专利名称：β－肾上腺素受体拮抗剂用于制备治疗外层视网膜疾病的药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及β-肾上腺素受体拮抗剂如倍他洛尔用于治疗外层视网膜疾病的用途。
本发明的技术背景迄今为止，已经对100多种与视网膜退化有关的基因进行了绘图或克隆。视网膜变性疾病如与年龄有关的黄斑变性(ARMD)和色素性视网膜炎(RP)的发病机制是多方面的并且在那些具有遗传倾向的人群中可由环境因素引发。其中的一种环境因素，光照射被认为是一种对视网膜变性疾病如ARMD的进展起作用的因素(Young，眼科学概论(Survey of Ophthalmology)，1988，Vol.32252-269)。已经证明导致视网膜细胞光损伤的光氧化应激是研究由下列原因引起的视网膜变性疾病的有用模型首先对光受体和外层视网膜的视网膜色素上皮(RPE)造成损伤(Noell等，调查眼科学和视觉科学(Investigative Ophthalmology & Visual Science)，1966，Vol.5450-472；Bressler等，眼科学概论(Survey of Ophthalmology)，1988，Vol.32375-413；Curcio等，调查眼科学和视觉科学(Investigative Ophthalmology & Visual Science)，1996，Vol.371236-1249)；它们与细胞死亡，编程性细胞死亡的机理相同(Ge-Zhi等，美国眼科学学会会刊(Transactions of the AmericanOphthalmology Society)，1996，Vol.94411-430；Abler，等，分子病理学和药理学研究通讯(Research Communications inMolecular Pathology and Pharmacology)，1996，Vol.92177-189)；光被认为是一种导致ARMD和RP进展的环境危险因素(Taylor等，眼科学文献(Archives of Ophthalmology)，1992，Vol.11099-104；Naash等，调查眼科学和视觉科学(InvestigativeOphthalmology & Visual Science)，1996，Vol.37775-782)；并且还已经证明抑制光-氧化损伤的治疗干预对遗传性视网膜变性疾病的动物模型是有效的(LaVail等，国家科学院院报(Proceedings ofthe National Academy of Science)，1992，Vol.8911249-11253；Fakforovich等，自然(Nature)，1990，Vol.34783-86)。
据报道一些不同种类的化合物能降低多种动物模型的视网膜光损伤，所述化合物包括抗氧化剂如抗坏血酸盐(Organisciak等，调查眼科学和视觉科学(Investigative Ophthalmology & VisualScience)，1985，Vol.261580-1588)，二甲基硫脲(Organisciak等，调查眼科学和视觉科学(Investigative Ophthalmology & VisualScience)，1992，Vol.331599-1609；Lam等，眼科学文献(Archives of Ophthalmology)，1990，Vol.1081751-1757)，α-生育酚(Kozaki等，Nippon Ganka Gakkai Zasshi，1994，Vol.98948-954)，和β-胡萝卜素(Rapp等，最新眼研究(Current EyeResearch)，1996，Vol.15219-223)；钙拮抗剂，如氟桂利嗪，(Li等，实验眼研究(Experimental Eye Research)，1993，Vol.5671-78；Edward等，眼科学文献(Archives of Ophthalmology)，1992，Vol.109554-622)；生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，脑-衍生神经因子(BDNF)，睫状神经营养因子(CNTF)，和白介素-1-β(LaVail等，国家科学院院报(Proceedings of theNational Academy of Science)，1992，Vol.8911249-11253)；糖皮质素，如甲泼尼龙(Lam等，格雷费临床和实验眼科学文献(Graefes ArchiVes of Clinical & Experimental Ophthalmology)，1993，Vol.231729-736)，地塞米松(Fu J.，等，实验眼研究(Experimental Eye Research)，1992，Vol.54583-594)；NMDA-拮抗剂，如依利罗地和MK-801(Collier等，调查眼科学和视觉科学(Investigative Ophthalmology & Visual Science)，1999，Vol.40，pg.S159)和铁螯合剂如去铁胺(Li等，最新眼研究(Current EyeResearch)，1991，Vol.2133-144)。
眼用β-肾上腺素能拮抗剂，也称作β-肾上腺素受体拮抗剂或β-阻断剂已被充分证明是用于治疗青光眼的降IOP剂。目前，世界范围内已有数种眼用β-阻断剂被批准使用。其中大多数是非选择性β-阻断剂；倍他洛尔是一种心脏选择性β-阻断剂，商品名为Betoptic或BetopticS(Alcon Laboratories，Inc.，Fort Worth，Texas)。
作为青光眼和其它内层视网膜病变的潜在治疗方法，Osbome等已经在大鼠局部缺血/再灌注损伤模型证明倍他洛尔对神经具有保护作用(脑研究(Brain Research)，1997，Vol.751113-123)。局部缺血/再灌注导致视网膜电图(ERG)b-波振幅减小，所述b-波振幅是一种内层视网膜功能的测定指标，而不是光受体或RPE功能的测定指标。这种ERG b-波缺陷可以通过采用倍他洛尔进行治疗而得到保护。通过采用倍他洛尔进行治疗，在神经节细胞层和内核层的胞体以及内网织层中的胆碱乙酰转移酶以及钙网膜蛋白免疫反应性的保存与内层视网膜的保护作用一致。Osborne等人进行的体外研究结果也表明倍他洛尔能够防止小鸡视网膜细胞中红藻氨酸(kainate)诱导的胞内钙升高，能够部分抑制由于葡萄糖-氧缺乏引起的兔子内层视网膜中GABA免疫反应性的变化，以及能够部分防止在皮质培养物中谷氨酸盐-诱导的乳酸脱氢酶释放。β-肾上腺素受体拮抗剂还被证明能够松弛由KCl诱导的猪睫状动脉的收缩(Hester等，眼科学概论(Survey ofOphthalmolog)，Vol.38S125-S134，1994)。此外，某些β-阻断剂已被证明能够引起与其β-肾上腺素能的阻断作用无关的血管舒张(Yu等，青光眼的血管危险因素和神经保护(Vascular Risk Factorsand Neuroprotection in Glaucoma)，pp.123-134，(Drance，S.ed.)修订(Update)，1996；Hoste等，最新眼研究(Current EyeResearch)，Vol.13483-487，1994；和Bessho等，日本药理学杂志(Japanese Journal of Pharmacology)，Vol.55351-358，1991)。实验证明这是由于某些β-阻断剂能够发挥钙通道阻断剂的作用并能够减少钙离子进入血管平滑肌细胞，所述钙离子在所述平滑肌细胞中参与收缩反应而减小血管腔径和减少血流。
附图的简要说明
图1显示通过选择性β1-阻断剂、倍他洛尔及其异构体的全身用药预防与光有关的视网膜病。
图2显示通过非选择性β-阻断剂、噻吗洛尔的全身用药预防与光有关的视网膜病。
图3比较通过倍他洛尔和左倍他洛尔的眼局部用药预防与光有关的视网膜病的效果。
图4显示P23H突变型视紫质转基因大鼠的视网膜功能的保存。
图5显示与其它药物比较，左倍他洛尔的单次给药导致的内源性视网膜神经营养因子mRNA水平的上调。
本发明概述本发明涉及已被发现能够用于治疗外层视网膜疾病的β-肾上腺素受体拮抗剂，特别是ARMD；RP和其它形式的遗传性视网膜变性疾病；视网膜脱离和撕脱；黄斑皱缩(macular pucker)；影响外层视网膜的局部缺血；与包括光动力学疗法(PDT)在内的激光疗法相关的损伤(滤线栅(grid)、病灶的和全视网膜的)外伤；外科手术(视网膜易位，视网膜下手术或玻璃体摘出术)或光诱导的医源性视网膜病以及视网膜移植物的存留。如本文所使用的，外层视网膜包括RPE，光受体，苗勒细胞(其突起延伸到外层视网膜内的程度)，和外网织层。所述化合物被配制成全身或眼局部用药。
优选实施方案的详述神经营养因子可能是有效的神经保护剂，但作为多肽，难以输送到视网膜或中枢神经系统。我们已经证明倍他洛尔上调了CNTF和bFGFmRNA的视网膜表达并且这能够防止外层视网膜发生光诱导编程性细胞死亡。我们已经发现用倍他洛尔进行治疗能够彻底防止光氧化诱导的视网膜病并且能够显著降低视网膜功能的丧失。所述化合物的安全性优势对于急性和慢性治疗特别理想。这种药物在治疗各种外层视网膜变性疾病中具有实用性。
在我们的光损伤病例中，抗氧化剂无效(α-生育酚)或者在高剂量的条件下只具有微弱的效果(抗坏血酸盐，维生素E类似物)。同样，某些钙拮抗剂(氟桂利嗪，尼卡地平)的效果适中而其它钙拮抗剂(硝苯地平，尼莫地平，维拉帕米)对预防由光诱导的功能性的或形态学的变化没有效果。然而，已经发现β-肾上腺素受体拮抗剂在这些光损伤病例中是有效的并因此被用于治疗外层视网膜疾病。
外层视网膜疾病包括正常个体或遗传倾向性个体中的光受体和RPE细胞受环境(外伤，局部缺血，光氧化应激)诱导而发生的急性和慢性变性疾病。这将包括，但不限于ARMD，RP和其它形式的遗传性视网膜变性疾病、视网膜脱离、撕脱、黄斑皱缩(macular pucker)、影响外层视网膜的局部缺血、与包括光动力学疗法(PDT)在内的激光疗法相关的损伤(滤线栅、病灶的和全视网膜的)，热或冷冻疗法，外伤，外科手术(视网膜易位，视网膜下手术或玻璃体摘出术)或光诱导的医源性视网膜病以及视网膜移植物的存留。
本发明涉及任何β-肾上腺素受体拮抗剂包括它们的异构体和药学上可接受的盐用于治疗外层视网膜疾病的用途。优选的β-肾上腺素受体拮抗剂还具有神经营养活性并且可能具有钙拮抗剂活性。
根据本发明，有用的代表性的β-肾上腺素受体拮抗剂包括，但不限于倍他洛尔(R或S或外消旋的)，噻吗洛尔，卡替洛尔，左布诺洛尔，美替洛尔，苯呋洛尔，普萘洛尔，美托洛尔，阿替洛尔，吲哚洛尔(pendolol)，和喷布洛尔(pinbutolol)。
优选的β-肾上腺素受体拮抗剂是倍他洛尔和/或它的R或S异构体。所述S异构体也被称作左倍他洛尔。
总之，对于变性疾病，口服本发明的β-阻断剂，每日剂量为0.001至500毫克。优选的每日总剂量为1至100毫克。
非口服用药如玻璃体内、眼局部、透皮贴剂(transdermal patch)、皮下、非肠道、眼内、结膜下或眼球后注射，离子电渗疗法或缓释生物可降解的聚合体或脂质体可能需要对提供治疗有效量的化合物所必需的每日总剂量进行调节。在外科手术过程中所述β-阻断剂还能以眼冲洗液的形式来用药，参见，例如，美国专利号US4,443,432。该专利被引入本文作参考。浓度范围应该是0.001μM至100μM，优选地0.01μM至5μM。
所述β-阻断剂可以被添加到各种类型的眼药制剂中局部应用于眼。它们可以与眼科学上可接受的防腐剂、表面活性剂、增粘剂、凝胶剂、增透剂、缓冲液、氯化钠和水结合以形成含水、无菌眼用悬浮液或溶液或预形成的凝胶或原位形成的凝胶。眼用溶液制剂可通过将所述化合物溶解在一种生理上可接受的等渗含水缓冲液中来进行制备。并且，所述眼用溶液可以含有一种眼科学上可接受的表面活性剂以促进所述化合物的溶解。所述眼用溶液可以含有一种增粘剂如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮之类以提高所述制剂在结膜囊中的停留。为了制备无菌的眼药膏制剂，所述活性成分与在一种适当的载体如矿物油、液体羊毛脂或白矿脂中的防腐剂结合。无菌眼凝胶制剂可以通过将所述活性成分悬浮在一种亲水性基质中来进行制备，所述亲水性基质是通过按照已经公开的类似眼药制剂的配制方法，将例如聚羧乙烯-940(carbopol-940)之类混合在一起来制备的；可以加入防腐剂和补剂。
如果进行局部用药，β-阻断剂优选地被配制成pH大约为4至8的局部眼用悬浮夜或溶液。该β-阻断剂在这些制剂中的含量通常为0.001％至5％重量百分比，优选0.01％至2％重量百分比。因此，根据技术熟练的临床医生的处理决定，为了进行局部用药，每天1至4次将1至2滴的这些制剂滴在眼睛的表面。
口服生物可利用的优选β-阻断剂，倍他洛尔(或其R或S异构体)被证明用药产生副作用的发生率很低，并且能有效地通过血脑屏障，表明在靶组织，即视网膜中能够达到有效浓度。倍他洛尔被记载在美国专利号US4,252,984和US4,311,708中，其所述内容被引入本文作参考。
在我们的光氧化诱导的视网膜病例中，对β-肾上腺素受体拮抗剂进行了评价，该例是一种能够用于鉴定治疗RP和ARMD的药物的视网膜变性疾病模型。出乎意料地是，倍他洛尔及其对映体被证明是一种效力非常强的神经保护剂。光受体和RPE细胞均完全避免了光诱导的功能性改变和形态学损伤。噻吗洛尔也具有神经保护作用，但是效力显著低于前者。另外，利用转基因大鼠模型对左倍他洛尔进行了评价，结果表明其对视网膜功能具有显著的保护作用，所述转基因大鼠具有视紫素突变，该突变类似于在一些患有遗传性变性疾病的病人身上观察到的缺陷。
实施例1利用倍他洛尔及其对映体预防由光氧化诱导的视网膜病光视网膜病是由于RPE以及视神经网膜吸收了可见光或近紫外辐射而受到过度的刺激造成的。损伤的严重程度取决于波长、辐射度、持续照射时间、物种、眼色素沉着以及年龄。损伤可以由细胞膜的过氧化反应、线粒体酶如线粒体氧化酶失活和/或胞内钙的增加引起。由光氧化应激引起的细胞损伤导致细胞发生细胞编程性死亡(Shahinfar等，1991，最新眼研究(Current Eye Research)，Vol.1047-59；Abler等，1994，调查眼科学和视觉科学(InvestigativeOphthalmology & Visual Science).Vol.35(增刊)1517)。氧化应激诱导的细胞编程性死亡被认为是多种眼病的诱因，包括医源性视网膜病、黄斑变性、RP和其它形式的遗传性变性疾病、缺血性视网膜病、视网膜撕脱、视网膜脱离、青光眼和视网膜新血管形成(Chang等，1995，眼科学文献(Archives of Ophthalmology)，Vol.113880-886；Portera-Cailliau等，1994，美国国家科学院院报(Proceedings of National Academy of Science)(U.S.A.)，Vol.91974-978；Buchi，E.R.，1992，实验眼研究(Experimental EyeResearch)，Vol.55605-613；Quigley等，1995，调查眼科学和视觉科学(Investigative Ophthalmology & Visual Science)，Vol.36774-786)。在以下动物中观察到光诱导的视网膜损伤小鼠(Zigman等1975，调查眼科学和视觉科学(InvestigativeOphthalmology & Visual Science)，Vol.14710-713)，大鼠(Noell等，1966，调查眼科学和视觉科学(InvestigativeOphthalmology & Visual Science)，Vol.5450-473；Kuwabara等，1968，眼科学文献(Archives of Ophthalmology)，Vol.7969-78；LaVail，M.M.，1976，调查眼科学和视觉科学(Investigative Ophthalmology & Visual Science)，Vol.1564-70)，兔(LaWWill，T.，1973，调查眼科学和视觉科学(Investigative Ophthalmology & Visual Science)，Vol.1245-51)，松鼠(Collier等，1989；In LaVail等，遗传性和环境诱导的视网膜变性(Inherited and Environmentally Induced RetinalDegenerations).Alan R.Liss，Inc.，纽约；Collier等，1989，调查眼科学和视觉科学(Investigative Ophthalmology & VisualScience)，Vol.30631-637)，非人灵长类(Tso，M.O.M.，1973，调查眼科学和视觉科学(Investigative Ophthalmology & VisualScience)，Vol.1217-34；Ham等，1980，Vision Research，Vol.201105-1111；Sperling等，1980，视觉研究(Vision Research)，Vol.201117-1125；Sykes等，1981，调查眼科学和视觉科学(Investigative Ophthalmology & Visual Science).Vol.20425-434；Lawwill，T.，1982，美国眼科学学会会刊(Transactionsof the American Ophthalmology Society)，Vol.80517-577)和人(Marshall等，1975，英国眼科学杂志(British Journal ofOphthalmology)，Vol.59610-630；Green等，1991，美国眼科学杂志(American Journal of Ophthalmology)，Vol.112520-27)。对于人来说，长期暴露在环境辐射中被认为是导致ARMD的一个危险因素(Young，R.W.，1988，眼科学概论(Survey of Ophthalmology)，Vol.32252-269；Taylor等，1992，眼科学文献(Archives ofOphthalmology)，Vol.11099-104；Cruickshank等，1993，眼科学文献(Archives of Ophthalmology)，Vol.111514-518)。
全身用药实施例1的目的在于确定选择性β-肾上腺素受体拮抗剂，尤其是倍他洛尔(外消旋的)，左倍他洛尔(S-异构体)和倍他洛尔(R-异构体)是否具有神经保护作用以及是否能够使视网膜细胞避免患上由光氧化诱导的视网膜病。实施例2的目的在于确定噻吗洛尔、强效非选择性β1-和β2-阻断剂在该光氧化应激模型中的剂量依赖效应。雄性SpragueDawley大鼠被随机分成药物试验组或赋形剂试验组。在6小时的光谱滤过蓝光(～220fc)照射前48、24、和0小时给所述大鼠腹膜内注射三次所述赋形剂或药物。将对照大鼠圈养在周期光照下的笼子中。对照大鼠不服用所述的赋形剂或药物。所述ERG是一种眼睛对闪光产生电反应的非侵袭性临床测定指标。所述a-波和b-波是ERG的两种有助于诊断视网膜功能的成分。所述a-波反映外层视网膜功能并且由光受体和RPE之间的相互作用来产生，而b-波反映内层视网膜功能，尤其是在两极细胞上。尽管光照射对所述内层视网膜没有产生明显的损伤，但是b-波由于缺乏光受体输入而受到抑制。a-波振幅或潜伏期的变化对外层视网膜病变有诊断意义。经过5天的恢复期后对暗适应的麻醉的大鼠记录ERG(氯胺酮-HCl，75mg/Kg；赛拉嗪，6mg/Kg)。通过注视空视野引发眼睛对闪光产生的电反应。将针对一系列强度增加的闪光的ERG数字化以分析波形的时序特征以及反映电压-记录强度的关系。
结果实验1倍他洛尔与其R和S异构体的比较服用赋形剂的大鼠.经5天恢复期后测量的结果表明蓝光照射6小时使得ERG反应振幅显著低于对照(ANOVA，p＜0.001)(图1)。服用赋形剂的大鼠的a-波和b-波的最大振幅比对照大鼠降低了大约66％。另外，阈值应答降低并由更大的闪光强度来激发。
倍他洛尔(外消旋的).倍他洛尔(外消旋的)全身用药能够对外层和内层视网膜功能提供剂量依赖型保护作用从而避免在5天恢复期后大鼠发生光诱导的视网膜变性(图1)。大鼠以20和40mg/kg的剂量服用倍他洛尔的最大a-波应答振幅分别比服用赋形剂的大鼠高1.9和2.1倍。
左倍他洛尔(S-异构体).由光氧化诱导的严重视网膜病被诱发后5天测定ERG，结果表明左倍他洛尔的全身用药能够针对外层视网膜功能提供剂量依赖型的保护。以20mg/kg和40mg/kg的剂量进行左倍他洛尔的全身用药对视网膜功能提供了有效的保护从而避免氧化损伤(图1)。服用剂量为20mg/kg的大鼠的ERG振幅是正常值的69％并且是服用赋形剂的大鼠振幅的两倍。5天恢复期后对服用了左倍他洛尔(40mg/kg)的大鼠进行测定的结果表明获得了视网膜对闪光应答的完全性保护。这种保护能够持续到4星期恢复期以后。
倍他洛尔(R-异构体).对服用了20和40mg/kg的大鼠进行测定的结果表明外层和内层视网膜功能获得了部分而有效的保护从而避免了光诱导的视网膜变性(图1)。服用了(20或40mg/kg)倍他洛尔R异构体的大鼠的ERG大约是正常值的64％。这种保护能够持续到4星期恢复期以后。
实验2通过噻吗洛尔预防光视网膜病蓝光照射后5天，服用赋形剂的大鼠的外层视网膜功能降低了54％而内层视网膜功能降低了52％(图2)。以10，20，和40mg/kg的剂量进行噻吗洛尔的全身用药(IP)未能对视网膜功能提供有效的保护从而避免光氧化损害(图2)。对服用剂量为80mg/kg的大鼠记录到的ERG明显优于在服用赋形剂的大鼠中测定到的应答反应。
结论在由光氧化诱导的严重性视网膜病被诱发后5天或4星期的时候进行测定，结果表明β-肾上腺素受体拮抗剂、倍他洛尔及其旋光对映体的全身用药针对外层和内层视网膜功能提供了剂量依赖型的神经保护作用。测定结果表明以20和40mg/kg的剂量服用了这些β-肾上腺素受体拮抗剂的大鼠获得了有效的视网膜的保护。服用了左倍他洛尔的大鼠避免了所述的光诱导视网膜病。噻吗洛尔，一种非选择性β-阻断剂也能有效降低所述光照对视网膜造成氧化损伤的严重程度。
实施例2通过左倍他洛尔眼局部用药预防光氧化诱导的视网膜病本实验的目的在于确定进行了下列眼局部用药的大鼠所获得的视网膜保护的程度。利用光视网膜病模型评价左倍他洛尔(0.5％)，(外消旋的)倍他洛尔(0.5％)和赋形剂。按照实施例1中采用的由光氧化诱导的视网膜病实例中记载的方法进行光化学损伤的诱导以及利用ERG对视网膜功能进行评价。
受试者和用药雄性Sprague Dawley大鼠被随机分成赋形剂服用组(N＝10)，(外消旋的)倍他洛尔(0.5％)用药组(N＝10)或左倍他洛尔(0.5％)用药组(N＝10)。所述大鼠进行眼局部用药(b.i.d.)，每只眼睛两滴。光照前对大鼠进行17天的预用药并且光照后继续用药2天。将对照大鼠(N＝4)圈养在笼子中接受正常周期光照。
结果光照后5天，视网膜电图(ERG)测定的结果表明蓝光照射服用赋形剂的大鼠导致视网膜功能的显著下降(ANOVA，p＜0.004)(图3)。最大a-波反应振幅降低了58％而内层视网膜功能降低了56％。
与服用赋形剂的大鼠(图3)相比，左倍他洛尔的眼局部用药(b.i.d.)提供了显著的保护作用。而且，由于没有观察到对照大鼠与左倍他洛尔用药大鼠之间存在视网膜功能的显著差别，所以左倍他洛尔完全改善了该光诱导的视网膜病。
在倍他洛尔用药(外消旋的)大鼠中没有测定到显著的保护作用。对于倍他洛尔用药大鼠，ERG反应振幅较高但与从服用赋形剂的大鼠身上测定到的应答反应没有显著差异。
实施例3利用左倍他洛尔保护转基因鼠的视觉功能P23H视紫质突变转基因鼠具有在RP患者亚群中鉴定到的特异性视紫质突变。该变性的特征在于视网膜光受体的缓慢变性以及视网膜电图的显著减弱。在光损伤过程中，光受体的丧失首先经历编程性细胞死亡的过程。
方法受试者和用药将断奶大鼠随机分成药物组或赋形剂组。大鼠每隔一天服用(经口管饲法)赋形剂或左倍他洛尔(40mg/kg)。根据其完全改善光诱导视网膜病的能力来评价所述用药。按照实施例1中记载的方法记录ERG。
结果与服用赋形剂的大鼠相比，对3和6个月龄的P23H突变型视紫质转基因鼠进行测定的结果表明每隔一天口服左倍他洛尔(40mg/kg)显著减少了视网膜功能的丧失(图4)。6月龄大鼠的外层视网膜功能比在服用赋形剂大鼠中测定到的应答反应高32％。
实施例4通过倍他洛尔上调视网膜内源性神经营养因子LaVail等(Faktorovich等，自然(Nature)，Vol.34783-86，1990；LeVail等，国家科学院院报(Proceedings of the NaionalAcademy of Science)，1992，Vol.8911249-11253)证明玻璃体内注射一些生长因子能够避免光对视网膜造成的损伤。这些神经营养因子是长肽因而不易越过血-视网膜屏障。就慢性视网膜变性疾病的治疗方案而言，反复进行玻璃体内注射可能会引起包括出血、视网膜脱离和发炎在内的并发症。另一种治疗方案是利用腺病毒介导的基因转移(RCS鼠中的bFGF(bFGF in the RCS rat)，Cayouette等，神经科学杂志(Journal of Neuroscience)，Vol.18(22)9282-93，1998，和rd小鼠中的CNTF(CNTF in the rd mouse)，Cayouette等，人类基因疗法(Human Gene Therapy)，Vol.8(4)423-30，1997)，其由于超时表达的损失以及细胞的非同源性感染而有限地预防了光受体丧失。我们已经证明了将基因工程细胞定位在分泌CNTF的玻璃体中对于预防由氧化诱导的视网膜病也是有效的。一种新的治疗方案是确定上调内源性生长因子的药物。Wen等，(WO98/10758，1998年3月19日)，已经证明α2-肾上腺素受体激动剂能够上调bFGF并且预防光损伤。为了确定β-肾上腺素能拮抗剂是否能够诱导神经营养因子的内源性产生，对左倍他洛尔进行了评价。
左倍他洛尔的评价对雄性白化Sprague Dawley大鼠进行单次IP注射α2-肾上腺素受体激动剂(溴莫尼定)(20mg/kg)，β-肾上腺素能拮抗剂(左倍他洛尔)(20mg/kg)，或赋形剂并且在收集视网膜组织前在黑暗中饲养12小时。对暗适应的正常的对照大鼠也进行了评价。通过RNA印迹分析测定内源性视网膜生长因子mRNA的上调。将视网膜瞬间冻结在液氮中并保存到总RNA的分离。RNA样品在1.2％的琼脂糖凝胶上进行电泳跑胶，然后转移到尼龙膜上，进行预杂交，与标记的cDNA探针杂交16小时，冲洗后曝光至X-射线胶片上。所述印迹被剥离后，利用对18S RNA特异的寡核苷酸探针再次进行探测。利用凝胶图象扫描仅对bFGF，CNTF和18S RNA特异的电泳条带进行扫描分析。
结果没有观察到服用赋形剂的大鼠与对照大鼠之间bFGF/18S或CNTF/18S比值的差别(图5)。
单次服用溴莫尼定(20mg/kg)导致bFGF mRNA的表达量增加了14倍(图5)。然而在这些大鼠中，CNTF mRNA的表达量没有增加。
类似地，在接受了单次IP注射(20mg/kg)的大鼠中，左倍他洛尔，β-肾上腺素能拮抗剂使得bFGF mRNA的表达量增加了13倍(图5)。在这些啮齿动物的视网膜中，除了上调的bFGF，内源性CNTF mRNA的表达量与背景表达量相比增加了2.3倍。利用重组-CNTF进行的治疗被证明对预防光视网膜病和遗传性视网膜变性疾病是有效的。
结论我们出乎意料地发现左倍他洛尔是内源性bFGF mRNA的有效诱导剂。与α-肾上腺素受体激动剂不同，左倍他洛尔也能显著地增加CNTFmRNA的表达量。而且，我们已经证实如果受到光氧化的严重损害，服用左倍他洛尔、倍他洛尔(外消旋的)或其R-异构体能够有效地保护视网膜。CNTF mRNA的上调对于视网膜病的治疗非常重要。CNTF或其类似物预防外层视网膜变性的效力已经在大鼠和小鼠的光毒性模型、RCS营养不良大鼠、患有杆细胞-视锥细胞营养不良症的Rdy猫、视网膜变性犬齿动物模型、转基因大鼠(P23H和Q344ter)、转基因小鼠(Q344ter)、rd小鼠和rds小鼠中得到了证实。另一方面，已经证实了bFGF只在大鼠和小鼠光毒性模型和RCS营养不良大鼠中有效。
基于这些新发现，我们得出结论β-肾上腺素受体拮抗剂，尤其是左倍他洛尔和倍他洛尔，在转基因大鼠和光氧化应激模型中具有神经保护作用(图1，2，3，和4)并且在治疗多种外层视网膜的眼变性疾病中将会有效。通过包括CNTF和bFGF在内的内源性神经营养因子的上调可提供神经保护作用(图5)。
实施例5左倍他洛尔盐酸盐配方
a相当于0.25％的倍他洛尔游离碱b相当于0.5％的倍他洛尔游离碱c相当于0.75％的倍他洛尔游离碱d加入5％的超额量实施例权利要求
1.一种治疗外层视网膜疾病的方法，其包括施用一种药学有效量的β-肾上腺素受体拮抗剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病选自ARMD；RP和其它形式的遗传性视网膜变性疾病；视网膜脱离和撕脱；黄斑皱缩；影响外层视网膜的局部缺血；与包括光动力学疗法在内的激光疗法相关的损伤(滤线栅、病灶的和全视网膜的)；热或冷冻疗法；外伤；外科手术(视网膜易位，视网膜下手术或玻璃体摘出术)或光诱导的医源性视网膜病以及视网膜移植物的存留。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述β-肾上腺素受体拮抗剂选自倍他洛尔(R或S或外消旋的)，噻吗洛尔，卡替洛尔，左布诺洛尔，美替洛尔，苯呋洛尔，普萘洛尔，美托洛尔，阿替洛尔，吲哚洛尔和喷布洛尔。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述β-肾上腺素受体拮抗剂是倍他洛尔或其R或S异构体。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述β-肾上腺素受体拮抗剂选自倍他洛尔(R或S或外消旋的)，噻吗洛尔，卡替洛尔，左布诺洛尔，美替洛尔，苯呋洛尔，普萘洛尔，美托洛尔，阿替洛尔，吲哚洛尔和喷布洛尔。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述β-肾上腺素受体拮抗剂是倍他洛尔或其R或S异构体。
全文摘要
本发明涉及β－肾上腺素受体拮抗剂用于制备治疗外层视网膜疾病的药物的用途。
文档编号A61K31/165GK1402634SQ00816351
公开日2003年3月12日 申请日期2000年11月29日 优先权日1999年11月30日
发明者R·J·小克里尔, M·A·卡宾, L·小德桑蒂斯 申请人:爱尔康公司