1.一种鸡干扰素λ与α融合蛋白,其特征在于:鸡干扰素λ与α基因以同一载体在大肠杆菌中通过互补疏水性柔性氨基酸接头融合表达而成,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的鸡干扰素λ与α的融合蛋白,其特征在于:通过以下步骤所制而成:
A、引物设计
根据Genbank提供的鸡IFN-λ的基因序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)与IFN-α的基因序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示),通过SignalP预测并除去信号肽,设计两对引物,分别在上下游插入EcoR1与Hind3两个酶切位点,为IFN-λ-F,IFN-λ-R1,IFN-α-F1,IFN-α-R。然后分别在IFN-λ的下游以及IFN-α上游设计2个含有互补疏水性柔性氨基酸接头的引物IFN-λ-R2与IFN-α-F2。序列如下:
IFN-λ-F的序列如SEQ ID NO:4所示;
CCGGAATTCCAGGTCACCCCGAAGAA
IFN-λ-R1的序列如SEQ ID NO:5所示;
CCCAAGCTTCTAAGTGCAATCCTCGCGCTGGGC
IFN-λ-R2的序列如SEQ ID NO:6所示;
CTCCGCTACCGCCTCCACCAGAGCCTCCTCCACCAGTGCAATCCTCGCGCTGGGC
IFN-α-F1的序列如SEQ ID NO:7所示;CCGGAATTCTGCAACCACCTTC
IFN-α-F2的序列如SEQ ID NO:8所示;
TCTGGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGGTCGTGCAACCACCTTC
IFN-α-R的序列如SEQ ID NO:9所示;
CCCAAGCTTCTAAGTGCGCGTGTTGCC
B、基因克隆与鉴定
用SPF鸡胚自制鸡胚成纤维(CEF)细胞,使用新城疫GM毒株攻毒后,抽提RNA,经反转得到扩增鸡IFN-λ与IFN-α基因的模板cDNA,使用IFN-λ-F,IFN-λ-R1,IFN-α-F1,IFN-α-R引物扩增出鸡IFN-λ与IFN-α去信号肽的基因片段。
接下来用SOE-PCR方法将鸡IFN-λ与IFN-α基因融合:第一步,分别用IFN-λ-F,IFN-λ-R2与IFN-α-F2,IFN-α-R引物扩增出含有linker的两个基因片段;第二步,以第一步胶回收产物为模板,不加引物,PCR扩增10-15个循环;第三步,以第二步PCR产物为模板,用IFN-λ-F和IFN-α-R扩增PCR,得到的产物即chIFN-λ+α基因片段。
C、一种鸡IFN-λ与IFN-α融合蛋白原核表达载体的构建
将chIFN-λ+α融合基因连接至pMD-19T载体,16℃连接4h以上,转化至含氨苄琼脂平板,挑取单克隆菌放入LB培养基中摇菌,菌液PCR鉴定出阳性克隆,测序正确后扩大培养,提取质粒pMD-19T-chIFN-λ+α。
分别将pMD-19T-chIFN-λ+α与pET32a空载体用EcoR1与Hind3快切酶双酶切,胶回收后用T4连接酶,常温连接30min以上,转化至含氨苄琼脂平板,挑取单克隆菌放入LB培养基中摇菌,菌液PCR鉴定出阳性克隆,测序正确后扩大培养,提取重组质粒pET32a-chIFN-λ+α。
3.权利要求1或2所述的鸡干扰素λ与α的融合蛋白制备鸡的抗病毒药物方面的应用。