构象重排
[0116] 本发明人以C2空间群共结晶了 STING的C末端结构域（CTD)(残基139-379)与 纯化的cGAS产物。使用apo-STING结构（PDB代码：4F9E)作为搜索模型通过分子置换解 析复合体的结构并精化（refined)到丨.88 A的分辨率（表Ml)。在晶体不对称单位中存在 一个 STING 原聚体，其与另一个以晶体二重对称（crystallographic two-fold symmetry) 相关联的原聚体形成蝴蝶状二聚体。结合的cGAMP分子位于二重轴上（详见下文）。STING 的有序区域（从Asnl52至Glu336)采用了类似于apo-STING的整体结构，其特点在于被4 个a螺旋包围着中心扭曲折叠。然而，与cGAMP复合的STING在单体结构和二聚体排列 中显示出与apo-STING具有数个显著的差异。与apo-二聚体相比，复合体结构的二聚体中 的2个原聚体相对于cGAMP结合位点实质上进行了向内旋转。这一更紧密的排列在2个原 聚体之间产生了更深的口袋以接纳cGAMP。此外，cGAMP结合位点被4股反平行0折叠的 盖和由2个原聚体中的每一个的残基219-249所形成的连接环所覆盖。相比之下，apo-结 构中的这一区段很大程度上是无序的（Ouyang等人，2012 ;Yin等人，2012)。0片层的形 成不归因于晶体包装（crystallographic packing)。在盖内的域间相互作用涉及数对极性 接触：在Tyr245的侧基和Gly234的主链羰基氧原子之间，在Ser243的侧基和Lys236的主 链酰胺氮原子之间以及在Asp237和Lys224的侧基之间。
[0117] 2' 3' -cGAMP和STING之间的广泛的相互作用是其特异性和高亲和性结合的基础
[0118] 由于晶体二重轴穿过不对称的2' 3' -cGAMP分子，cGAMP必须采用与二重对称性相 关的两个取向。这与下述事实一致，STING二聚体中的2个原聚体预期具有相同的与鸟苷 (guanidine)或腺苷部分相互作用的概率。因此，本发明人为cGAMP和数个周边氨基酸残 基分配了 2个具有0.5占据（occupancy)的可选构象。精细结构的模拟退火省略图显示了 cGAMP的合适（decent)密度。2'3'-cGAMP (而不是其它的亚型）很好地匹配电子密度图。 与结合STING的c-二-GMP相比，cGAMP在STING二聚交界之间的缝隙中深了约2,5人。此 外，蝴蝶的两翼在STING :cGAMP结构中相互近了约20人，这是由于2个STING原聚体的排 列更接近。cGAMP结合口袋的进一步分析表明cGAMP很好地受广泛的极性和疏水相互作用 协调。cGAMP嘌呤碱基的环堆积于4个周围的芳香族残基（2个原聚体中的每一个的Tyr240 和Tyrl67)。值得注意的是，cGAMP的2个a -磷酸基团从2个原聚体接触Arg238以及从 1个原聚体接触Arg232。GMP的游离3' -OH指向来自口袋下部的2个Serl62残基。鸟嘌呤 碱基直接与Glu260和Thr263的侧基以及Val239的主链羰基氧相互作用。这些独特的极 性接触解释了为什么2' 3' -cGAMP是STING的特异性和高亲和性配体。此外，来自0 -折叠 的残基（Arg232、Arg238、Val239,其参与cGAMP结合）有可能控制盖的形成及STING的进 一步激活。
[0119] STING的精氨酸232对于细胞质DNA信号通路是重要的
[0120] 结合环-二-GMP的STING的晶体结构的三个先前的报道中使用了稀有的人类变 体（用组氨酸替换Arg232) (Ouyang等人，2012 ;Shu等人，2012 ;Yin等人，2012)。来自人类 群体的DNA的广泛测序表明，Arg232等位基因是普遍的，因此，应考虑为野生型STING (Jin 等人，2011)。STING的H232变体的使用可以解释在这些研究中为什么c-二-GMP不诱 导STING的显著构象变化（Ouyang等人，2011 ;Shu等人，2011 ;Yin等人，2012)。先前的 报道显示，小鼠STING的Arg231 (相当于人类STING的Arg232)到丙氨酸的突变去除了经 环-二-GMP(而不是DNA)的IFN0诱导（Burdette等人，2011)。然而，基于本发明人的 STING-cGAMP复合体的晶体结构，Arg232到组氨酸的突变预期显著减弱了 cGAMP的结合和 经STING的下游信号，Arg232到丙氨酸的突变应该更加不利。因此，本发明人在两组实验 中研究了 STING的Arg232的功能。首先，本发明人通过RNAi敲降了 L929细胞中的内源性 STING并用人类STING的WT、R232A或R232H将其取代。用HT-DNA转染或用2' 3' -cGAMP处 理这些稳定的细胞系，然后通过q-RT-PCR测量IFN 。表达WT STING的细胞能够响应DNA 或cGAMP刺激以诱导IFNI3，而那些表达R232A或R232H的则存在缺陷。作为对照，双链RNA 类似物聚[I :C]在所有这些细胞系中都刺激IFNP的表达。其次，本发明人在HEK293T细 胞（其检测不到内源性STING和cGAS的表达）（Sun等人，2013)中稳定表达WT STING或突 变体STING。然后用人类cGAS表达质粒转染细胞，再测量IFNP的RNA。WT STING(而不是 R232A突变体）能经cGAS支持IFNP的诱导。R232H突变体是部分缺陷的，这可能是由于 带正电荷的组氨酸可能微弱地取代了 Arg232的一些功能。MAVS(RIG-I通路的重要衔接蛋 白（Seth等人，2005))能够在所有这些细胞系中诱导IFNP。总之，本发明人的结构和功能 数据强烈表明，Arg232在STING的功能中发挥重要作用，并进一步强调了 cGAS作为不可或 缺的细胞质DNA传感器的作用。
[0121] 讨论
[0122] 本发明人以前的研究鉴定cGAS为细胞质DNA传感器和使用ATP和GTP作为底物 合成cGAMP的环化酶（Sun等人，2013 ;Wu等人，2013)。然后，cGAMP作为第二信使起作用 以结合并激活STING。本文中，本发明人采用了化学合成和数个生物物理方法来进一步表 征cGAS产物的内部磷酸二酯键并确定其是2' 3'-cGAMP。随后，Gao等人报道了 apo结合 形式和DNA结合形式的cGAS的结构，其证实了 cGAS确实是DNA激活的环-GMP-AMP合酶， 其催化从ATP和GTP到cGAMP的合成（Gao等人，2013)。该巧妙的研究还阐明了 DNA结合 导致cGAS激活的结构机理。通过使用不同的方法，Gao等人还发现，截短的cGAS蛋白在体 外合成2' 3'-cGAMP。然而，他们并没有测试2' 3' -cGAMP是否具有任何的生物或生化活性， 也没有示出在哺乳动物细胞中是否产生了内源性2' 3'-cGAMP。在这一报道中，本发明人表 明，用DNA刺激小鼠和人类细胞导致了内源性2' 3' -cGAMP的产生。此外，本发明人证明了 2' 3' -cGAMP以比其它cGAMP异构体和c-二-GMP大得多的亲和力结合STING。本发明人进 一步示出2' 3' -cGAMP和其它cGAMP异构体在诱导细胞中IFN0方面比c-二-GMP强力的 多。
[0123] 对2' 3' -cGAMP的结构和功能的进一步洞察获得自结合这一内源性配体的STING CTD的晶体结构。这一晶体结构具有丨.88人的分辨率，其允许详细观察配体结构，包括 2' -5'磷酸二酯键和3' -5'磷酸二酯键二者。结构揭示了 STING上介导了 2' 3' -cGAMP的结 合的特定残基。此外，将这一结构与先前公布的apo形式的STING CTD结构相比较揭示了经 该天然配体诱导的广泛的构象重排。具体地，V形STING二聚体的2个臂移动近了约20晨， 且在配体结合的STING结构中的cGAMP结合位点上，新的4个链片层形成盖子。这些 特征不存在于先前确定的STING :c-二-GMP结构中（其使用包含R232H突变的STING变 体）。在这些结构中，c-二-GMP结合不诱导STING中的任何明显的构象重排（Ouyang等人， 2012 ;Shu 等人，2012 ;Yin 等人，2012)。然而，在包含 WT STING(Arg232)和 c-二-GMP 的另 外2个结构中，一个显示出与在STING-cGAMP复合体中所观察到的构象变化类似的构象变 化（Huang等人，2012)，另一个显示出不同的构象变化，这是由于Arg232的方向不同（Shang 等人，2012)。Huang等人所观察到的"关闭的"(cl 〇Sed)构象可能已经捕获经c-二-GMP诱 导的STING的活性状态，其能够激活STING，尽管比cGAMP更弱。
[0124] 在STING和2' 3' -cGAMP之间的广泛相互作用为它们的高亲和性结合提供了结构 基础。具体而言，Glu260、Thr263和Val239与GMP的鸟嘌呤碱基相互作用且Serl62与GMP 的游离3' -OH基团相互作用，这解释了为什么包含在GMP的2' -OH和AMP的5' -磷酸之间 的磷酸二酯键的cGAMP是高亲和性配体。此外，2个a磷酸基团与一个原聚体的Arg232 和2个原聚体的Arg238相互作用。这一结构分析解释了 R232A或R232H突变强烈削弱了 STING响应DNA或cGAMP的功能。本发明人的数据突出了在结构和功能研究中使用野生型 (Arg232) STING 的重要性。
[0125] 虽然2' 3-cGAMP以比包含其它磷酸二酯键的cGAMP异构体高得多的亲和力结合 STING，所有4个cGAMP异构体以相似的EC 5。值诱导IFN 0，其均比c-二-GMP低得多。因 此，所有cGAMP亚型都是IFNP的强诱导物。
[0126] 总之，本发明人的结果表明：1)哺乳动物细胞中所产生的响应细胞质DNA刺激的 内源性第二信使是2' 3' -cGAMP ;2) 2' 3' -cGAMP是STING的高亲和性配体；3) 2' 3' -cGAMP是 哺乳动物细胞中IFNP的强诱导物；4) 2' 3' -cGAMP诱导可能是其激活基础的STING中的构 象重排；和5)在复合体的晶体结构中所观察到的2' 3' -cGAMP和STING之间的广泛相互作 用解释了它们的特异性和高亲和性结合。
[0127] 本发明人得出结论：2' 3' -cGAMP是由哺乳动物细胞产生的内源性第二信 使；2' 3' -cGAMP是STING的高亲和性配体；2' 3' -cGAMP是I型干扰素的强诱导物；和 2' 3' -cGAMP结合诱导STING的构象变化。
[0128] 登录号
[0129] 结合人类STINGCTD结构的2'3'-cGAMP的坐标已保存于RCSB蛋白质数据库 (PDB:4KSY)。
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[0161] 表SI. cGAMP的化学合成。（A)构建模块S1-S4的结构。（B)构建模块S1的合成。 (C)构建模块 S3 的合成。（D) 2' 3' -cGAMP 的合成。（E) 2' 2' -cGAMP