Rpgr x染色体连锁视网膜退化的aav介导的基因治疗的制作方法
【专利说明】RPGRX染色体连锁视网膜退化的AAV介导的基因治疗
[0001] 发明背景
[0002] 光受体与视网膜色素上皮细胞（RPE)协同发挥作用以优化光子捕获并生成被传 输至更高的视觉中心并作为可视图像感知的信号。视网膜光受体中视觉过程的破坏会导致 失明。视网膜中的遗传缺陷通过多种机制导致大量的视觉损伤疾病。
[0003] 在光受体营养不良中，X染色体连锁形式的视网膜色素变性（XLRP)是严重视力丧 失的最常见原因之一。超过25年前，已鉴定到了遗传位点并随后发现了潜在的基因缺陷。 视网膜色素变性GTP酶调节因子（RPGR)基因中突变所引起的人XLRP是在XLRP中占大多 数的严重早发视网膜退行性疾病。视网膜色素变性GTP酶调节因子（RPGR)基因中的突变 占XLRP病例中的超过70 %，且RPGR中的突变热点外显子0RF15在22-60 %的患者中突变。 该疾病不断发展，大多数患者在40岁前成为法定的盲人。
[0004] 直到最近，在揭示由突变导致PR变性的分子机制和在开发对大部分RP形式（包 括RPGR-XLRP)有效的治疗方法方面，进展仍较为缓慢。疾病相关的动物模型对开发和验证 新疗法至关重要。对于RPGR-XLRP，同时存在小鼠和犬模型。在狗中，0RF 15中两种天然 产生的不同微缺失导致不同的疾病表型。X染色体连锁进行性视网膜萎缩UXLPRA1 ;缺失 1028-1032)具有230个残基的C端截短；该疾病是青少年的，但出现时是后发的并在数年 中发展。相反地，与XLPRA2(缺失1084-1085)相关的两个核苷酸的缺失导致了移码并包括 改变推定蛋白等电点的34个碱性氨基酸并截短了末端的161个残基。该疾病是早发且迅 速发展的。两种模型都对应于人XLRP的疾病谱，且虽然在相对严重性方面存在差别，但其 相当于生命的第一个十年内发生的人类疾病。
[0005]目前，对于患有XLRP的人患者，没有成功的治疗。需要一种RPGR-XLRP的治疗方 法，该治疗方法是有效的、安全的且具有长期稳定性。
【发明内容】
[0006] 在一个方面，本发明提供了一种预防、阻止或缓解对象中视网膜色素变性相关视 力丧失的方法。该方法包括给予对象有效浓度的组合物，该组合物包含携带编码正常RPGR 基因的核酸序列或其片段的重组腺相关病毒（rAAV)以及药学上可接受的运载体，所述核 酸序列或其片段处于在对象的眼部细胞中表达基因产物的调节序列的控制下。
[0007] 在另一个方面，提供了一种在有此需要的对象中预防或阻止光受体功能丧失或者 提高光受体功能的方法。该方法包括给予对象有效浓度的组合物，该组合物包含携带编码 正常RPGR基因的核酸序列或其片段的rAAV以及药学上可接受的运载体，所述核酸序列或 其片段处于在对象的眼部细胞中表达基因产物的调节序列的控制下。结果是，对象的视力 提尚或视力丧失得到阻止和/或缓解。
[0008] 在另一个方面，本发明提供了一种改进有此需要的对象中光受体结构的方法。该 方法包括给予对象有效浓度的组合物，该组合物包含携带编码正常RPGR基因的核酸序列 或其片段的rAAV以及药学上可接受的运载体，所述核酸序列或其片段处于在对象的眼部 细胞中表达基因产物的调节序列的控制下。结果是，对象的视力提高或视力丧失得到阻止 和/或缓解。
[0009] 在另一个方面，提供了一种预防、阻止或缓解有此需要的对象中外网状层（0PL) 异常的方法。该方法包括给予对象有效浓度的组合物，该组合物包含携带编码正常RPGR基 因的核酸序列或其片段的rAAV以及药学上可接受的运载体，所述核酸序列或其片段处于 在对象的眼部细胞中表达基因产物的调节序列的控制下。结果是，对象的视力提高或视力 丧失得到阻止和/或缓解。
[0010] 在另一个方面，本发明提供了一种预防、阻止或缓解有此需要的对象中双极细胞 树突收缩（bipolar cell dendrite retraction)的方法。该方法包括给予对象有效浓度 的组合物，该组合物包含携带编码正常RPGR基因的核酸序列或其片段的rAAV以及药学上 可接受的运载体，所述核酸序列或其片段处于在对象的眼部细胞中表达基因产物的调节序 列的控制下。结果是，对象的视力提高或视力丧失得到阻止和/或缓解。
[0011] 在另一个方面，提供了一种预防、阻止或缓解有此需要的对象中双极细胞功能丧 失的方法。该方法包括给予对象有效浓度的组合物，该组合物包含携带编码正常RPGR基因 的核酸序列或其片段的rAAV以及药学上可接受的运载体，所述核酸序列或其片段处于在 对象的眼部细胞中表达基因产物的调节序列的控制下。结果是，对象的视力提高或视力丧 失得到阻止和/或缓解。
[0012] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种预防、阻止或缓解有此需要的对象中以 神经丝过表达为特征的轴突损伤的方法。该方法包括给予对象有效浓度的组合物，该组合 物包含携带编码正常RPGR基因的核酸序列或其片段的rAAV以及药学上可接受的运载体， 所述核酸序列或其片段处于在对象的眼部细胞中表达基因产物的调节序列的控制下。结果 是，对象的视力提尚或视力丧失得到阻止和/或缓解。
[0013] 在另一个方面，提供了一种在具有XLRP发展风险对象中预防该疾病的方法。该方 法包括给予对象有效浓度的组合物，该组合物包含携带编码正常RPGR基因的核酸序列或 其片段的rAAV以及药学上可接受的运载体，所述核酸序列或其片段处于在对象的眼部细 胞中表达基因产物的调节序列的控制下。
[0014] 在另一个方面，本发明提供了一种预防、阻止或缓解有此需要的对象中杆视蛋白 和/或R/G锥视蛋白错误定位（mislocalization)的方法。该方法包括给予对象有效浓度 的组合物，该组合物包含携带编码正常RPGR基因的核酸序列或其片段的rAAV以及药学上 可接受的运载体，所述核酸序列或其片段处于在对象的眼部细胞中表达基因产物的调节序 列的控制下。结果是，对象的视力提高或视力丧失得到阻止和/或缓解。
[0015] 在另一个方面，本发明提供了一种预防、阻止或缓解有此需要的对象中X染色体 连锁视网膜色素变性（XLRP)相关的0PL突触变化、双极细胞异常或内视网膜异常的方法。 该方法包括给予对象有效浓度的组合物，该组合物包含携带编码正常RPGR基因的核酸序 列或其片段的rAAV以及药学上可接受的运载体，所述核酸序列或其片段处于在对象的眼 部细胞中表达基因产物的调节序列的控制下。结果是，对象的视力提高或视力丧失得到阻 止和/或缓解。
[0016] 在另一个方面，本发明提供了一种提高或保持有此需要的对象中XLRP相关的0NL 厚度的方法。该方法包括给予对象有效浓度的组合物，该组合物包含携带编码正常RPGR基 因的核酸序列或其片段的rAAV以及药学上可接受的运载体，所述核酸序列或其片段处于 在对象的眼部细胞中表达基因产物的调节序列的控制下。结果是，对象的视力提高或视力 丧失得到阻止和/或缓解。
[0017] 在另一个方面，提供了一种治疗或预防有此需要的对象中XLRP的方法。该方法包 括（a)鉴定患有XLRP或具有XLRP发展风险的对象；(b)进行基因型分析并鉴定RFGR基因 中的突变；（c)进行非侵入性视网膜成像和功能研究并鉴定可被靶向用于治疗的残留光 受体区域；以及（d)给予对象有效浓度的组合物，该组合物包含携带编码正常光受体细胞 特异性基因的核酸序列的重组病毒以及药学上可接受的运载体，所述正常光受体细胞特异 性基因处于在对象的眼部细胞中表达基因产物的启动子序列的控制下，从而预防、阻止或 缓解XLRP。
[0018] 在另一个方面，本发明提供了一种包含携带编码正常RPGR基因的核酸序列或其 片段的重组腺相关病毒（rAAV)以及药学上可接受的运载体的组合物，所述核酸序列或其 片段处于在对象的眼部细胞中表达基因产物的调节序列的控制下。
[0019] 在另一个方面，本发明提供了一种包含携带编码正常RPGR基因的核酸序列或其 片段的重组AAV2/5假型腺相关病毒并与适于注射的运载体和其他组分一起配制的组合 物，所述核酸序列或其片段处于在对象的眼部细胞中指导表达基因产物的人IRBP或人 GRK1启动子的控制下。在另一个实施方式中，上述任意方法都利用该组合物。
[0020] 附图简要说明
[0021] 图1是整合有hIRPB启动子（SEQ ID N0:2)和hRPGRl-0RF15基因的AAV2/5载体 的质粒图。该质粒中的IRBP启动子是人IRBP基因近端启动子区域的241bp片段。
[0022] 图2是整合有hGRKl启动子（SEQ ID N0:3)和hRPGRl-0RF15基因的AAV2/5载体 的质粒图。
[0023] 图3是编码人RPGR变体SEQ ID NO: 1的核酸序列（下方）和编码变体 BK005711(Wright)SEQ ID N0:4的核酸序列（上方）的比对。
[0024] 图4是人RPGR变体SEQ ID N0:5的氨基酸序列（上方）和变体BK005711(Wright) SEQ ID N0:6的氨基酸序列（下方）的比对。
[0025] 图 5 显示了 SEQ ID N0:5 的hRPGR变体的氨基酸残基aa 845-1039 与 SEQ ID N0:5 的变体BK005711的氨基酸残基845-1052,还与形成共有序列SEQ ID NO: 7的共有氨基酸的 对比。对比中的共有序列在非共有氨基酸的位置处显示缺口。
【具体实施方式】
[0026] 本发明涉及多种组合物和利用这些组合物的治疗方法，该组合物包含有效浓度 的携带编码正常RPGR基因的核酸序列或其片段的重组腺相关病毒（rAAV)并与适于注射的 运载体和其他组分一起配制，该核酸序列或其片段处于在对象的眼部细胞中指导表达基因 产物的调节序列的控制下。该治疗方法涉及眼部疾病和与其相关的病症。
[0027] 除非另有说明，否则本文所用的科技术语与本发明所属领域普通技术人员通常理 解和向本领域技术人员提供对于本申请所用术语的一般指导的公开文本中的含义相同。仅 为清楚起见提供了以下定义，并不旨在限制要求保护的发明。
[0028] 术语"一个"或"一种"指一种或多种，例如，"一种基因"被理解为表示一种或多种 这类基因。如此，术语"一个"（或"一种"）、"一个或多个"和"至少一个"在本文中可互换 使用。如文中所用，术语"约"指的是相对提供的参考存在10%的差异，除非另外说明。
[0029] 对于以下说明，表明本文所述各组合物都可用于本发明方法的另一个实施方式。 此外，还表明，对于方法中使用的本文所述各组合物，其本身在另一个实施方式中是本发明 的一个实施方式。当在说明书中的各个实施方式使用"包括"用语时，在其他情况下，相关 的实施方式也可以用"由……组成"或"大致由……组成"用语来解读和描述。
[0030] A.哺乳动物对象
[0031] 本文所用术语"哺乳动物对象"或"对象"包括需要这些治疗或预防方法的任何哺 乳动物，特别是人。需要这类治疗或预防方法的其他哺乳动物包括狗、猫或其他驯养动物、 马、牲畜、实验室动物（包括非人灵长类）等。该对象可以是雄性或雌性。在一个实施方式 中，该对象患有RP或具有RP发展风险，且更具体地，RP是XLRP。在另一个实施方式中，该 对象是XLRP的"携带者"，即在至少一条X染色体中具有至少一个RPGR突变。由于XLRP是 X染色体连锁的疾病，通常具有两条X染色体的雌性可以是RPGR基因中特定突变的纯合子 或杂合子或者在各X染色体上的RPGR基因中具有不同突变的复合杂合子。在RPGR基因中 存在突变的仅具有一条X染色体的正常雄性被称作半合子。在一个实施方式中，患有XLRP 或具有XLRP发展风险的对象是半合子雄性。在另一个实施方式中，患有XLRP或具有XLRP 发展风险的对象是纯合子雌性或杂合子雌性。在其他实施方式中，具有XLRP发展风险的对 象包括有XLRP家族史的那些、在RPGR基因中存在一个或多个确定的突变的那些、RPGR突 变的雌性携带者（杂合子雌性）的后代或者在两条X染色体上都携带RPGR突变的雌性的 后代。
[0032] 在另一个实施方式中，该对象显示出XLRP的临床体征。XLRP的临床体征包括但不 限于周边视力减弱、中央（阅读）视力减弱、夜晚视力减弱、颜色感觉丧失、视敏度下降、光 受体功能下降、色素变化。在另一个实施方式中，该对象经诊断患有XLRP。在另一个实施方 式中，该对象尚未显示出XLRP的临床体征。
[0033] 在另一个实施方式中，该对象具有10 %或更多的光受体损伤/损失。在另一个实 施方式中，该对象具有20 %或更多的光受体损伤/损失。在另一个实施方式中，该对象具有 30 %或更多的光受体损伤/损失。在另一个实施方式中，该对象具有40 %或更多的光受体 损伤/损失。在另一个实施方式中，该对象具有50 %或更多的光受体损伤/损失。在另一 个实施方式中，该对象具有60 %或更多的光受体损伤/损失。在另一个实施方式中，该对象 具有70 %或更多的光受体损伤/损失。在另一个实施方式中，该对象具有80 %或更多的光 受体损伤/损失。在另一个实施方式中，该对象具有90 %或更多的光受体损伤/损失。
[0034] B. XLRP 和 RPGR
[0035] 在一个方面，本文所述方法涉及视网膜色素变性（RP)的治疗或预防。在一个实施 方式中，该视网膜色素变性是X染色体连锁视网膜色素变性（XLRP)。XLRP是最严重的RP 形式之一，表现为疾病的早发（通常在第一个十年内）和快速发展。由于该疾病是X染色 体连锁的，纯合子雌性是罕见的，通常仅存在于小且分离的群体中。因此，该疾病主要影响 雄性，但也影响携带者（杂合子）雌性，表现为多种视网膜退化水平。该疾病在家族之间和 内部表现出广谱的疾病严重程度。
[0036] 视网膜色素变性GTP酶调节因子（RPGR)是一种XLRP中涉及的815aa蛋 白（Meindl 等，Nature Genetics, 13:35-42(1996 年 5 月）和 Vervoort 等，Nature Genetics, 25:462-6 (2000)，其通过引用纳入本文）。RPGR中超过290种的突变(http：// rpgr. hgu. mrc. ac. uk/supplementary/^D标题为"Summary of RPGR mutation and p〇lym〇rphism(RPGR突变和多态性总结）"的烷基，其通过引用纳入本文）构成了70% 以上的XLRP患者。该蛋白含有RCC-1样结构域，其特征是高度保守的鸟嘌呤核苷酸 交换因子。含有19个外显子的RPGR的组成型转录本在多种组织中表达（Hong和Li， Invest Opthalmology Vis Sci, 43 (11) : 3373-82,其通过引用纳入本文）。一种RPGR变 体终止于RPGR基因的内含子15。选择性末端外显子由组成型外显子15和内含子15的 一部分组成并称作0RF15。由外显子1至0RF15编码的该蛋白同种型在光受体中普遍使 用并在0RF15中发现了许多导致疾病的突变（Vervoort和Wright，Hum Mutat. 2002年 5月，19(5) :486-500 ;Aguirre等，Exp Eye Res, 2002, 75:431-43 ;和Neidhardt等，Hum Mutat. 2007, 28 (8) : 797-807,其通过引用纳入本文）。
[0037] 在一个方面，该方法使用编码正常RPGR基因的核酸序列或其片段。本文所用术语 "RPGR"指全长基因本身或下文中进一步定义的功能片段。编码正常RPGR基因的核酸序列 可来源于天然表达RPGR基因或其同源物的任何哺乳动物。在另一个实施方式中，RPGR基 因序列来源于旨在使用组合物治疗的同一哺乳动物。在另一个实施方式中，RPGR来源于 人。在另一个实施方式中，RPGR序列是全长人RPGR0RF15克隆的序列，其包括外显子1至 0RF15(Vervoort R 等（2000)，Nat Genet 25:462-466,其通过引用纳入本文）。在另一个实 施方式中，RPGR序列示于SEQ ID N0:1。在另一个实施方式中，RPGR序列是RPGR0RF15克隆 的功能片段。术语"片段"或"功能片段"指保留全长克隆功能的任何片段，但无需具有相同 水平的表达或活性。例如，已显示代表RPGR-0RF 15但在重复区中缩短了 654bp的acDNA在 小鼠中重建了 RPGR功能（Hong, D.H?等，Invest Ophthalmol Vis Sci 46(2) :435_441，其通 过引用纳入本文）。类似的人功能片段或其他RPGR序列可由本领域技术人员确定。在另一 个实施方式中，RPGR来源于犬。在其他实施方式中，对RPGR序列进行了某些修饰以增强目 标细胞中的表达。这类修饰包括密码子优化（参见例如美国专利号7, 561，972、7, 561，973 和7, 888, 112,其通过引用纳入本文）和将翻译起始位点周围的序列转化为共有Kozak序 列 gccRccATGR。参见 Kozak 等，Nucleic Acids Res. 15(20) :8125-8148,其通过引用纳入 本文。
[0038] 本文所用术语"眼部细胞"指眼睛中或与眼睛功能相关的任何细胞。该术语可指光 受体细胞中的任意一种，包括视杆、视锥和光敏神经节细胞或视网膜色素上皮（RPE)细胞。 在一个实施方式中，该眼部细胞是光受体细胞。
[0039] C. AAV载体和组合物
[0040] 在本发明的某些实施方式中，RPGR核酸序列或其片段通过病毒载体（其中大多数 是本领域已知和可用的）递送至需要治疗的眼部细胞。对于递送至眼部细胞，理想情况下 治疗性载体是无毒、无免疫原性、易于生产且能够有效地保护并递送DNA至目标细胞中。在 一个特定实施方式中，该病毒载体是腺相关病毒载体。在另一个实施方式中，本发明提供 了一种包含腺相关病毒载体的治疗性组合物，该腺相关病毒载体包含合适启动子控制下的 RPGR序列。在一个实施方式中，该RPGR序列由SEQ IDNO:1编码。
[0041] 超过30种天然产生的AAV血清型是可用的。存在许多AAV衣壳中的天然变体，从 而能够鉴定并使用具有特别适用于眼部细胞的特性的AAV。可通过常规分子生物学技术对 AAV病毒进行工程改造，从而能够优化这些颗粒用于RPGR核酸序列的细胞特异性递送、最 小化免疫原性、调节稳定性和颗粒寿命、有效降解、精确递送至细胞核等。
[0042] 因此，可通过由含有编码RPGR的序列的重组改造的AAV或人工AAV递送实现在眼 部细胞中过表达RPGR。AAV的用途是DNA外源递送的一般模式，原因在于其相对无毒、提供 高效的基因转移并可容易地进行优化以用于特定目的。在从人或非人灵长类（NHP)中分离 并经良好表征的AAV血清型中，人血清型2是第一个被开发为基因转移载体的AAV ;其在不 同目标组织和动物模型中被广泛用于高效基因转移实验。基于AAV2的载体对一些人类疾 病模型的实验性应用的临床试验正在进行中，且包括诸如囊胞性纤维症和B型血友病的疾 病。其他 AAV 血清型包括但不限于 AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8 和 AAV9。参 见例如讨论了多种AAV血清型的W0 2005/033321，其通过引用纳入本文。
[0043] 用于组装成载体所需的AAV片段包括cap蛋白（包括vpl、vp2、vp3和高变区）、 rep蛋白（包括rep 78、rep 68、rep 52和rep 40)和编码这些蛋白的序列。这些片段易 于在多种载体系统和宿主细胞中使用。这类片段可单独使用、与其他AAV血清型序列或片 段联用或者与来自其他AAV或非AAV病毒序列的元件联用。如本文所用，人工AAV血清型 包括但不限于具有非天然产生的衣壳蛋白的AAV。这类人工衣壳可通过任何合适的技术使 用选定的AAV序列（例如vpl衣壳蛋白的片段）与异源序列生成，该异源序列获自不同的 选定的AAV血清型、相同的AAV血清型的非连续部分、非AAV病毒来源或非病毒来源。人 工AAV血清型可以是（但不限于）假型AAV、嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或"人源化"AAV 衣壳。本发明中可使用假型载体，其中一种AAV的衣壳被异源衣壳蛋白代替。为说明目的， 在下文实施例中使用AAV2/5。在一个优选实施方式中，该AAV是AAV2/5。在另一个优选实 施方式中，该AAV是AAV2/8。参见上文引用的Mussolmo等。
[0044] 在一个实施方式中，本文所述组合物和方法中使用的载体含有最低限度的编码选 定的AAV血清型衣壳（例如AAV5衣壳）的序列或其片段。在另一个实施方式中，有用的载 体含有最低限度的编码选定的AAV血清型r印蛋白（例如AAV5r印蛋白）的序列或其片段。 任选