GAS的残 基161-212的缺失并未显著地损害ISD的结合，这表明cGAS在N-末端包含另一个DNA结 合结构域。实际上，包含残基1-160的N末端片段也结合ISD。因此，cGAS可以在N-末端 包含两个单独的DNA结合结构域。然而，清楚地，包含残基1-212的h-cGAS的N-末端是结 合DNA所必要且充分的。
[0073] 在HEK293T-STING细胞中过表达h-cGAS的不同的缺失突变体以确定其激活IRF3 和诱导IFNP和细胞因子肿瘤坏死因子a (TNF a)的能力。蛋白片段1-382 (其缺乏包括 Mab21结构域的大部分残基的C-末端的140个残基）不能诱导IFNP或TNFa或激活IRF3， 这表明完整的Mab21结构域对于cGAS功能是重要的。如所预期的，N-末端212残基（片 段213-522)(其包括NTase结构域的一部分）的缺失去除了 cGAS活性。催化残基之前的 NTase折叠的第一螺旋内的仅仅4个氨基酸（KLKL，A 171-174)的内部缺失也摧毁了 cGAS 的活性。有趣的是，N-末端160个残基的缺失并不影响IRF3的激活或经cGAS的细胞因子 诱导。体外分析表明，此蛋白片段（161-522)仍以DNA依赖的方式激活IRF3通路。因此， h-cGAS的N-末端160个氨基酸（其一级序列在进化上并非高度保守）似乎对于DNA的结 合和经cGAS的催化是高度可有可无的。相比之下，NTase和Mab21结构域对于cGAS活性 是重要的。
[0074] cGAS主要定位于细胞质中。为了确定cGAS是否是细胞质DNA传感器，本发明人从 THP1细胞制备了细胞质和细胞核的提取物并通过免疫印迹分析了内源性h-cGAS的定位。 在细胞质提取物中检测到了 h-cGAS，而在细胞核提取物中几乎未检测到。将THP1提取物 进一步进行差速离心以将各个亚细胞器相互分离并从细胞质中分离。在S100和P100 (在 100, 000 Xg离心后的沉淀）中检测到相似量的h-cGAS，这表明此蛋白在细胞质中是可溶 的，但该蛋白的显著级分与轻（light)囊泡或细胞器相关。在P5(其包含线粒体和ER，分 别由存在VDAC和STING证明）中未检测到cGAS蛋白。也未在P20(其主要包含ER和重囊 泡）中检测到cGAS。
[0075] 本发明人还使用稳定表达Flag-m-cGAS的L929细胞通过共聚焦免疫荧光显微镜 检查了 cGAS的定位。cGAS蛋白分布于整个细胞质中，但也可以在细胞核内或细胞核周围区 域观察到。有趣的是，在细胞用Cy3标记的ISD转染2或4小时后，观察到cGAS的点状形式 且其与DNA荧光相重叠。在多于50%的所观察的细胞中都观察到了此类cGAS和Cy3-ISD 的共定位和表观聚集。这些结果以及cGAS与DNA直接结合的生化证据表明了 cGAS在细胞 质中结合DNA。
[0076] 讨论。在此实例中，本发明人开发了一种策略，其结合定量质谱与常规的蛋白纯化 以鉴定从粗细胞提取物中部分纯化的生物活性蛋白。这一策略普遍适用于因丰度非常低、 活性不稳定或起始物质稀少而难以被纯化至均质的蛋白质。作为原则的证明，本发明人使 用这一策略来鉴定小鼠蛋白E330016A19作为合成cGAMP的酶。这一发现导致鉴定出cGAS 的一个大家族，其从鱼类至人类中都是保守的，这正式地证明了脊椎动物包含进化保守的 合成环二核苷酸的酶，而其之前仅发现于细菌、古细菌和原生动物中（11-13)。霍乱弧菌能 通过其环化酶DncV (VC0179)合成cGAMP，其包含NTase结构域，但与哺乳动物cGAS缺少显 著的一级序列同源性（12)。
[0077] 本发明人的结果不仅证明了 cGAS是触发I型干扰素通路的细胞质DNA传感 器，同时也揭示了一种免疫信号的新机制，其中cGAS产生第二信使cGAMP，其结合并激活 STING(4)，从而引发I型干扰素的产生。发现cGAS是细胞质DNA传感器极大地扩展了宿主 免疫系统所检测到的微生物库。原则上，所有能携带DNA进入宿主细胞质中的微生物，如 DNA病毒、细菌、寄生虫（例如疟疾）和逆转录病毒（例如HIV)都可以触发cGAS-STING通 路（14,15)。经cGAS的cGAMP的酶促合成为稳健且灵敏的免疫应答提供了一种信号放大的 机制。然而，经cGAS的宿主细胞质中的自身DNA的检测也可导致自身免疫性疾病，如系统 性红斑狼疮、Sj:dgren_综合征和Aicardi-Goutiferes综合征（16-18)。
[0078] 已报道了数个其它的DNA传感器如DAI、IFI16和DDX41诱导I型干扰素（19-21)。 DAI、IFI16或DDX41的过表达并未导致cGAMP的产生。本发明人还发现，经siRNA敲降DDX41 和p204(IFI16的小鼠同源物）在HT-DNA转染的L929细胞中并不抑制cGAMP活性的产生。 与其它假定的DNA传感器和大多数模式识别受体（例如TLR)不同，cGAS是能接受经小分 子化合物抑制的环化酶，其为治疗人类自身免疫性疾病提供了治疗剂。
[0079] 参考文献和注释
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[0101] 22.人类和小鼠的cGAS序列的GenBank登录号是KC294566和KC294567。
[0102] 实施例3.包含混合的磷酸二酯键的环GMP-AMP是STING的内源高亲和性配体
[0103] 微生物感染的天然免疫传感是由种系编码的模式识别受体所介导的，其包括膜蛋 白如Toll样受体（TLR)和细胞质蛋白如N0D样受体（NLR)和RIG-I样受体（RLR) (Iwasaki 和 Medzhitov, 2010 ;Ronald 和 Beutler, 2010 ;Takeuchi 和 Akira, 2010)。由于几乎所有的 感染性微生物在其生命周期中均包含并需要核酸，天然免疫系统已演化以识别微生物DNA 和RNA来作为宿主防御的核心策略。具体地，数个TLR在内涵体膜上定位，以检测内涵体内 腔中的RNA或DNA，而RLR负责检测细胞质中的病毒和细菌RNA。
[0104] 已知DNA是免疫刺激分子已一个多世纪，但至今DNA如何激活宿主免疫系统还 未被广泛研究（〇'Neill，2013)。通过TLR9检测内涵体中的DNA，其将引发I型干扰素和 炎性细胞因子的产生。当微生物或宿主DNA递送到细胞质时，其也可以通过内质网膜蛋白 STING (也称为MITA、ERIS或MPYS)诱导I型干扰素（Barber, 2011)。STING的功能为募集 并激活蛋白激酶IKK和TBK1的衔接蛋白，所述激酶依次又激活转录因子NF-kB和IRF3以 诱导干扰素和其它细胞因子。
[0105] 本发明人最近鉴定了环GMP-AMP合酶（cGAS)为激活STING的DNA传感器（Sun等 人，2013 ;Wu等人，2013)。具体地，本发明人发现cGAS在DNA存在的情况下催化从ATP和 GTP到环GMP-AMP (cGAMP)的合成。然后cGAMP发挥结合并激活STING的第二信使的作用。 虽然这些研究清楚地证实，cGAMP是哺乳动物细胞中经cGAS产生的内源性第二信使，cGAMP 中GMP和AMP之间的内部磷酸二酯键的确切性质部分并未确定，这部分是由于单独的质谱 无法在没有所有cGAMP异构体作为标准参考可用的情况下明确地区分开这些键。尽管化学 合成的包含同质的3' -5'键的cGAMP能诱导IFNP，但仍然可能的是，包含其它磷酸二酯键 的cGAMP也可能激活STING通路。
[0106] 在这一研究中，本发明人进一步通过化学和生物物理学技术的组合来研究cGAMP 的结构。本发明人发现，由cGAS产生的cGAMP在GMP的2' -OH和AMP的5' -磷酸之间包含 磷酸二酯键且在AMP的3' -OH和GMP的5' -磷酸之间包含另一个磷酸二酯键。本发明人进 一步发现，这一分子（本文中称为2' 3' -cGAMP)在哺乳动物细胞中产生，以响应细胞质中的 DNA。此外，本发明人证明了 2' 3' -cGAMP以高亲和力结合STING并且是干扰素0 (IFNP )的 强诱导物。本发明人还解析了结合到cGAS产物的STING的晶体结构并观察到2' 3' -cGAMP 和STING之间的广泛的相互作用，其为它们的特异性和高亲和结合提供了结构基础。重要 的是，STING-cGAMP复合体的结构揭示了在STING激活时，此天然配体诱导了 STING中的构 象重排。
[0107] cGAS的产物是包含混合的磷酸二酯键的环GMP-AMP
[0108] 已知在核苷酸之间天然存在着2' -5'和3' -5'磷酸二酯键，而2' -5'键则不常见。 由cGAS产生的天然cGAMP的内部磷酸二酯键仍有待确定。因此，本发明人化学合成了包 含所有四种可能的磷酸二酯键的cGAMP分子（表S1)。使用修改自已出版方法（Gaffney 等人，2010 ;Zhang等人，2006)的方法进行cGAMP同种型的化学合成。简明起见，本发明 人按形成磷酸二酯键的GMP的0H位置接AMP的0H位置来命名这些cGAMP分子；例如， 2' 3' -cGAMP包含在GMP的2' -OH和AMP的5' -磷酸之间的磷酸二酯键和在AMP的3' -OH和 GMP的5' -磷酸之间的另一个磷酸二酯键。本发明人还使用纯化的cGAS蛋白在DNA存在 的情况下从ATP和GTP酶促合成天然的cGAMP (Sun等人，2013)。通过核磁共振（NMR)谱分 析纯化的cGAS产物和合成的cGAMP异构体。引人注意的是，cGAS产物的虫NMR谱与合成 的2'3'-cGAMP的 1H NMR谱相同，但与其它cGAMP异构体不同。具体而言，异头质子（H1'） 与具有3' -磷酸的单峰，和具有2' -磷酸的双峰。一致的是，仅有2'，3' -cGAMP的磷酸盐具 有与天然cGAMP的磷酸盐相同的31P NMR化学位移。本发明人还使用Q-Exactive (具有高 分辨率和质量准确度的仪器）进行了天然的和合成的cGAMP的质谱分析。每个单电荷分子 的总质量（[M+H] +)是675. 107,其精确匹配了 cGAMP的理论质量。cGAS产物（使用较高能 量碰撞解离（HCD)使其片段化）的串联质谱（MS/MS)与合成的2'3'-cGAMP的串联质谱相 同，与2' 2' -cGAMP和3' 3' -cGAMP的串联质谱相似但不相同。3' 2' -cGAMP的MS/MS谱似乎 与2' 3' -cGAMP和cGAS产物的谱最为不同。反相HPLC分析表明，天然cGAMP与2' 3' -cGAMP 共洗脱，但不与其它cGAMP分子共洗脱。本发明人还通过圆二色谱（⑶）确定了 cGAS产物 的构象，证实了其衍生自D-核糖。天然的cGAMP的⑶谱与2' 3' -cGAMP的⑶谱很好地重 叠。近-UV CD谱表明，4个cGAMP采用了显著不同的构象，2' 3' -cGAMP和2' 2' -cGAMP形成 的⑶条带图案与3' 2' -cGAMP和3' 3' -cGAMP所形成的不同。总之，这些结果提供了 cGAS 在体外合成2' 3' -cGAMP的明确证据。
[0109] 在DNA转染的细胞中产生的内源性cGAMP包含混合的磷酸二酯键
[0110] 为了测试哺乳动物细胞是否能够产生包含混合的磷酸二酯键的内源性cGAMP，本 发明人用鲱鱼精巢DNA (HT-DNA)转染了小鼠细胞系L929和人单核细胞THP1，然后将细胞裂 解物在95°C加热以变性蛋白，并制备上清液以通过质谱分析内源性cGAMP (Wu等人，2013)。 来自两种细胞系的内源性分子的MS/MS谱与cGAS产物和2' 3' -cGAMP的MS/MS谱相同，这 表明内源性第二信使是2' 3' -cGAMP。
[0111] 2' 3' -cGAMP是STING的高亲和性配体
[0112] 本发明人进行了等温滴定量热法实验以测量STING结合到天然的和合成的cGAMP 的亲和力（K d)。在大肠杆菌中表达包含人类STING(其在之前被被证明介导与细菌第二信 使环二-GMP 的结合（Burdette 等人，2011 ;Huang 等人，2012 ;0uyang 等人，2012 ;Shang 等 人，2012 ;Shu等人，2012 ;Yin等人，2012))的残基139-379的C端结构域（CTD)并纯化 至表观同质性，以用于ITC实验。与之前的报道一致，本发明人发现，c-二-GMP以1. 21 y M 的Kd结合STING。有趣的是，天然的cGAMP和合成的2' 3' -cGAMP均以如此高的亲和力结合 STING，使得曲线拟合是困难的。此外，与c-二-GMP的结合（其是一个放热过程）不同，天 然的cGAMP和2' 3' -cGAMP与STING的结合是吸热的，这表明能量可能用于STING的构象变 化（见下文）。为了获得天然的和合成的2' 3' -cGAMP对STING的Kd，本发明人滴定了不同 量的此类化合物，以作为进入STING-c-二-GMP复合体的竞争物。这些测量获得的cGAS产 物的1为4. 59nM，2' 3' -cGAMP的K 3. 79nM。对3' 2' -cGAMP也进行了竞争实验，这是由 于其与STING的结合产生了小的热量变化。这一化合物以1. 61 yM的Kd结合STING。将 2' 2' -cGAMP和3' 3' -cGAMP直接滴定至STING并计算1值分别为287nM和1. 04 y M。因此， 2' 3' -cGAMP 的心比 c-二-GMP、3' 2' -cGAMP 和 3' 3' -cGAMP 低约 300 倍，比 2' 2' -cGAMP 低 约75倍。
[0113] cGAMP是I型干扰素的强诱导物
[0114] 本发明人递送了不同量的cGAMP异构体以及c-二-GMP进L929细胞并通过 q-RT-PCR测量IFN0的诱导。cGAMP分子诱导IFN0的EC5。的范围是从15nM至42nM，而 c-二-GMP具有大于500nM的EC5。。因此，似乎不同的环二核苷酸的结合亲和性在基于细胞 的分析中不能与其EC 5。具有很好的相关性。这一点的原因并不明确，但可能的是，不同的化 合物在细胞中具有不同的稳定性或分布。无论如何，这些实验提供了直接的证据表明，cGAS 产物、2' 3' -cGAMP是STING在细胞中的高亲和性配体（Kd:~4nM)且是IFNf3的强诱导物 (EC 5Q:~20nM)。
[0115] STING-cGAMP复合体的晶体结构揭示了 STING的配体诱导的