BSE)的来源。总之，优选在完全不含动物来源物质的条件下培养细胞。
[0177]将化合物作为组合物的一部分给予机体时，该化合物或可由合适的前药替代。
[0178]两个氨基酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序列中相同氨基酸的百分数。利用本领域所知软件程序，例如参考文献71的7.7.18部分所描述的软件程序，可进行比对并确定同源性百分数或序列相同性百分数。优选的比对通过史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法使用仿射缺口搜索确定，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵计62分。参考文献72中教导了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。
[0179]两个核酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序列中相同碱基的百分数。利用本领域所知软件程序，例如参考文献71的7.7.18部分所描述的软件程序，可进行比对并确定同源性百分数或序列相同性百分数。优选的比对程序是GCG Gap (威斯康星州的遗传计算机组(Genetics Computer Group)，套件版本10.1)，优选使用以下默认参数:开放缺口 = 3 ;延伸缺口 = I。
【附图说明】
[0180]图1比较从使用反向遗传产生的6:2重配株感染的MDCK细胞培养物在感染后60小时收获的蔗糖梯度纯化的病毒的HA含量(由凝集素捕获ELISA测定)，所述重配株含有PR8-X或#21主链以及来自(A)大流行样(Pandemic-1ike)Hl毒株(毒株I)或者(B)第二大流行样毒株(毒株2)的HA和NA区段。在图1A和IB中，白色柱表示作为对照的参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)，斑点柱表示含有PR8-X主链的重配病毒，且格纹柱表示含有#21主链的重配病毒。y轴显示HA产量，单位为μ g/ml。
[0181]图2比较从使用反向遗传产生的6:2重配株感染的MDCK细胞培养物在感染后60小时收获的未纯化病毒的HA含量(由凝集素捕获ELISA测定)，所述重配株含有PR8-X或#21主链以及来自(A)大流行前(pre-pandemic)Hl毒株(毒株I)和(B)第二大流行前毒株(毒株2)的HA和NA区段的。在图2A和2B中，白色柱表不作为对照的参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)，斑点柱表示含有PR8-X主链的重配病毒，且格纹柱表示含有#21主链的重配病毒。y轴显示HA产量，单位为μ g/ml。
[0182]图3比较从使用反向遗传源产生的6:2重配株感染的MDCK细胞培养物在感染后60小时收获的蔗糖纯化的病毒的HA产量(由HPLC测定)，所述重配株含有PR8-X或#21主链以及来自H3毒株(毒株I)的HA和NA区段。白色柱表示作为对照的参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)，斑点柱表示含有PR8-X主链的重配病毒，且格纹柱表示含有#21主链的重配病毒。y轴显示HA产量，单位为μ g/ml。
[0183]图4比较从使用参考疫苗毒株或反向遗传产生的6:2重配病毒感染的含胚鸡蛋在感染后60小时所收获病毒的病毒效价(由病灶形成试验(FFA)测定；图4A)和HA效价(由凝集素捕获ELISA测定；图4B)，所述重配病毒使用PR8-X或#21主链和来自大流行样Hl毒株(毒株2)的HA和NA区段制备。在图4A中，单个点表示来自单个鸡蛋的数据。线表示单个数据点的平均值。y轴表示感染单位/ml。在图4B中，白色柱表示参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)，斑点柱表示含有PR8-X主链的重配病毒，且格纹柱表示含有#21主链的重配病毒。y轴显示汇集的鸡蛋样品的HA产量，单位为yg/ml。
[0184]图5比较从使用参考疫苗毒株或反向遗传产生的6:2重配病毒感染的MDCK细胞在感染后60小时所收获病毒的病毒效价(由FFA测定；图5A)和HA效价(由凝集素捕获ELISA测定；图5B)，所述重配病毒使用#21或#21C主链和来自大流行样Hl毒株(毒株2)的HA和NA区段制备。在两个图中，白色柱表示作为对照的参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)，斑点柱表示使用#21主链制备的重配病毒，且格纹柱表示使用修饰的#21主链(#21C)制备的重配病毒，所述修饰的#21主链在构成主链的PR8-X PB2区段中含有两个犬适应性突变(R389K、T559N)。图5A和5B中的y轴分别显示感染单位/ml和HA产量(单位为μ g/ml)。
[0185]图6比较从使用反向遗传产生的6:2重配病毒感染的MDCK细胞在感染后60小时所收获病毒的病毒效价(由FFA测定)，所述重配病毒使用PR8-X、#21或#21C主链和来自不同的大流行样Hl毒株(毒株I)的HA和NA区段制备。白色柱表示PR8-X主链，斑点柱表示#21主链，且格纹柱表示在构成主链的PR8-X PB2区段中含有两个犬适应性突变(R389K、T559N)的#2IC主链。y轴表示感染单位/ml。
[0186]图7比较从使用参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)或反向遗传产生的6:2重配病毒感染的含胚鸡蛋在感染后60小时所收获病毒的HA效价(由血红细胞血凝试验测定)，所述重配病毒含有PR8-X或#21C主链和来自大流行样Hl毒株(毒株I)的HA和NA区段。单个点代表来自单个鸡蛋的数据。线表示单个数据点的平均值。y轴表示HA单位。
[0187]图8比较从使用反向遗传产生的6:2重配株感染的MDCK细胞在感染后不同时间点所收获病毒的感染效价(由FFA测定)，所述重配株使用PR8-X主链或含有犬适应性聚合酶突变的修饰的PR8-X主链和来自大流行样Hl毒株(毒株I)的HA和NA区段制备。在图8A中，带有三角形标记的虚线表示PR8-X主链且带有方形标记的实线表示在PR8-X PA区段中含有三个犬适应性突变(E327K、N444D和N675D)的经修饰PR8-X主链“PR8-X (cPA) ”。在图8B中，带有三角形标记的虚线表示PR8-X主链且带有空心圆形标记的实线表示在PR8-XNP区段中含有两个犬适应性突变(A27T、E375N)的经修饰PR8-X主链“PR8-X (cNP) ”。在两个图中，X轴都表示感染后小时数且Y轴都表示感染单位/ml。
[0188]图9比较从使用参考疫苗毒株或反向遗传产生的6:2重配病毒感染的MDCK细胞在感染后不同时间点所收获病毒的感染效价(由FFA测定；图9A)和HA效价(由血红细胞血凝试验测定；图9B)，所述重配病毒使用PR8-X主链或含有犬适应性突变的修饰的PR8-X主链和来自H3毒株(毒株2)的HA和NA区段制备。在图9A中，带有X标记的虚线表示参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)，带有三角形标记的虚线表示PR8-X主链，带有方形标记的实线表示在PR8-X PA区段中含有三个犬适应性突变(E327K、N444D和N675D)的经修饰PR8-X主链“PR8-X(cPA) ”，且带有空心圆形标记的实线表示在PR8-X NP区段中含有两个犬适应性突变(A27T、E375N)的经修饰PR8-X主链“PR8-X (cNP) ”。y轴表示感染单位/ml且X轴表示感染后小时数。在图9B中，白色柱表示作为对照的参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)，斑点柱表示PR8-X(cPA)主链，且格纹柱表示PR8-X (cNP)主链。I轴表示来自感染后60小时时间点的HA单位。
[0189]图10比较从使用反向遗传产生的6:2重配株感染的MDCK细胞培养物在感染后60小时收获的蔗糖梯度纯化的病毒的HA含量(由凝集素捕获ELISA测定)，所述重配株含有具有PR8-X或#21主链和来自㈧H3 (毒株2)或者⑶第二 H3毒株(毒株3)或者(C)第三H3毒株(毒株4)的HA和NA区段。在图1OA和1B中，白色柱表示作为对照的参考疫苗毒株(来源于WHO合作中心供应的毒株)，斑点柱表示含有PR8-X主链的重配病毒，且格纹柱表示含有#21主链的重配病毒。y轴显示HA产量，单位为μ g/ml。
【具体实施方式】
[0190]
[0191]新供体毒株的开发
[0192]为提供高生长供体毒株，发明人发现，与含有来自PR8-X的所有主链区段的重配流感病毒相比，包含A/California/07/09的PBl区段和来自PR8-X的所有其他主链区段的重配流感病毒显示改进的生长特征。该流感主链称作#21。
[0193]病灶形成试验(FFA)
[0194]对于FFA实验，将未感染的MDCK细胞以1.8X 14细胞/孔的密度加入96孔板的10yL DMEM(含10% FCS)中。第二天，吸出培养基，然后用50 μ L体积中的病毒(病毒稀释在DMEM+1% FCS中)感染细胞。将细胞在37°C孵育到下一天。
[0195]在感染后若干时间点，吸出培养基并用PBS清洗细胞一次。向每孔加入50 μ I冰冷的50% /50%丙酮-甲醇然后在-20°C孵育30分钟。吸出丙酮混合物并用PBST(PBS+0.1%吐温)清洗细胞一次。每孔加入50 μ I溶于PBS的2% BSA然后室温(RT)孵育30分钟。将50 μ I 1:6000稀释的抗NP加入封闭缓冲液然后室温孵育I小时。吸弃抗体溶液并用PBST清洗细胞三次。二抗(山羊抗小鼠)以1:2000稀释度在50 μ I封闭缓冲液中添加，并将板室温下孵育I小时。吸出抗体溶液并用PBST清洗细胞三次。每孔加入50 μ I KPLTrue Blue并孵育10分钟。通过吸弃True-Blue停止反应并用dH20清洗一次。吸弃水并晾干细胞。
[0196]包含PR8-X或#21主链的重配病毒的生长特性
[0197]为了测试#21毒株作为供体毒株用于病毒重配的合适性，通过反向遗传学生产含有来自多种流感毒株(包括动物传染病性、季节性和大流行样毒株)的HA和NA蛋白和来自PR8-X或#21主链的其它病毒区段的重配流感病毒。测定这些重配病毒的HA含量、HA产量和病毒效价。作为对照，使用了不含有任何来自PR8-X或A/California/07/09的主链区段的参考疫苗毒株。在含胚鸡蛋或MDCK细胞轴培养这些病毒。
[0198]结果显示，在鸡蛋和细胞培养物中，与对照病毒和含有所有来自PR8-X的主链区段的病毒相比，含有#21主链的重配病毒稳定地生成更高的病毒效价和HA产量。该差异是由于PBl区段，因为这是#21重配株和PR8-X重配株之间仅有的差别(参见图1-4)。
[0199]包含PR8-X或犬适应性PR8-X主链的重配病毒的生长特性
[0200]为测试犬适应性突变对于PR8-X生长特性的影响，发明人将突变导入PR8-X的PA区段(E327K、N444D 和 N675D)或 NP 区段(A27T、E375N)。这些主链分别称作 PR8-X(cPA)和PR8-X (cNP)。生产重配流感病毒，其含有PR8-X (cPA)和PR8-X (cNP)主链与大流行样Hl流感毒株(毒株I)或H3流感毒株(毒株2)的HA和NA区段。作为对照，使用了不含有任何来自PR8-X的主链区段的参考疫苗毒株。在MDCK细胞中培养重配流感病毒。
[0201]结果显示，与含有未修饰的PR8-X主链区段的重配流感病毒相比，含有犬适应性主链区段的重配流感病毒稳定地生成更高的病毒效价(参见图8和9)。
[0202]含有PR8-X、#21或#21C主链的重配病毒的生长特性
[0203]为测试主链区段中犬适应性突变是否能改进#21主链的生长特性，发明人通过将突变导入PR8-X PB2区段(R389K、T559N)来修饰#21主链。该主链称作#21C。通过反向遗传学生产重配流感病毒，其含有来自两种不同大流行样Hl流感毒株(毒株I和2)的HA和NA蛋白以及来自PR8-X、#21主链或#21C主链的其他病毒区段。作为对照，使用了不含有任何来自PR8-X或A/California/07/09的主链区段的参考疫苗毒株。在MDCK细胞中培养这些病毒。测定这些重配病毒的病毒产量。对于含有来自大流行样Hl毒株(毒株I)的HA和NA区段和PR8-X或#2IC主链的重配流感病毒，还测定了 HA效价。
[0204]结果显示，与仅含有PR8-X主链区段或#21主链的重配流感病毒相比，含有#21C主链的重配流感病毒稳定地生成更高的病毒效价(参见图5、6和7)。与PR8-X重配株相比，包含#21C主链的重配流感病毒还显示更高的HA效价。
[0205]应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和构思内。
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