HSV-1感染的L929 (而不是来自HEK293T或HEK293T/STING细胞）的提取物包含导致在 透化的Raw264. 7细胞中的IRF3二聚化的cGAMP活性。这些结果表明，在HEK293T细胞中 STING的表达赋予细胞响应cGAMP以激活IRF3并诱导IFNI3的能力，但不足以建立对DNA 或DNA病毒响应，这是由于HEK293T细胞在合成cGAMP方面存在缺陷。
[0038] 其次，本发明人测试了L929和L929-shSTING细胞对cGAMP的响应。与ISD和 c-二-GMP类似，cGAMP诱导的IRF3二聚化依赖于STING。相比之下，聚[I :C]在不存在 STING的情况下仍诱导IRF3的二聚化。这些结果证明，对于cGAMP激活IRF3而言，STING 是必要的。
[0039] 最后，本发明人检查了 STING是否直接结合cGAMP。从大肠杆菌中表达并纯化包含 残基139-379的重组STING蛋白（已证明其结合c-二-GMP (14))，然后用32P-cGAMP孵育，随 后进行UV诱导的交联。当STING和32P-cGAMP都存在时，检测到对应于交联的STING-cGAMP 复合体的放射性同位素示踪带。高浓度的ATP或GTP未竞争STING-cGAMP复合体的形成。 相比之下，此条带的强度随竞争的冷cGAMP、c-二-GMP或c-二-AMP浓度的增加而下降， 这表明STING上的cGAMP结合位点与和c-二-GMP以及c-二-AMP相互作用的结合位点相 重叠。实际上，最近表明参与STING到c-二-GMP的结合（14)中的数个残基的突变（包括 S161Y、Y240S和N242A)也削弱了 STING到cGAMP的结合。总之，这些结果证明，cGAMP是结 合并激活STING的配体。
[0040] 已经显示环二核苷酸的功能为调节多种生理过程（包括细菌运动性和生 物膜形成）的细菌第二信使（15)。最近的报告显示，C-二-GMP在原生动物网柄菌 (Dictyostelium)中产生，其功能是作为形态发生素以诱导柄细胞的分化（16)。在此实例 中，本发明人鉴定了 cGAMP是后生动物中的第一环二核苷酸。此外，本发明人示出了 cGAMP 是I型干扰素的诱导物。cGAMP的作用类似于cAMP(其是研究最多的第二信使（17))的作 用。如cAMP -样（当腺苷酸环化酶被上游配体激活时，由腺苷酸环化酶合成），cGAMP由响 应DNA配体刺激的环化酶合成（18)。cAMP结合并激活蛋白激酶A和其它效应物分子。类 似地，cGAMP结合并激活STING以引发下游信号级联。作为哺乳动物细胞中的内源性分子， cGAMP可用于免疫治疗方法或作为疫苗佐剂。
[0041] 参考文献和注释
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[0060] 实施例2.环GMP-AMP合酶是激活I型干扰素途径的细胞质DNA传感器
[0061] 在DNA被证明是遗传物质很久之前，已知DNA刺激免疫应答，但DNA作为免疫刺激 物的功能的机制仍知之甚少（1)。虽然在树突细胞中DNA可通过结合内涵体中的Toll-样 受体9 (TLR9)来刺激I型干扰素的产生，但在细胞质中DNA如何诱导IFN仍不清楚。具体 而言，在干扰素途径中检测细胞质DNA的传感器仍然难以捉摸（2)。虽然数种蛋白质（包括 DAI、RNA聚合酶III、IFI16、DDX41和若干其它的DNA解链酶）已暗示具有作为潜在的诱导 IFN的DNA传感器的功能，但还均未得到普遍认可（3)。
[0062] 环GMP-AMP合酶（cGAS)的纯化和鉴定。本发明人示出，递送DNA到哺乳动物细胞 或细胞质提取物引发了环GMP-AMP (cGAMP)的产生，其结合并激活STING，导致IRF3的激活 和IFNP的诱导（4)。为了鉴定cGAMP合酶（cGAS)，本发明人从鼠纤维肉瘤细胞系L929中 分离出包含cGAMP合成活性的细胞质提取物（S100)。在存在鲱鱼精巢DNA(HT-DNA)的情况 下，通过将柱级分与ATP和GTP孵育来分析这一活性。用Benzonase消化DNA并95°C加热 以变性蛋白之后，将包含cGAMP的耐热上清液与产气荚膜梭菌素0(PF0)-透化的Raw264. 7 细胞（转化的小鼠巨噬细胞）孵育。通过非变性凝胶电泳分析这些细胞中cGAMP诱导的 IRF3二聚化（4)。通过使用这种分析，本发明人进行了三个独立路线的纯化，各个路线由四 个步骤的色谱组成，但差别在于所使用的柱或柱的顺序。具体而言，第三路线包括使用生物 素化的DNA寡聚物（已知作为免疫刺激DNA或ISD的45-bp DNA)的亲和纯化步骤。本发 明人估计发明人获得一系列8000-15000倍的纯化和来自于这些分离路线的活性的2-5% 的回收率。然而，在各个纯化路线的最后步骤中，级分的银染并未揭示与cGAS活性共纯化 的清晰的蛋白条带，这表明假定的cGAS蛋白的丰度可能在L929细胞质提取物中是非常低 的。
[0063] 本发明人开发了一种定量质谱策略以鉴定各个纯化路线的最后步骤中与cGAS活 性共纯化的一系列蛋白。本发明人有理由认为，在所有三个纯化路线中假定的cGAS蛋白必 须与其活性共纯化，而大多数"污染"蛋白则不会。因此，从各个纯化路线的最后步骤中，本 发明人选择了包含大部分cGAS活性的级分（峰级分）和包含非常弱或没活性的相邻的级 分。通过SDS-PAGE分离各个级分中的蛋白质并用微型液相色谱质谱（微型-LC-MS)进行 鉴定。通过使用MaxQuant软件的无标记定量来分析数据（5)。值得注意的是，虽然在一个 或两个纯化路线中，许多蛋白质与cGAS活性共纯化，但在所有三个路线中仅有三种蛋白质 共纯化。这三个都是假定的未鉴定蛋白：E330016A19(登记号#:NP_775562)、具有包含双 PH结构域的蛋白2的Arf-GAP(NP_742145)和信号识别颗粒9kDa蛋白（NP_036188)。在这 些之中，在E330016A19中鉴定了超过24个独特的多肽，代表了在此507个氨基酸的蛋白中 41 %的覆盖率。
[0064] 生物信息学分析驱使本发明人关注E3 30016A19，其表现出对于寡腺苷酸合酶 (0AS1)的催化结构域的结构和序列同源性。具体而言，E330016A19包含保守的[G[G/S] x9 13 [E/D] h [E/D] h基序，其中x9 13表示由任意氨基酸组成的9-13个侧翼残基，h表示疏水氨 基酸。这一基序被发现于核苷酸转移酶（NTase)家族（6)。除0AS1之外，这一家族包括腺 苷酸环化酶、聚[A]聚合酶和DNA聚合酶。E330016A19的C末端包含雄性异常21 (Mab21) 结构域（其首次在线虫（C. elegans)蛋白Mab21中被鉴定（7))。序列比对揭示了 C-末端 的NTase和Mab21结构域从斑马鱼到人类都是高度保守的，而N末端序列的保守性小得多 (8)。有趣的是，E330016A19的人同源物C6orfl50(也被称为MB21D1)最近被鉴定为在筛 选其过表达抑制病毒复制的干扰素刺激的基因（ISG)的数个阳性命中之一（9)。为了澄清 并基于本文所提出的证据，本发明人提出将小鼠蛋白E330016A19命名为m-cGAS，并且将人 同源物C6orf 150命名为h-cGAS。定量RT-PCR示出m-cGAS的表达在永生MEF细胞中是低 的，但在L929、Raw264. 7和骨髓来源的巨噬细胞（BMDM)中是高的。类似地，h-cGAS RNA的 表达在HEK293T细胞中是非常低的，但在人单核细胞系THP1中是高的。免疫印迹进一步证 实，h-cGAS蛋白在THP1中表达但不在HEK293T细胞中表达。因此，不同细胞系中的m-cGAS 和h-cGAS的表达水平与这些细胞响应细胞质DNA产生cGAMP和诱导IFN 的能力相关（4， 10) 〇
[0065] cGAS催化触发I型干扰素的产生。在HEK293T (其缺少STING表达）中的m-cGAS 的过表达不诱导IFNP，而在HEK293T细胞中STING的稳定表达使得这些细胞高度有能力 经m-cGAS诱导IFNP。重要的是，假定的催化残基G198和S199点突变至丙氨酸去除了 m-cGAS诱导IFNP的能力。这些突变以及其它的假定的催化残基E211和D213突变至丙 氨酸，也去除了 J1EK293T-STING细胞中的m-cGAS诱导IRF3二聚化的能力。由c-GAS诱导 的IFNP的幅度与由MAVS(衔接蛋白，其在RNA传感器RIG-I的下游起作用）诱导的相当， 且比其它假定的DNA传感器（包括DAI、IFI16和DDX41)诱导的高数个数量级。为了确定 cGAS和其它假定的DNA传感器的过表达是否导致细胞中cGAMP的产生，将来自经热处理的 细胞提取物的上清液与PF0-透化的Raw264. 7细胞进行孵育，然后测量IRF3的二聚化。在 HEK293T-STING细胞中表达的所有蛋白质中，仅有cGAS能在细胞中产生cGAMP活性。
[0066] 为了测试cGAS是否能在体外合成cGAMP，本发明人纯化了野生型（WT)和来自转 染的HEK293T细胞的突变体Flag-cGAS蛋白。WT m-cGAS和h-cGAS (而不是cGAS的无催 化活性的突变体）能产生cGAMP活性，其在透化的Raw264. 7细胞中刺激IRF3二聚化。重 要的是，m-cGAS和h-cGAS的体外活性都依赖于HT-DNA的存在。为了测试DNA是否在细胞 中增强经cGAS的IFNI3诱导，将带有或不带有HT-DNA的不同数量的cGAS表达质粒转染进 HEK293T-STING细胞。经低剂量（10和50ng)的cGAS质粒，HT-DNA显著地增强了 IFN0的 诱导，而高剂量（200ng)则没有。相比于cGAS，IFI16和DDX41即使与HT-DNA共转染，也不 诱导IFN员。
[0067] IFNP经DNA转染和DNA病毒感染的诱导需要cGAS。本发明人使用了两对不同 的siRNA以在L929细胞中敲降m-cGAS，并且发现两种siRNA寡核苷酸均显著地抑制了经 HT-DNA的IFNP诱导，且抑制的程度与敲降m-cGAS RNA的效率相关。本发明人还建立了 两个稳定表达靶向于m-cGAS的不同区域的shRNA序列的L929细胞系。相比于表达对照 shRNA(GFP)的另一种细胞系，这些细胞响应HT-DNA以诱导IFNI3能力严重受损。重要的 是，在L929-sh-cGAS细胞中cGAS的表达恢复了 IFN0的诱导。在L929-sh-cGAS细胞中 STING或MAVS的表达或递送cGAMP至这些细胞也诱导IFN0。相比之下，在L929-shSTING 细胞中cGAS的表达或cGAMP的递送不能诱导IFN0，而在这些细胞中STING或MAVS的表达 恢复了 IFNP的诱导。定量RT-PCR分析证实了在稳定表达相应shRNA的L929细胞系中敲 降cGAS和STING的特异性和效率。这些结果表明，cGAS在STING的上游起作用且是IFNI3 经细胞质DNA的诱导所需要的。
[0068] 单纯性疱疹病毒1型（HSV-1)是已知的通过STING和IRF3的激活诱导IFN的DNA 病毒。重要的是，抗m-cGAS (而不是GFP)的shRNA在L929细胞中强烈抑制由HSV-1感染诱 导的IRF3二聚化。相比之下，cGAS的敲降不影响IRF3经仙台病毒（一种RNA病毒）的激 活。为了确定在细胞中cGAMP的产生是否需要cGAS，本发明人将HT-DNA转染进L929-shGFP 和L929-sh-cGAS或用HSV-1感染这些细胞，然后制备包含cGAMP的耐热级分，其随后递送 到透化的Raw264. 7细胞中以测量IRF3的激活。cGAS的敲降在很大程度上去除了由DNA转 染或HSV-1感染所产生的cGAMP活性。使用选择性反应监测（SRM)的定量质谱表明，由DNA 转染或HSV-1感染诱导的cGAMP的丰度在缺少cGAS的L929细胞中显著地降低。总之，这 些结果证实，cGAS对于产生cGAMP并响应DNA转染或HSV-1感染激活IRF3而言是必要的。 [0069] 为了确定在人类细胞中的DNA传感通路中cGAS是否是重要的，本发明人建立了稳 定表达靶向于h-cGAS的shRNA的THP1细胞系。h-cGAS的敲降强烈抑制了经HT-DNA转染 的或经牛痘病毒（另一种DNA病毒，而不是仙台病毒）感染的IFN0诱导。h-cGAS的敲降 也在THP1细胞中抑制了由HSV-1感染诱导的IRF3二聚化。这一结果进一步在另一个表达 靶向于h-cGAS的不同区域的shRNA的THP1细胞系中得到证实。多个cGAS的shRNA序列 在小鼠和人细胞系中抑制DNA诱导的IRF3激活和IFNP诱导的强且特异性的作用证明了 cGAS在STING依赖的DNA传感通路中的关键作用。
[0070]重组cGAS蛋白以DNA依赖的方式从ATP和GTP催化合成cGAMP。为了测试cGAS 是否足以催化cGAMP的合成，本发明人在HEK293T细胞中表达了 Flag标记的h-cGAS并将 其纯化至表观同质性。在HT-DNA存在的情况下，纯化的c-GAS蛋白催化产生cGAMP活性， 其在透化的Raw264. 7细胞中刺激IRF3二聚化。DNase-I处理去除了此活性。通过其它的 DNA(包括聚（dA :dT)、聚（dG :dC)和ISD，而没有RNA聚（I :〇)也能刺激cGAS活性。经 cGAS的cGAMP合成需要ATP和GTP，但不需要CTP或UTP。这些结果表明，纯化的cGAS蛋白 质的环化酶活性被DNA刺激，而不是RNA。
[0071] 本发明人还在大肠杆菌中表达m-cGAS作为SUM0融合蛋白。纯化后，sum〇-m-cGAS 以DNA依赖的方式产生cGAMP活性。然而，经Sumo蛋白酶去除SUMO标记之后，m-cGAS蛋白 以非DNA依赖的方式催化cGAMP的合成。这一缺少DNA依赖性的原因尚不清楚，但可能是 由于在sumo去除后的一些构象变化。滴定实验示出，小于InM的重组cGAS蛋白导致了可 检测的IRF3的二聚化，而cGAS的无催化活性的突变体即使在高浓度也不能激活IRF3。为 了正式地证明了 cGAS催化cGAMP的合成，用SRM通过微型-LC-MS分析反应产物。在包含 纯化的cGAS、ATP和GTP的60分钟反应中检测到了 cGAMP。cGAMP的身份进一步通过使用 碰撞诱导解离（CID)的离子碎裂来确认。由纯化的cGAS合成的cGAMP的片段化方式揭示 了 m/z值与那些化学合成的cGAMP相匹配的产物离子。总之，这些结果证实，纯化的cGAS 催化从ATP和GTP的cGAMP的合成。
[0072] cGAS结合DNA。经DNA的cGAS活性的刺激表明c-GAS是DNA传感器。实际上， GST-m-cGAS 和 GST-h-cGAS (而不是 GST-RIG-I 的 N 末端[RIG-I (N)]都被生物素化的 ISD 所沉淀。相比之下，生物素化的RNA不结合cGAS。缺失分析显示包含残基1-212的h-cGAS 的N-末端片段（而不是C-末端片段213-522)结合ISD。包含残基161-522的较长的C端 片段结合ISD，这表明序列161-212可能对于DNA的结合是重要的。然而，来自h-c