在使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸200的位置处具有异亮氨酸，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO: 2比对时在对应于SEQ ID NO: 2的氨基酸338的位置处具有天冬酰胺，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO:2比对时在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸529的位置处具有异亮氨酸，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO:2比对时在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸591的位置处具有异亮氨酸，和/或在使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸687的位置处具有组氨酸，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO: 2比对时在对应于SEQ ID NO: 2的氨基酸754的位置处具有赖氨酸。
[0020]优选的成对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[4]，使用默认参数(如缺口开放罚分=10.0，缺口延伸罚分=0.5，使用EBL0SUM62积分矩阵)。用EMBOSS软件包中的needle工具能方便地实施这种算法[5]。
[0021]本发明提供一种制备本发明重配甲型流感病毒的方法。这些方法包括以下步骤:(i)将一种或多种表达构建体引入培养宿主，所述表达构建体编码产生甲型流感病毒所需的病毒区段，其中，主链病毒片段来自两种或多种流感毒株；以及(ii)培养所述培养宿主以产生重配病毒，和可选地(iii)纯化步骤(ii)中获得的病毒。在这些方法中，HA和PBl区段可来自具有相同流感HA亚型的不同流感毒株，或者HA和PBl区段可来自具有不同HA亚型的不同流感毒株，前提是PBl区段不是来自具有H3HA亚型的流感病毒和/或HA区段不是来自具有Hl或H5HA亚型的流感病毒。PBl主链病毒区段可以来自A/California/07/09。一种或多种表达构建体还可编码一种或多种来自PR8-X的PB2、PA、NP、M或NS区段或者与SEQ ID N0:9和/或11-14具有至少90%或100%相同性的区段。当PBl区段来自A/California/07/09时，表达构建体可不编码来自A/California/07/09的HA和/或NA区段。
[0022]至少一种表达构建体可包含与SEQ ID NO: 22的序列具有至少90%、至少95%、至少99%或100%相同性的序列。
[0023]在一些实施方式中，所述至少一种表达构建体不编码来自A/Texas/1/77流感毒株的PBl区段。
[0024]这些方法还包括以下步骤:(iv)用步骤(ii)或步骤(iii)中获得的病毒感染培养宿主；(V)培养来自步骤(iv)的培养宿主以生成进一步的病毒；和可选地(vi)纯化步骤(V)中获得的病毒。
[0025]本发明还提供一种用于产生流感病毒的方法，所述方法包括以下步骤:(a)用本发明的重配病毒感染培养宿主；(b)培养来自步骤(a)的宿主以产生所述病毒；和可选地(C)纯化步骤(b)中获得的病毒。
[0026]本发明还提供一种制备疫苗的方法，所述方法包括以下步骤:⑷通过上述实施方式中任何一种的方法制备病毒和(e)从所述病毒制备疫苗。
[0027]本发明提供一种表达系统，所述表达系统包括一种或多种含有编码甲型流感病毒区段的vRNA的表达构建体，其中，所述表达构建体编码来自具有相同流感HA亚型的两种不同流感毒株的HA和PBl区段或编码来自具有不同流感病毒HA亚型的两种不同流感毒株的HA和PBl区段，该PBl区段不是来自具有H3HA亚型的流感病毒和/或该HA区段不是来自具有Hl或H5HA亚型的流感病毒。
[0028]本发明还提供一种表达系统，所述表达系统包括一种或多种含有编码甲型流感病毒区段的vRNA的表达构建体，其中，一个或多个所述表达构建体编码A/California/07/09的PBl区段。所述表达构建体还可包含编码一种或多种来自PR8-X的PB2、NP、NS、M和/或PA区段的vRNA。因此，所述表达构建体可包含一种或多种与SEQ ID N0:9和/或11-14具有至少90%相同性、至少95%相同性、至少99%相同性或100%相同性的核苷酸序列。优选地，所述表达构建体编码来自PR8-X的全部PB2、NP、NS、M和PA区段。
[0029]本发明还提供一种包含本发明表达系统的宿主细胞。这些宿主细胞能由所述表达系统中的表达构建体表达甲型流感病毒。
[0030]还提供可用于本发明表达系统的表达构建体。例如，本发明提供一种表达构建体，所述表达构建体在同一构建体上编码本发明所述的重配流感毒株的主链区段。
[0031]供体毒株
[0032]流感供体毒株是通常提供重配流感病毒中主链区段的毒株，尽管其有时还提供病毒的NA区段。然而，重配流感病毒中的HA和NA区段通常来自疫苗毒株，其是提供HA区段的流感毒株。
[0033]发明人出乎意料地发现，与包含的HA和PBl区段来自具有不同HA亚型的病毒的重配流感病毒相比，包含的HA区段和PBl区段来自具有相同HA亚型的不同甲型流感毒株的重配甲型流感病毒在培养宿主中的生长要快得多。这些重配流感病毒优选具有来自至少两种供体毒株的主链区段。
[0034]与具有不同HA亚型的流感病毒的PBl区段相比，具有相同HA亚型的流感病毒的PBl区段之间通常具有较高水平的相同性。例如，使用Hl毒株A/California/07/09的PBl区段进行的Blast搜索显示仅具有HlHA亚型的流感毒株在PBl区段中具有高度相同性。同样地，使用H3毒株A/Wisconsin/67/2005的PBl区段进行的Blast搜索显示仅具有H3HA亚型的流感毒株对于该病毒的PBl区段具有高度相同性。
[0035]发明人还发现，具有来自至少两种供体毒株的主链区段且包含来自A/California/07/09的PBl区段的重配甲型流感病毒在培养宿主中生长特别好。这些重配流感病毒优选具有来自至少两种不同供体毒株的主链区段。该重配流感病毒可包含来自A/California/07/09的PBl区段和具有Hl亚型的流感病毒的HA区段。
[0036]包含A/California/07/09毒株的1、2、3、4、5、6或7种区段的流感毒株也可用作供体毒株。
[0037]本发明可用所含病毒区段与SEQ ID NO 9_14或21_26的序列具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%相同性的供体毒株来实施。例如，由于遗传密码