诱导 IFN0。q-RT-PCR分析进一步证实了，cGAS对通过不同类型的合成或细菌DNA(除聚[dA: dT]之外）诱导IFNf3 RNA是必要的。时间过程实验表明在cGas /肺成纤维细胞中经ISD 的IFNP的诱导被完全去除，甚至在DNA转染后的早期时间点（2-8小时）时，这表明cGAS 对于经细胞质DNA的IFNf3诱导而言是必不可少的。
[0206] 为了测量WT和cGas /细胞中cGAMP的产生，本发明人进行了生物测定，其在来自 ISD转染细胞的细胞质提取物中测量cGAMP的活性。将提取物在95°C加热以变性大多数蛋 白（通过离心去除）。将可能包含cGAMP的上清液递送到人类单核细胞系THP1 (其已被细 菌毒素产气荚膜杆菌溶素-0(PF0)透化）。然后用非变性凝胶电泳测量IRF3的二聚化（其 激活的标志）。此分析表明，来自WT而不是cGas /小鼠的ISD转染的肺成纤维细胞的提取 物包含cGAMP活性，这表明cGAS在这些细胞响应细胞质DNA催化cGAMP合成的过程中具有 非冗余的作用。
[0207]之后，本发明人用DNA病毒单纯性疱疹病毒-1型（HSV1)、牛痘病毒（VACV)和HSV1 的突变株（被称为dl09,其缺失如已知拮抗免疫应答的ICP0的病毒蛋白（15))感染肺成纤 维细胞。经各个病毒的IFN 0诱导在cGas /和Stinggt/gt细胞中大部分被去除，在cGas+/细 胞中部分地被抑制。相比之下，经仙台病毒（已知激活RIG-I通路的RNA病毒）的IFNP诱 导并不受cGAS或Sting缺失的影响。将cGAMP递送进细胞质在cGas /细胞而不是Stinggt/ gt细胞中恢复IFNP的诱导。类似地，经DNA病毒的趋化因子CXCL10的诱导依赖于cGas和 Sting。IRF3二聚化的测量表明，cGas 7细胞不能响应HT-DNA的转染或WT HSV1或HSV1 病毒株7134(其也缺乏干扰素拮抗剂ICP0(16))的感染以激活IRF3。cGas缺陷并不影响 经仙台病毒的IRF3的激活。因此，在小鼠肺成纤维细胞中，经DNA病毒而不是RNA病毒的 IRF3的激活和细胞因子的诱导需要cGAS。
[0208] 来自cGas 7和Stinggt/gt小鼠的BMDM在响应HT-DNA或ISD的转染产生IFN0方面 有缺陷。类似地，经VACV和HSV1病毒株dl09和7134的IFN 0的诱导在cGas 7和Stinggt/ gt BMDM中大部分被去除。然而，经WT HSV1的IFN0的诱导cGas '或Stinggt/gt BMDM中被 严重地但未彻底地阻断，这表明这些细胞具有另一种通路，其能部分补偿cGAS-STING通路 的损失以检测WT HSV1感染。BMDM中cGAS或STING的缺失不影响经仙台病毒的IFNI3诱 导。动力学实验表明，在整个刺激时间过程中cGas / BMDM中的经ISD和HSVl-dl09的IFN 0 诱导被去除。与IFN 0类似，经HT-DNA或ISD的TNF a的诱导在cGas 7或Sting gt/gt BMDM 中被去除。q-RT-PCR分析表明，经HT-DNA或ISD的转染或HSVl_dl09的感染的IFNf3、白 细胞介素_6(IL6)和CXCL10RNA的诱导完全依赖于cGas和Sting。相比之下，经聚[I :C] 或仙台病毒诱导的这些细胞因子的RNA水平不受cGas或Sting缺失的影响。
[0209] 本发明人通过在包含GM-CSF和Flt3配体（Flt3L)的条件培养基中培养骨髓分别 获得常规的树突细胞（cDC)和浆细胞样树突细胞（pDC)。来自cGas /和Stinggt/gt小鼠的 包含大量cDC的GM-CSF DC不能响应HT-DNA或ISD的转染以诱导IFN a或IFN0。GM-CSF DC中cGAS或STING的缺失去除了经HSVl-dl09和VACV的IFN 0的诱导，部分抑制了经WT HSV1的IFNP的诱导。相比之下，cGAS或STING的缺陷并不损害经仙台病毒的IFNa或 IFN0的诱导。q-RT-PCR实验进一步证实了，cGAS和STING对于经HT-DNA或ISD的转染 或HSVl-dl09的感染的IFNf3、IL6和CXCL10RNA的诱导是必要的，而经聚[I :C]或仙台病 毒的这些细胞因子的诱导不依赖于cGAS或STING。
[0210] 已知pDC表达TLR9,其负责经合成的包含硫代磷酸酯键的CpG DNA诱导I型干扰 素（17)。当在存在或缺失脂质体（Lipofectamine 2000)的情况下使用CpG DNA刺激包含 大量的pDC的FU3L-DC时，其甚至在cGas /和Stinggt/gt细胞中诱导IFNa和IFN0的稳 定产生。相比之下，其它形式的DNA，包括ISD、聚[dA :dT]和来自大肠杆菌和霍乱弧菌的基 因组DNA，在FU3L-DC中仅在脂质体存在的情况下诱导IFN a，且这种经各个DNA的诱导在 缺失cGAS或STING的情况下被去除。pDC中经聚[dA :dT]的IFN a的诱导强烈依赖于CGAS 和STING，这表明在这些细胞中cGAS-STING通路而不是Pol-III-RIG-I通路在传感DNA方 面发挥了主要作用。来自cGas /和Sting gt/gt小鼠的FU3L-DC响应经仙台病毒而非HSV1 的感染诱导IFN a和IFN 0。总之，这些结果证明，cGAS在树突细胞中负责检测天然DNA (例 如，细菌DNA)和DNA病毒感染。
[0211] 为了确定cGAS在抗DNA病毒的体内免疫防御中的作用，本发明人用HSV1经静 脉内（i. v)途径感染WT和cGas /小鼠。ELISA分析表明，WT小鼠的血清中包含升高水平 的IFNa和IFN0，其分别在HSV1感染（IX 107pfu/小鼠）后8小时和4小时达到峰值。 IFNa和IFNP的水平在由相同感染剂量的HSV1感染的cGa?小鼠中严重降低。在一个 独立实验中，其中以1 X 106pfu/小鼠的感染剂量用HSV1感染后监视小鼠的生存率，五分之 四的cGas /小鼠在病毒感染后3天发展出共济失调和麻痹，并在这些症状出现后数小时死 亡。五分之一的cGas 7小鼠在感染后第4天死亡。五分之三的WT小鼠在第6天发展出这 些症状并在不久后死亡。在感染后第3天提取WT和cGas /小鼠的脑部以测量病毒滴度，在 所有5只cGas /小鼠中都检测出高水平的HSV1，而没有WT小鼠在脑部具有可检测水平的 HSV1。在HSV1的感染剂量增加至每只小鼠lX10 7pfu的独立实验中观察到了类似的存活 曲线和类似的脑部的病毒滴度。cGas /小鼠对HSV1感染的易感性与Sting gt/gt小鼠相似， Stinggt/gt小鼠也在血清中具有显著降低的IFNa和IFN0，并且在HSV1感染后3-4天内死 亡（18)。
[0212] 本发明人的结果是，在多种细胞类型（包括抗原呈递细胞）中，cGAS对于经细胞 质DNA的I型干扰素的诱导是必要的，这表明cGAS产物（2' 3' cGAMP)可用于取代DNA的免 疫刺激效应，这包括DNA疫苗的佐剂效应（19)。为了确定2' 3' cGAMP的佐剂效应，本发明 人通过肌内（i. m)途径在缺失或存在2'3'cGAMP的情况下将模型蛋白抗原卵白蛋白（0VA) 注射进WT或Stinggt/gVj、鼠中。用相同的抗原制剂在第10天对小鼠进行一次强化。ELISA 分析表明，2' 3' cGAMP在WT中于第17天强烈增强了 OVA特异性抗体的产生，而在Stinggt/ gt小鼠中则没有。在I型干扰素受体缺陷小鼠（Ifnar 〇中也未观察到2' 3' cGAMP的这种 佐剂效应。为了研究2' 3' cGAMP对T细胞激活的影响，将分离自WT小鼠的脾白细胞（其已 被0VA或0VA+2' 3' cGAMP免疫7天）与0VA肽（已知通过II类MHC分子14%激CD4T细 胞）或另一种0VA肽（通过I类MHC分子H-2K%lj激⑶8T细胞）培养。用0VA+2' 3' cGAMP 免疫的（而不是仅用OVA免疫的）小鼠的CD4和CD8T细胞在用同源肽刺激后产生升高水平 的IFNy和IL-2。使用由与H-2K b复合的0VA肽组成的四聚体的流式细胞分析显示，在用 0VA+2' 3' cGAMP免疫的小鼠中，四聚体阳性⑶8T细胞的百分比显著增加，这表明2' 3' cGAMP 刺激带有OVA特异性T细胞受体的⑶8T细胞的扩增。总之，这些结果表明，2' 3' cGAMP的功 能为免疫佐剂，以刺激抗原特异性T细胞和B细胞应答。
[0213] 本文中，本发明人提供了证据，即cGAS对于经DNA转染和DNA病毒感染的I型干 扰素和其它炎性细胞因子的诱导是必要的。除聚[dA:dT]和CpG DNA之外，大多数DNA分 子，尤其是那些天然存在的（例如，细菌和病毒DNA)，其排他性地通过cGAS-cGAMP-STING通 路刺激I型干扰素。在多种细胞类型（包括成纤维细胞、巨噬细胞和树突细胞）中，经牛痘 病毒和数株HSV1的I型干扰素的诱导完全依赖于cGAS和STING。然而，值得注意的是，经 野生型HSV1的IFN0的诱导在来自cGas 7或Stinggt/gt小鼠的BMDM和GM-CSF DC中被严 重地但未彻底地去除。其它假定的DNA传感器如IFI16或DDX41，可能也参与经WT HSV1的 IFNI3的剩余的诱导（20,21)。在cGAS的情况下，cGas /小鼠的表型与Sting /小鼠极其 相似（此研究和参考文献18)。这些结果以及本发明人的示出了 cGAS是由其结合到一般 DNA所激活的细胞质酶（2, 3)的生化数据正式证明了 cGAS是激活STING的非冗余的且常规 的细胞质DNA传感器。
[0214] 本发明人示出了，2' 3' cGAMP是增强抗原特异性抗体和T细胞应答的产生的有效 佐剂。虽然细菌第二信使环二GMP和环二AMP正被开发为潜在的疫苗佐剂（22)，2' 3' cGAMP 是与任何的细菌环二核苷酸相比更加强力的STING配体（7)。因此，2'3'cGAMP为下一代预 防或治疗人类疾病（包括感染性疾病和癌症）的疫苗提供了有用的佐剂。
[0215] 参考文献和注释
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【主权项】
1. 一种包含预定量的环-GMP-AMP (cGAMP)的组合物。2. 如权利要求1所述的组合物，其中cGAMP是2' 3' -cGAMP、2' 2-cGAMP、3' 2' -cGAMP或 3, 3,-GAMP03. 如权利要求1所述的组合物，其中cGAMP是2' 3' -cGAMP。4. 权利要求1所述的组合物，其基本上不含其它的环二核苷酸。5. -种包含权利要求1所述的组合物的佐剂。6. -种包含预定的抗原和权利要求1所述的组合物的疫苗。7. 如权利要求6所述的疫苗，其中抗原对靶病原体具有选择性。8. -种诱导或促进免疫应答的方法，其包括向有需要的哺乳动物施用有效量的权利要 求1所述的组合物。9. 如权利要求8所述的方法，其中施用是经黏膜（舌下或鼻内）给药、肌肉内给药或皮 下给药。10. -种抑制环-GMP-AMP合酶（cGAS)或抑制cGAS结合到底物或辅助因子的方法，其 包括： (a) 用有效量的外源cGAS抑制剂接触细胞或细胞提取物，并检测所获得的合酶的抑 制；或 (b) 用有效量的外源cGAS抑制剂接触所确定的有需要的细胞；或 (c) 在抑制剂抑制了 ATP和GTP到环-GMP-AMP和无机焦磷酸的合酶催化转化的条件下 将包括合酶、ATP、GTP的混合物与抑制剂接触，并检测所获得的合酶的抑制；或 (d) 在抑制剂抑制合酶与底物或辅因子的结合的条件下将包括合酶和ATP或GTP底物 或DNA辅因子的混合物与抑制剂接触，并检测所获得的结合的抑制。11. 如权利要求10的（a)、（b)或（c)所述的方法，其中 (i) 通过由二聚化或核转位、干扰素产生或NF- K B激活所测量的环-GMP-AMP诱导的 IRF3激活来推理性检测所获得的抑制； (ii) 方法包括向确定有需求的且包含所述细胞的哺乳动物施用抑制剂； (iii) 抑制剂是cGAS-特异性shRNA或siRNA ;和/或 (iv) 混合物进一步包括DNA且转化是DNA-依赖的。12. -种制备权利要求1所述的环-GMP-AMP (cGAMP)的方法，其包括在合酶催化从ATP 和GTP至cGAMP的转化的条件下，形成包括环-GMP-AMP合酶（cGAS)、ATP和GTP的混合物， 其中合酶、ATP和GTP是预定量的，或者方法进一步包括分离或检测所获得的cGAMP的步骤。13. 如权利要求12所述的方法，其中混合物进一步包含DNA且转化是DNA-依赖的。14. 一种用于检测cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突变的方法，其包括以下步骤： 检测来自人的样品中的cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突变，并基于cGAMP水平、cGAS 水平或cGAS突变向人分配自身免疫性疾病度量；和 任选地，向人施用用于自身免疫性疾病的疗法。15. 如权利要求14所述的方法，其中cGAMP是2' 3' -cGAMP。
【专利摘要】环-GMP-AMP合酶(cGAS)和包括2ˊ3-cGAMP、2ˊ2-cGAMP、3ˊ2ˊ-cGAMP和3ˊ3ˊ-GAMP的环-GMP-AMP(cGAMP)用于药物制剂(包括疫苗佐剂)、药物筛选、疗法和诊断。
【IPC分类】A61P37/00, A61K48/00
【公开号】CN105120902
【申请号】CN201380073220
【发明人】志建·陈, 丽君·孙, 嘉西·吴, 和平·史, 绰·陈
【申请人】得克萨斯州立大学董事会
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2013年12月16日
【公告号】CA2895175A1, EP2934598A1, US20150343056, WO2014099824A1