知的。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，可用于本文的鱼油的几种示例有鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油(诸如鲸蜡)。通过生化途径以5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物，2,6, 10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，其是本文特别优选的。角鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是优选的油。包括角鲨烯和角鲨烷在内的鱼油易于从市售来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。另一种优选的油是α-生育酚(参见下文)。
[0133]可以使用油的混合物。
[0134]表面活性剂可以按其“HLB” (亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂的HLB值为至少10，优选至少15，更优选至少16。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于:聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ;以商品名D0WFAX?出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链ΕΡ/Ρ0嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9 (曲通X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如Tergit0lTMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽(Brij)表面活性剂)，如三甘醇单月桂基醚(苄泽30);以及脱水山梨糖醇酯(通常称为司盘(SPAN))，如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中包含的表面活性剂优选吐温80 (聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85 (去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。
[0135]可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80))和辛苯聚醇(如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100))的组合也是有用的。另一种有用的组合包括月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。
[0136]优选的表面活性剂含量(重量百分比)为:聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80) 0.01-1%,特别是约0.1 %;辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1 %，特别是0.005-0.02 %;聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9) 0.1-20 %，优选0.1_10%，特别是0.1-1%或约0.5%。
[0137]所述疫苗含裂解病毒时，优选在水相中含有游离的表面活性剂。这是有利的，因为游离表面活性剂可在所述抗原上产生‘裂解效果’，因此破坏否则可能存在的任何未裂解病毒颗粒和/或病毒颗粒聚集体。这可改善裂解病毒疫苗的安全性[47]。
[0138]优选的乳液的平均液滴大小为小于I μπι，例如小于等于750nm、小于等于500nm、小于等于400nm、小于等于300nm、小于等于250nm、小于等于220nm、小于等于200nm或更小。可通过某些技术(如微流化)方便地获得这些液滴尺寸。
[0139]本发明所用的具体水包油乳剂佐剂包括但不限于:
[0140]?角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5%角鲨烯、约0.5%聚山梨酯80和约0.5%司盘85。以重量计，这些比例为4.3%角鲨烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%司盘85。这种佐剂称为‘MF59’ [48-50]，参考文献51的第10章和参考文献52的第12章更详细地描述了该佐剂。.MF59乳剂优选包含柠檬酸根离子，例如1mM柠檬酸钠缓冲液。
[0141]?包含角鲨烯、α -生育酚和聚山梨酯80的乳液。该乳剂可包含磷酸盐缓冲盐水。这些乳剂可含有(以体积计)2-10%角鲨烯、2-10%生育酚和0.3-3%聚山梨酯80，且角鲨烯:生育酚的重量比优选小于等于I (例如0.90)，因为这能提供更稳定的乳剂。角鲨烯和聚山梨酯80的体积比可以约为5:2，或者重量比约为11:5。因此这三种组分(角鲨烯、生育酚、聚山梨酯80)可以1068:1186:485或约55:61:25的重量比存在。可通过以下方法制备一种这样的乳液(“AS03”):将吐温80溶解于PBS产生2%溶液，然后将90ml该溶液与5g DL- α -生育酚和5ml角鲨烯的混合物混合，然后使该混合物微流体化。所得乳液可含有如平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。所述乳液也可含有3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3d-MPL)。此种类型的另一有用乳液可包含(每人剂量)0.5-10mg角鲨烯、0.5-1 Img生育酚和0.l_4mg聚山梨酯80 [53]，例如，以上述比例。
[0142].角鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL(见下文)。该乳液可包含磷酸盐缓冲液。
[0143]?含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α -生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75:11:10(例如，750 yg/ml聚山梨酯80、110yg/ml曲通X-100和100 μ g/ml琥珀酸α -生育酚)，且这些浓度应包括来自抗原的这些组分的任何贡献。该乳液还可包含角鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下文)。水相可包含磷酸盐缓冲液。
[0144].角鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401( “PlUr0niCTML121”)的乳液。该乳液可用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与苏氨酰基-MDP —起用于“SAF-1 ”佐剂中[54] (0.05-1 % Thr_MDP、5%角鲨烷、2.5% Pluronic L121和0.2%聚山梨酸酯80)。也可不与Thr-MDP —起使用，例如在“AF”佐剂中[55] (5%角鲨烷、1.25% Pluronic L121和0.2%聚山梨酸酯80)。优选微流体化。
[0145].含有角鲨烯、水溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯
(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’ )的乳液。所述乳剂优选为热可逆的和/或其中至少90%油滴(以体积计)小于200nm[56]。该乳剂也可含有一种或多种以下物质:糖醇；低温保护剂(例如糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。所述乳液可包含TLR4激动剂[57]。可将这类乳液冻干。
[0146]?角鲨烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[58]。含佐剂化疫苗中这些组分的终浓度(重量)是5%角鲨烯、4%泊洛沙姆-105(普流罗尼克多元醇)和2% Abil-Care85 (双-PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16 二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。
[0147].含有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非离子型表面活性剂的乳剂。如参考文献59所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。
[0148].不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GP1-0100，如参考文献60所述)、二甲基二-十八烷基溴化铵和/或N，N- 二-十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。
[0149]?皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[61]。
[0150].包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[62]。
[0151].包含矿物油、非离子亲脂水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[62]。
[0152]在一些实施方式中，可在递送时临时将乳液与抗原混合，因此所述佐剂和抗原可单独地保存在包装或分销的疫苗中，以便在使用时配制成最终制剂。在其它实施方式中，在生产过程中将乳液与抗原混合，因此所述组合物以液体含佐剂形式包装。该抗原通常采用水性形式，从而最终通过混合两种液体来制备疫苗。待混合的两种液体的体积比可变(例如5:1-1:5)，但一般是约1:1。在上述具体乳液说明中给出组分浓度时，这些浓度通常用于非稀释组合物，因此所述浓度在混合抗原溶液后会降低。
[0153]疫苗组合物的包装
[0154]适用于本发明组合物(或药盒组分)的容器包括药瓶、注射器(如一次性注射器)、鼻喷器等。这些容器应无菌。
[0155]组合物/组分装在药瓶中时，药瓶优选由玻璃或塑料材料制成。摇瓶优选在加入组合物之前已灭菌。为了避免胶乳敏感患者的问题，药瓶优选用无胶乳塞子密封，且优选所有包装材料均不含胶乳。所述药瓶可包含单一剂量的疫苗，或者可以包含一个以上剂量(‘多剂量’药瓶)，如10个剂量。优选的药瓶由无色玻璃制成。
[0156]药瓶可以有适合的帽(如鲁尔(Luer)锁)，从而预填装注射器可插入该帽，可以将注射器的内容物推入药瓶(如在其中复溶冻干物质)，并可以将药瓶的内容物移回注射器中。从药瓶移出注射器后，可连上针头，将该组合物给予患者。该帽优选位于封口或盖子内侦牝以便在封口或盖子移除后才能接触到该帽。药瓶，特别是多剂量药瓶，可装有允许无菌取出其内含物的瓶帽。
[0157]将某一组分包装到注射器中时，该注射器可连有针头。如果未连接针头，可随注射器提供单独的针头以便组装和使用。这种针头可装在护罩中。优选安全针头。一般是1-英寸23号、1-英寸25号和5/8-英寸25号针头。可提供有剥离标签的注射器，该标签上可打印上内含物的批号、流感季节和过期日期，以帮助记录保存。注射器中的活塞优选带有防脱装置，以防止活塞在吸出时意外脱出。注射器可以具有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽，以在连接针头前密封顶端，所述顶帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则针头优选地装有丁基橡胶护罩。优选的注射器是以商品名“ Tip-Lok” ?销售的注射器。
[0158]容器可标注显示半剂量体积，例如以利于递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可有显不0.25ml体积的标记。
[0159]在使用玻璃容器(如注射器或药瓶)时，优选采用由硼硅酸盐玻璃，而非钠钙玻璃制成的容器。
[0160]可将药盒或组合物与单页宣传品包装在一起(在同一个盒子中)，所述单页宣传品包括疫苗的详细情况如给药说明书、疫苗内所含抗原的详情等。说明书也可包含警示，例如准备好肾上腺素溶液以防疫苗接种后发生过敏反应等。
[0161]治疗方法和疫苗的给药
[0162]本发明提供了一种根据本发明生产的疫苗。这些疫苗组合物适合给予人类或非人动物对象如猪或鸟类，且本发明提供了在对象中产生免疫应答的方法，该方法包括将本发明组合物给予所述对象的步骤。本发明还提供用作药物的本发明组合物，并提供本发明组合物在生产在对象中产生免疫应答的药物中的应用。
[0163]这些方法和应用产生的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。评价接种流感病毒疫苗后抗体应答、中和能力和保护水平的方法为本领域熟知。人类研究表明，对人流感病毒血凝素的抗体效价与保护作用相关联(血凝反应-抑制效价约30-40的血清样品对同源病毒感染给出约50%的保护作用)[63]。一般通过血凝反应抑制、微量中和、单径向免疫扩散(SRID)和/或单径向溶血(SRH)来测定抗体应答。本领域熟知这些测定技术。
[0164]可以各种方式给予本发明组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[64-66]、口服[67]皮内[68，69]、经皮、透皮[70]等。
[0165]根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成人。目前，推荐将流感疫苗用于年龄大于6个月的儿童和成年人免疫。因此，人类对象可以小于I岁、I?5岁、5?15岁、15?55岁或至少55岁。接受该疫苗的优选对象是老年人(例如大于等于50岁、大于等于60岁，优选大于等于65岁)、年轻人(如小于等于5岁)、住院对象、健康护理工作人员、军队服务人员和军人、妊娠妇女、慢性疾病对象、免疫缺陷对象、在接受该疫苗7天前接受过抗病毒化合物(如奥塞米韦或扎那米韦化合物；见下)的对象、对鸡蛋过敏的人和出国旅行者。然而该疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。对于大流行毒株，优选给予所有年龄组。
[0166]本发明优选组合物满足1、2或3个CPMP功效标准。在成年人(18_60岁)中，这些标准是:(1)大于等于70%血清保护；(2)大于等于40%血清转化；和/或(3)GMT增加大于等于2.5倍。在老年人(大于60岁)中，这些标准是:(I)大于等于60%血清保护；(2)大于等于30%血清转化；和/或(3)GMT增加大于等于2倍。这些标准基于至少50位患者的开放标记研究。
[0167]可通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径(如肠胃外初次和粘膜加强，粘膜初次和肠胃外加强等)给予多个剂量。给予一个以上剂量(一般是两个剂量)特别用于免疫未曾免疫接触的患者，例如从未接受过流感疫苗的人，或者用于免疫接种抵御新的HA亚型(如大流行爆发中的亚型)。一般以至少I周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。
[0168]可将本发明产生的疫苗与其它疫苗基本上同时(在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一医学咨询或就诊期间)给予患者，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的B型流感嗜血杆菌(H.1nfluenzae)疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、肺炎球菌偶联疫苗等基本同时给药。在老年患者中特别有用的是与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗基本同时给药。
[0169]相似地，可将本发明疫苗与抗病毒化合物，具体是对流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奥塞米韦和/或扎那米韦)基本上同时给予患者(在对健康护理专业人员进行的同一医学咨询或就诊期间)。这些抗病毒化合物包括神经氨酸酶抑制剂，如(3R, 4R, 5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)_1_环己烯_1_羧酸或5_(乙酰基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)_氨基]_2，6-脱水-3，4，5-三脱氧-D-甘油-D-半乳糖壬-2-烯酮酸，包括它们的酯(如乙酯)和盐(如磷酸盐)。优选的抗病毒物是(3R, 4R, 5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)_1_环己烯-1-羧酸，乙酯和磷酸盐(1:1)，也称为磷酸奥塞米韦(达菲(TAMIFLU) ?)。
[0170]概述
[0171]术语“包括”涵盖“包含”以及“由……组成”，例如，“包括”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。
[0172]词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。需要时，词语“基本上”可从本发明的定义中略去。
[0173]与数值X相关的术语“约”是可任选的，并且表示，例如x± 10%。
[0174]除非另有明确说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的工艺不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。在有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将组合与第三种组分混合等。
[0175]本方法的各步骤可在相同或不同时间、相同或不同地理位置如国家以及由相同或不同人或实体进行。
[0176]将动物(且特别是牛)材料用于培养细胞时，其应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，特别是未患牛海绵状脑病(