CCPTA-6502)和’ MDCK-SF103’ (PTA-6503)。参考文献26公开了对感染有高度易感性的MDCK细胞，包括 ‘MDCK.5F1，细胞(ATCC CRL 12042)。
[0081]可使用多于一种细胞类型的混合物来实施本发明的方法。但本发明的方法优选用单一细胞类型如用单克隆细胞实施。本发明方法所用细胞优选来自单一细胞系。此外，同一细胞系可用于重配所述病毒和所述病毒的任何后续繁殖。
[0082]所述细胞优选在无血清情况下培养以避免常见污染源。本领域技术人员已知用于真核细胞培养的各种无血清培养基(如伊可夫氏(Iscove’ s)培养基、超CHO培养基(BW公司(B1Whittaker))、EX-CELL (JRH 生物科学公司(JRH B1sciences)))。此外，可用无蛋白培养基(如PF-CHO(JRH生物科学公司))。另外，用于复制的细胞也可在常规含血清培养基(如含0.5% -10%胎牛血清的MEM或DMEM培养基)中培养。
[0083]所述细胞可贴壁培养或悬浮培养。
[0084]常规重配
[0085]传统上，通过用供体毒株和疫苗毒株共同感染培养宿主(通常是鸡蛋)来重配流感病毒。通过添加对所述供体毒株HA和/或NA蛋白特异的抗体来选择重配病毒，从而选择包含所述疫苗毒株的HA和/或NA蛋白的重配病毒。经过该处理的数次传代，可以选择包含所述疫苗毒株HA和/或NA区段的快速生长重配病毒。
[0086]本发明适于这些方法中的应用。相较于供体毒株，具有不同HA和/或NA亚型的疫苗毒株更易使用，因为这有利于重配病毒的选择。然而，也可能使用具有相同HA和/或NA亚型的疫苗毒株作为供体毒株，而这在本发明的一些方面中优选。在这种情况下，对所述供体毒株的HA和/或NA蛋白具有优先特异性的抗体应该是可获得的。
[0087]病毒制备
[0088]在一个实施方式中，本发明提供一种生产流感病毒的方法，所述方法包括以下步骤:(a)用本发明的重配病毒感染培养宿主；(b)培养来自步骤(a)的宿主以生产所述病毒；和可选地(C)纯化步骤(b)中生产的病毒。
[0089]所述培养宿主可以是细胞或含胚鸡蛋。本发明此方面中用细胞作培养宿主时，已知细胞培养条件(如温度、细胞密度、PH值等)根据所用细胞系和病毒在较宽的范围内变化且可根据应用需求调整。因此下述信息仅代表指南。
[0090]如上所述，细胞优选在无血清或无蛋白的培养基中培养。
[0091]所述细胞的繁殖可按照本领域技术人员已知的方法进行。例如，所述细胞可在使用常规支持方法如离心或过滤的灌注系统中培养。而且，所述细胞可按照本发明于感染前在分批进料系统中繁殖。在本发明的内容中，培养系统指分批进料系统，其中所述细胞初始培养于分批系统中且通过浓缩营养物的受控进料来补偿培养基中营养物(或部分营养物)的消耗。在感染前的细胞繁殖期间将培养基的pH值调节为pH 6.6-pH 7.8，特别是pH7.2-pH 7.3是有利的。细胞培养优选在30-40°C的温度进行。在培养受感染细胞(步骤b)时，所述细胞优选在30°C-36°C或32°C _ 34°C或33°C的温度下培养。这是特别优选的，因为已显示在该温度范围内孵育受感染细胞能生产配入疫苗时功效改善的病毒[27]。
[0092]感染前培养中的氧分压优选调节为25% -95%且特别为35% -60%的值。本
【发明内容】
中的氧分压值基于空气饱和度。在分批系统中细胞浓度优选约8-25xl05细胞/mL时或在灌注系统中优选约5-20xl06细胞/mL时进行细胞感染。所述细胞可用10 8至10，优选0.0001-0.5的病毒剂量(Μ0Ι值，“感染复数”，相当于感染时每细胞的病毒单位数量)感染。
[0093]可以在贴壁或悬浮培养的细胞中培养病毒。可采用微载体培养。在一些实施方式中，细胞可由此适合悬浮培养。
[0094]本发明所述方法还包括收获和分离病毒或其产生的蛋白。分离病毒或蛋白期间，通过标准方法如分离、过滤或超滤从所述培养基中分离所述细胞。之后按照本领域技术人员充分知晓的方法如梯度离心、过滤、沉淀、色谱等浓缩所述病毒或所述蛋白，然后纯化。根据本发明，还优选在纯化期间或之后进行病毒灭活。可在所述纯化过程中任何点通过例如β-丙内酯或甲醛进行病毒灭活。
[0095]所述培养宿主可以是鸡蛋。目前培养流感病毒用于疫苗的标准方法采用含胚SPF鸡蛋，从鸡蛋内容物(尿囊液)纯化病毒。也可通过鸡蛋对病毒进行传代并随后在细胞培养物中繁殖，反之亦然。
[0096]疫苗
[0097]本发明使用根据所述方法生产的病毒来生产疫苗。
[0098]疫苗(特别是流感病毒)通常基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗可基于完整病毒颗粒、‘裂解’病毒颗粒或基于纯化的表面抗原。抗原也可以病毒体形式呈递。本发明可用于制造任意这些类型的疫苗。
[0099]采用灭活病毒时，所述疫苗可包含完整病毒颗粒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原(对于流感，包括血凝素，通常也包括神经氨酸酶)。灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一种或多种试剂处理:去污剂、甲醛、丙内酯、亚甲基蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元乙胺、乙酰基乙烯亚胺或其组合。本领域已知病毒灭活的非化学方法，例如UV射线或γ射线辐射。
[0100]可通过各种方法从含病毒液体(如尿囊液或细胞培养物上清)中收获病毒颗粒。例如，纯化方法可包括用含有去污剂以破坏病毒颗粒的线性蔗糖梯度溶液进行区带离心。抗原可通过渗滤纯化，可选在稀释后。
[0101]用去污剂(如乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、三正丁基磷酸盐、曲通(Triton)X100、曲通N101、溴化十六烷基三甲铵、特吉托NP9等)处理纯化的病毒颗粒以获得裂解病毒颗粒，从而产生亚病毒颗粒制品，包括‘吐温-醚’裂解方法。裂解流感病毒的方法为本领域熟知，例如参见参考文献28-33等。一般使用破坏浓度的裂解剂破坏或片段化完整病毒来裂解所述病毒，无论该病毒有无感染性。这种破坏导致病毒蛋白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子型和离子型(例如阳离子)表面活性剂，如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N，N- 二烷基-葡糖酰胺、6-0- (N-庚甲酰)-甲基-a -D-葡萄糖苷(Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、ΝΡ9、季铵化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、三正丁基磷酸酯、塞弗伦(Cetavlon)、十四烧基三甲钱盐、脂质转染试剂(Lipofectin)、脂质体转染试剂(Iipofectamine)和D0T-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性剂，如曲通XlOO或曲通Ν101)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，并且裂解可在病毒颗粒初始纯化期间进行(例如在蔗糖密度梯度溶液中)。因此，裂解过程可包括:澄清含病毒颗粒的材料(以去除非病毒颗粒物质)，浓缩收获的病毒颗粒(例如使用吸附方法，如CaHPO4吸附)，分离完整病毒颗粒与非病毒颗粒材料，用裂解剂在密度梯度离心步骤中裂解病毒颗粒(例如，用含有裂解剂如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度)，然后过滤(例如超滤)以去除不需要的物质。可将裂解的病毒颗粒重悬于磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。裂解的流感疫苗的示例有BEGRIVAC?、FLUARIX?、FluzonetIp flushield ?产品。
[0102]纯化的流感病毒表面抗原疫苗包含表面抗原血凝素，一般还包含神经氨酸酶。制备这些纯化形式的蛋白质的方法是本领域熟知的。FLUVIRIN?、AGRIPPAL?和INFLUVAC?产品是流感亚基疫苗。
[0103]另一种形式的灭活抗原是病毒体[34](不含核酸的病毒样脂质体颗粒)。其可通过使用去污剂溶解病毒，然后去除核衣壳和重建含病毒糖蛋白的膜来制备。一种用于制备病毒体的替代性方法包括将病毒膜糖蛋白加入过量磷脂中，得到膜中具有病毒蛋白质的脂质体。
[0104]本发明的方法还可用于生产活疫苗。此类疫苗通常通过从含病毒颗粒的液体中纯化病毒颗粒来制备。例如，所述液体可通过离心澄清并用缓冲液(例如含蔗糖、磷酸钾和谷氨酸单钠)稳定。目前可以获得各种形式的流感病毒疫苗(例如参见参考文献35的第17和18章)。活病毒疫苗包括医学免疫公司(MedImmune)的FLUMIST?产品(三价活病毒疫苗)。
[0105]所述病毒可被减毒。所述病毒可为温度敏感型。所述病毒可为冷适应性病毒。使用活病毒作为抗原时这三种特征特别有用。
[0106]HA是现有灭活流感疫苗中的主要免疫原，且参照一般由SRID测定的HA水平来标准化疫苗剂量。现有的疫苗一般含有约15 μ g HA/毒株，但也可使用更低的剂量，例如儿童或大流行情况下，或者是使用佐剂时。分数剂量如1/2 (即7.5 μ g HA/毒株)、1/4和1/8以及较高剂量(如3x或9x剂量[36，37])已有应用。因此，疫苗可包含0.1-150 μ g HA/流感毒株，优选 0.1-50 μ g，例如 0.1-20 μ g、0.1-15 μ g、0.1-10 μ g、0.1-7.5 μ g、0.5-5 μ g等。具体剂量包括例如，每株约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约3.75、约1.9、约1.5等。
[0107]对于活疫苗，利用组织培养感染剂量中值(TCID5q)而非HA含量来衡量剂量，且TCiD5。一般为每株 ?ο6至 ?ο8(优选为 ιο6.5-ιο7.5) ο
[0108]本发明所用的流感株可以具有野生型病毒中的天然HA，或修饰的HA。例如，已知修饰HA以去除使病毒在禽类物种中具有高致病性的决定簇(如HA1/HA2切割位点周围的超碱性区域(hyper-basic reg1n))。采用反向遗传学促进这类修饰。
[0109]除了适于针对大流行间期株系的免疫，本发明组合物特别用于免疫抵御大流行或潜在大流行株系。本发明适用于免疫人以及非人动物。
[0110]其抗原可有用地包含在所述组合物中的其它株系是对抗病毒治疗有抗性(例如对奥塞米韦[38]和/或扎那米韦有抗性)的毒株，包括抗性大流行株系[39]。
[0111]本发明的组合物可包含来自一种或多种(如1、2、3、4或更多)流感病毒株的抗原，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒，前提是至少一种流感病毒是本发明的重配流感病毒。也考虑其中至少两种、至少三种或所有抗原来自本发明重配流感病毒的组合物。疫苗包含一种以上流感毒株时，一般单独培养不同毒株，并在收获病毒和制备抗原后将它们混合在一起。因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原的步骤。三价疫苗是典型的，其包含来自两种甲型流感病毒株和一种乙型流感病毒株的抗原。也可用四价疫苗
[40]，其包含来自2种甲型流感病毒毒株和2种乙型流感病毒毒株、或者3种甲型流感病毒毒株和一种乙型流感病毒毒株的抗原。
[0112]药物组合物
[0113]如本发明所述制备的疫苗组合物是药学上可接受的。它们通常还包含抗原外的其它组分，例如它们一般包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。如下所述，也可包含佐剂。对这类组分的充分讨论参见参考文献41。
[0114]疫苗组合物通常是水性形式。然而，一些疫苗可为干燥形式，如可注射固体或贴片上的干燥或聚合制品的形式。
[0115]疫苗组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本不含(即小于5yg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞[32，42]。更优选无汞的疫苗。可包含琥珀酸α-生育酚以替代含汞化合物[32]。特别优选不含防腐剂的疫苗。
[0116]为了控制张力，优选包含生理性盐，如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其浓度可以是l-20mg/ml。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。
[0117]疫苗组合物的渗透压通常为200m0sm/kg-400m0sm/kg，优选为240-360m0sm/kg，更优选为290-310m0sm/kg。虽然以前报道过渗透压对疫苗接种引起的疼痛无影响[43]，但优选将渗透压保持在此范围内。
[0118]疫苗组合物可含有一种或多种缓冲剂。常用的缓冲剂包括:磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是具有氢氧化铝佐剂时)；或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂的浓度一般是5-20mM。
[0119]疫苗组合物的pH通常为5.0-8.1，更一般为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。因此，本发明方法可包括在包装前调整批料疫苗pH的步骤。
[0120]所述疫苗组合物优选无菌。所述疫苗组合物优选无热原，如小于IEU/剂量(内毒素单位，标准量度)，优选小于0.1EU/剂量。所述疫苗组合物优选不含谷蛋白。
[0121]本发明的疫苗组合物可包含去污剂，如聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(称为’吐温’)、辛苯聚糖(如辛苯聚糖_9(曲通X100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、溴化十六烷基三甲铵(’CTAB’)或脱氧胆酸钠，特别用于裂解疫苗或表面抗原疫苗。去污剂可仅以痕量存在。因此，疫苗中可包含各自的含量小于lmg/ml的辛苯聚醇-10和聚山梨醇酯80。其它痕量残留组分可以是抗生素(如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。
[0122]疫苗组合物可含有供一次免疫的物质，或者可含有供多次免疫的物质(即‘多剂量’药盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或补充方案)，该组合物可包含在装有无菌接头以取出物质的容器中。
[0123]流感疫苗的给药剂量体积一般为约0.5ml，但可将一半剂量(即约0.25ml)给予儿
Mo
[0124]组合物和药盒优选储存于2°C-8°C。其不应冷冻。理想情况下应避直射光保存。
[0125]宿主细胞DNA
[0126]由细胞系分离和/或培养病毒时，标准实践是使最终疫苗中残留的细胞系DNA含量最小化，以尽可能减少该DNA的潜在致癌活性。
[0127]因此，按照本发明制备的疫苗组合物优选含有每剂量低于1ng(优选低于lng，更优选低于10pg)的残留宿主细胞DNA，但可能存在痕量宿主细胞DNA。
[0128]任何残留宿主细胞DNA的平均长度优选小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于10bp等。
[0129]在疫苗制备过程中可采用标准纯化方法，如色谱法等去除污染的DNA。可通过核酸酶处理，例如DNA酶处理来提高对残留宿主细胞DNA的去除。参考文献44和45公开了一种减少宿主细胞DNA污染的方便方法，该方法包括两步处理，先使用DNA酶(如Benzonase)处理，这一步可以在病毒生长过程中使用，然后使用阳离子去污剂(如CTAB)处理，这一步可以在病毒颗粒破坏过程中使用。也可利用烷化剂如丙内酯处理来去除宿主细胞DNA，该方法也宜用于灭活病毒颗粒[46]。
[0130]佐剂
[0131]本发明组合物宜包含佐剂，其作用是增强在接受组合物的患者中引起的免疫应答(体液免疫和/或细胞免疫)。优选的佐剂包含水包油乳液。已知各种这类乳液，其通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。乳剂中的油滴直径通常小于5 μ m，理想情况下具有亚微米直径，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳剂。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。
[0132]该乳剂也可包含诸如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的坚果油的示例有花生油、大豆油、椰子油和橄榄油。可以采用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯虽然不天然存在于种籽油中，但可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质来制备。来源于哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源的纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程是本领域中熟